Новые питательные основы и среды для возбудителя чумы Шеремет, Олег Васильевич

Введение к работе

Актуальность проблемы. При решении многих вопросов, связанных с бантернлми чумн, возникает погребиссїь в взращивании клеток на питательных средах. Однако используемые в протипочушой практике сроды и методические подходы к культивированию бакге- . рий уяв но удовлетворяют возросший к ним требованиям и часто являются тормозом в развитии исследований в микробиологии, физиологии, биохимии, иолзкулярной биологии, генетике чумного микроба.

Проблема конструирования новых питательных срзд для возбудителей особе опасных инфекций возникла достаточно давно, и над о реаением работали шогиэ исследователя. Больной вклад в этом направлении бил внесен иколои, создмгной н руководимой профессором В.Н.Инлвтикш (В.Н.ІІилптин, Н.Ф.Касатянн, І97Е; В.И.Мюпотин с ео&вт., 1975; В.НДкгаотин с сотр., 1982; В.А.Копылэа и др., 19Ш)„ Ныли разработаны эффективные сроды ддя туляремийного, бруцеллезного, сибиреязвенного микробов, холерного вибриона (ВД.Копшюв с соавт,, IS88; В.Н.Милютии с сотр., 1088; Е.В.Рож-ков, В«,В.Лобанов, І93Й; В.А.Кспыяов и др., 1990; М.И.Богданова с соавт., 1990), и серьезное внимание обращено на необходимость разработки новкх и совершенствование имеющихся питательных ерод ц методов выравнивания чумного микроба.

В настоящее время можно выделить несколько вопросов, с реализацией которых в значительно!» степени связан прогресс в области конструирования питательных сред и культивирования на них возбудителя чумы.

Преяде всего, это создание экононичвеки эффективных пята-тельных основ, изготавливаем из доступного непищевого сырья ч обладающих высокое питательней ценностью для чумного микроба.

Располагал набором подобных препаратов, появляется возможность с гораздо большей результативность» осуществлять конструирование питательных срзд различного назначения для возбудителя чумы.

Успех в борьбе с чумнсй инфекцией во многом определяется своевременной диагностикой заболевания, которая, в своч> очередь, тесно связана с ло.пученивы чистой культуры возбудителя на питательных средах (И.С.Ъшхер с ссавт., 1970). В идеале, сроды, используемые длл ;?той цели, должны централизованно изготавливаться в сухом виде из доступных дешевих препаратов отечественного щюиэвоцства, быть удобными для приготовления в условиях передвижных автономных лабораторий и обеспечивать выделение бактерий чумы из смеси с посторонней микрофлорой при наличии в пробе единичных клеток чумного микроба. 9 СССР такие среды не выпускается, что не можег не отразиться на эффективности некоторых противочумных мероприятии. Поэтому еще один рспрос, который требует своего ранения, зр.ключаєтея в необходимости разработки ио-ьых, более совериекнъэс, удобных в применении и выгодных для ши-рокомасатабного изготовления сухих элективных срзд, в которых в качестве питательных основ использовались бы дешевье препараты, полученные из непищевого сырья.

Выделение чистых культур возбудителя чумн, хотя и оч-^нь важное, но далеко не единственное направление в использовании питательных срзд. Без них немыслимо решение многих проблем . микробиологии, Физиологии, биохимии, генетики, молекулярной биологии бактерий чумч. Питательные среди необходимы для реализации целого ряда биотехнологических задач. Поэтому, наряду с диагностическими средами, требуются среды кульг-изирозакия, обес-печихокше высокие показатели роста чумного микроба в интеррале

температур 28 С - 37 С, Примекг.емие в настоящее время с отой цель» питательные среду, либо из обладав? достато'ш^ми вегвтиру-юцими свойства»<и при 37 С, либо сложны в приготовлении, дороги, содержат дефицитные препараты, что свидетельствует о необходимости конструирования более доступных и эффективных сред для культивирования возбудителя чумы.

Макроколекулярный, анютентіЯ спекчр, активность многих ферментов н ферментных систем чум«ого мікроба в большой степени зависит or условий инкубация клеток (В.И.Вейнблат, 1968; В.И. Вейнблаї, 1*970; Е.Э.Бахрах, В.И.Вейнблат, 1970; R.J.ZaborcUak, R.R.Brubaker, 1932 ). В связи с отим, очень ваюло управлять процессом роста популяции, чтобы получить культуру с заданными свойствами. Одним из таких способов является исяольсование на-'бора питательных сред с одинаково рысокимк вегетирующими характеристиками, но с разным компонентным составом, причём такие среды должны обеспечивать интенсивный рост возбудителя чумы как при ?.В С, так и при 37 С. Это позволит в каждом конкретном случае подбирать именно ту ореду и ту температуру, которые способствуют формировании популяций чумного микроба с необходимым спектром свойств. Следовательно, возникает потребность п конструировании набора подобных сред и в изученги влияния температуры выращивания, состава питательной среды на различные биологические показатели чумного микроба.

Настоящее исследование было направлено на решение поставленных выше вопросов.

Цель и задачи исследования. Целью явилось создэрие нових питательных основ и сред, совершенствование методов культивирования возбудителя чумы, которые обеспечили бы повыгвние эффективности диагностических исследования її экспериментальные раЯот, связанных с чумними бактериями.

Для достижения этой цели предстояло решать следующие основные задачи:

разработать из непищевого сырья питательные основы, ко-торыз можно использовать при конструировании сред для чумного микроба;

сконструировать сухув элективную питательную среду, обеспечивающую выделение бактерий чумы ча материала, загрязнённого посторонней микрофлорой и не требующуь при приготовлении взвешивания компонентов, фильтрации, корректировки рН, стерилизации авгсклавироаанйем;

разработать набор питательных сред, обладающих высокими вегетируицими свойствами при Я8 С и 37 С и отличающихся по компонентному составу}

определить условия инкубации возбудителя чумыо обеслз-чивякцие фзрдарование популяций с максимальной иммуногенностыо» вирулентностью, наиболысш содерканием фракции I, «мышиного* . токсина, V-антигенов, широким антигенным спектром.

Научная новизна. При раализациы поставленных задач:

впервые показано, что питательными основами микробиологических сред, в том числа и для возбудители чумы, могут служить разработанные нами препараты: автолизат селезёнки круп-» ного рогатого скота, гидрояизат белка пшеничных отрубай, экстракт дрожжевой очищенный сугой, фосфорнокнелотний гидрояизат дрожжей, гидролиза? бэлка подсолнечного шрота;

впервые установлена связь меаду радиальной скоростью роста колоний бактерий чумы и удельной скоростью роста культуры, что позволяло разработать простую методику определения и. чумного микроба;

сконструировано из нягисцевсго сырья деьять новых диаг-

ностических сред для возбудителя чумы и показано, что по еєгє-тирующил свойствам они превосходят агар Хоттингера;

впервые получена сухая елективная питательная среда для чумного микроба, которая не требует при приготозлении взвешивания компонентов, фильтрация, ссвеччения, корректировки pli, стерилизации автоклавированием и обеспечивает Еыделение бактерий чукы из материала, обильно обсеменённого посторонней микрофлорой;

впервые установлено, что скорость роста возбудителя чуиы, в основном, определяегся качественным составом яиіатзль-ной среды, а выход бактериальной массы зависит преимущественно от концентрации лимитирующих факторов;

впервые обнаружено, что выход микробных клеток на дрожжевой и селезёночной средах ограничивается недостатком цисте-гака, метионина, лайцина, иэолейцкна, треонина, аргинина, CaCIg, урацма, ксилозы или глюкозы, а набор лимитирущих факторов зависит от вида питательной среды, её серии, а также ауксотро-фностн штаммов;

впервые показано, что повысить выход бактериальной массы на селезёночной и дрожжевой средах можно путём уьсличения

в них концентрации лимитирующих фэнтсров, которое достигается при обогащении сред гидролкэатом белка отрубей, гидролиза-том белка подсолнечного шрота, казеиновым' гидролизатоц, переваром мяса по Хоттингеру;

разработано семь новых питательных сред, облапакних высокими регетирупщими свойствами по отношению к чумному микробу в условиях 3? С;

определены оптимальний состав питательной среды, гемпе-ратура культивирсЕапип, продплжителннсегь выращивания дли nay-

- в -

чения имц/исгенности, антигенного состава, антибиотикочувстви-тельностн, содерзшния фракции I, «мышиного" токсина, щ - антигенов чумного микроба;

впервые ьыяснено, что при 37 С наблодаэтся нарушзныа корреляции мевду процессами анаболизма и кпгаболйзка у чуша-го микроба, то приводит к интенсификации синтеза вторичных метаболитов, к числу которьк можно отнести фракдаа I, тл - антигены';

впервые установлено, что антигенный спектр возбудителя чумы зависит от состава использованной питательной среды, tea-пературы инкубации. Количество индуцибельных антигенов в 1,5 раза превышает число конститутивных;

показано, что гешературньй фактор не является безоговорочно ведущий в регуляции синтеза фракции І. Но в меньшей степени ее" продукция заву сит от состаъа питательной среди;

впервые обнаружено, что при развитии чумного микроба в чувствительном макроорганизмэ происходи? кивэлировенйз различий в содержании фракции I, которые отмечались при росте на питательных средах.

Теоретическая и практическая ценность работы. Теоретическая значимость заключается в получении данных, свидетельствующих о том, что существенный прогресс в области конструирования питательных сред различного назначения для воэСудитэля чумы связан с наличием ассортимента новых доступных и эффективных суюк питательных основ. Определены требования, которым должны отвечать среды для выделения чумного микроба. Камзчоны перспективы, обеспечивающие управление процессом роста возбудителя чумы и предложены некоторые методические подходы к их реализации.

-9-.

В результате исследораш^ составлены и утэерядеш нормативно-технические документы на' следующие раэработшшыв нами препараты:

~ автолизат селезёнки (инструкция по изготовлении и контролю, инструкция по применении);

гидролизат белка пшеничных огрубей сухой (лабораторный регламенте инструкция по применению);

гидролизат белка подсолнечного шрота суу.оіі (лабораторный регламент, инструкция по применении);

среду дрояог.звуи элективную (СДЭЧ) сухую (лабораторный регламент, инструкция по применению);

среду дяк культивирования возбудителя чули при 37 ^ЭС (ДЮ сухую (инструкция по изготовления н контролю, икструкшіл по применению).

Получено четырз авторских свидетельства на изобретения:

аьторскоз свидетельство # 860521 на питательную среду для выредивания чумного микроба;

авторское свидотельстро '( I Ой 1043 на способ получения белкового гчдролизата из подсолнечного шрота;

авторское свидетельство № IJ77966 на способ лолуч'ения белка иа отрубей;

авторское свидетельство \* 1222676 на способ получения питательной основы микробиологических ерзд.

Внедрение результатов исследования:

- автолизат еэлеэёнки испытан с положитепьным результа
том в CGCF, Болгарии, Швеции. Іюдучено разрешение КйС МЗ СССР
на внедрение автолжзата езлезёнки к практику здрйЕОохрададия.
Заключён договор о научно-техническом сотрудничестве ме\ду

Ростовским прогивочушш институтом (РЛЧИ) и Институтом заразных и паразитарных болезней (София, Болгария), предусматривающий организации производства препарата. Нахажен лабораторный выпуск автолизата в Я1ЧИ|

гидролизах белка отрубей, гндролизат белка подсолнечного шрота применяется в Ростовском противочумном института е. «елью выращивания возбудителей особо опасных инфекций. Каяаха-но лабораторное изготавлзние препаратов г

среда СДЭЧ испытана в яротивочушюс организациях СССР, а также в институте ДЛастера (Вьетнам) в получила аысохув оценку. Решением Государственно!! меяведомствандай кошсскн она рекомендована для внедрения в практику здравоогранешш. Срдда отменена серебряной мэдяяьп ВДНХ. Налажнио лабораторное изготв-ление СДЭЧ в ЯІЧИ;

среды для культивирования возбудителя чуш при 37 С испытаны в модчгдикскях учрездйяиях СССР, Болгарки _v Ч02Р и используются з.Ростовском противочумном институте при выполнении плановой научной тематики.

Апробация работы. Материалы работу докладывались: на Всесоюзной конференции ^Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии*^ Махачкала, 1988 г.; на Зсесошном совещании «Питательные среды в производстве бактериальных препаратов" Сболенск, Московской обл.. 1939 г.; не заседании проблемной комиссии, Москва, №Ш г,; на УП конгрессе болгарских микробиологов, Варна, Болгария, IS09 і'.; неоднократно на расширенных конференциях Ростозского-на-Дону противочумного института.

Публикация результатов исследования. Основные положения аисегргзлки огражзны с 21 печатной работе.

-'II -

*'

ІІолояекия. выносимые на'защиту :

1. В качестве питательных белковых осноз сред для чумного микроба могут служить автояиэат селезёнхи, экстракт кормовых дрожжей, гидролизат о'влка пиеничных струбвй, гидролизат подсолнечного ирота, щелочной экстракт отрубей, фесфоркоккслот-кый гидролизат кормовых дрожжей.

2. Информация, полученная при определении радиальной скорости роста колоний возбудителя чукы, позволяет достоверно оценивать удельную скорость роста культуры.

3. Диагностические питательные среды для чумного микроба, изготовленные из автолизата селезёнки, гидрожизата белка отрубей, дрожязвого экстракта, гндролиз&та белка подсолнечного зрота, щелочного экстракта отрубей, гидролизата кератосодер-нат.эго сырья, по своим ъегетируюзрш свойства»! и универсальности превосходят агар Хоттянгвра.

4. Исследование материала, подозрительного на заражённость или заражённого бактериями чумы, следует осуществлять, используя сухую дрожжевую ялэктивнуп среду (СДЭЧ).

5. Скорость роста чушого микроба определяется преимущественно качественным составом питательной среды, а вігаоп бактериальной массы зависит от нонцеьтрэлии тех компонентов, по отношению к котором чумной микроб являэтея вуксотроАом,

6. Факторами, лимитирующими выход микробных клеток епэ-будителя чумы при 37 С с дрожжевой среды и среды из автоли-эата селезёнки, являются цистекн, лейцин, чзолейыин, треонин, аргинин, урацил, Са¹"*", глюкоза, ксилоза.

7. Высоких показателей скорости роста и выхода Сактепи-альной массы чумного микроба в условиях 37 С моете дсбиты:я, используя экстракт кормовых дрожжей и азтолизат селалёыа,

оСогшцёншэ гкдролизатон белка подсолнечного шрота, пшеничшх отрубеЧ, казеиновым гидролиз&том, переваром ияса по Хоттидаеру.

8. Управление ростом возбудителя чумы возможно при наличии достоверной информации о влиянии условий выращивания на биолэ- -гичеекие свойства І.резбіз. Условия инкубации, оптимальные для накопления фракции 1„ т$ - антигенов, «мшиного" токсина чушо-го їшісробал для кзучзямя антигенного спектра возбудителя чуш_е ого ишуногенности, вирулентности, чувствительности к антибиотикам, характеризуются различными к строго определёнными параметрами (состав питательной среди, температура я продояявгеель-ность выращивания).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения, зыводое и списка яитврмурыо Она кзлоле-не. на 352 страяипах маиинолясноге гокста, содержи? 62 тайдаш и 18 рисунков* Список литературы включает 312 отечос'вешык и ІЗЬ зарубеяикх литературчых источников.

СОДЕЕШЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. Разработка из непищевого сырья питательных основ, яредказначенных для вкращирания возбудителя чумы Для обеспечении интенсивного роста чумнсго микроба питательные среды должны содержать углеводы или другие окисляемые ,клеткой веиества, зирок^мй набор аминоккслот, низкомолекулярнае пептиды, некоторые витамины, нуклеиновые кислоты, целый ряд минеральных веществ и микроэлементов (У.Т.Арыл-паева с соавт., 1980; Л.Д.Картааезг с совет., 1986; 2.Hills , Е.зрам , 1952; и.К.Иас'ои , IW3). Проще всего этот вопрос решается при использовании комплексных препаратов природного происхождения.

В качестве источника питательных веществ в средах для вы-рпливамия возбудителя чуьы предложено значительное количество

- ІЗ -

различного сырья (А,А.Трифонова,, 3954g Л.А.Тимофеева с соовт., I960; Л.А.Нартенс, 1964; Р.М.Нзчецхая е соавт,, I869 H.S.Ka-саткин с соавт., 1972), Тем на менее,, за исключением гидролиза-та мяса, большая часть препаратов широкого распространения не получила, либо из-за малой доступности, либо из-за технической или пищевой ценности, либо из-за неудовлетворительных ростовых качйств приготовленных кз них сред. Поэтому сейчас всё ещё остаётся достаточно высоким процент мясных сред среди препаратов, кспользуешх для культивирования чуидаго микроба. Такое полояэ-НК9 нельзя считать удовлетворительным,,' тая как перэзар шг-а по Хоттккгеруо едва ли„ ионяо рассматривать пая нечто уникальное н яшмющееся незаменимым источником углерода, азота, минеральных веществ.

Непкдевым сырьём, способным явиться источником питательных компонентов в кикрсбиологических средах, макет быть селезёнка крупного рогатого скота. По содержанию белка и зольных элементов она не уступает ыясу, по количеству железа, кальция, магния - значительно превосходит его.

Селезёнка шеат большое число собственных протеолитическ^г*х ферментов, основными из нстсрь'х являются катепсины (В.В.Мосоло", 1971). С нашей точки зрения, автолитическая способность селезёнки могла оказаться достаточной для получения из неё питательной основы без применения традиционных гидролиэуккцих агентов (кислот, щелочей, ферментных препаратов).

Эксперименты подтвердили ото предположение и позволили разработать препарат, характеризующийся полноценным азотизтьм, угяевг ;шл, минеральным составом (Табл.1). Технология колучвиид автолиэата селезёнки (Л.С) проста, не требует бслышх трудозатрат.

- 14 ^

В качестве ще одного перспективного сырья для питательных сред можно било рассматривать пшеничные отруби, являющиеся отходом мукомольной промышленности. Они содержат 12-16 белка,, богаты триптофаном (И.М.Ройтер с соавт., 1981), углеводами (М.С.Дудкин с соавт,, 1973), зольными элементами (Т.Д.Гуменюк, Т97&), витаминами (Н.ІІ.Кузьмина» В.Л.Кратович, I960).

^: Сведения о получения из отрубай микробиологических питательных основ в литературе отсутствуют. Это можно объяснять высок: содержанием в них углеводов и сложностями, возникающими при удалении "оисических .продуктов, образующихся в процессе гидролиса отрубей (Л.П.Коржвва, В.А.Романов, 1979$ ce.M.UschakQw*. efc al. » I9S0; Sf.D.Powrie efc ol. , 1981).

Поэтому ми сочли целесообразным разработать технологию из-влечения из пшеничных отрубей белка с относительно низкий содержанием углеводов» а затем получить из ного азотистую іита-тельнув сснову для выращивания кикрооргышэмор.

В результати был отработан метод» позволивший сконструировать из отрубей препарат, содержащий 79,8 + 3,5 беяка я 6,5+ 0,3% углеводов.

Одним из промежуточных продуктов предложенной методики является щелочкой экстракт, который оказался способным в малых дозах оказывать чыраяенное стимулиругацее действие на рост самых различных микроорганизмов. Обнаруженный эффект Сил подтверждён комиссионным* яспытанияш.

Для получения из белка гидрслизата использовали серную кислоту, что позволило в итоге разработать сухой препарат (ГБО), срдержаций Ь,9+р,Ь% амикного азота, 34,0-0,2 биуретовых продуктов представленні» пептидами с молекулярной массой от 160-900

следы 1,59

- 16 ~

даяьтон и являгшимися в основном ди- и трипептидЕми. В состав гидролнзата входят нуклеиновые кислоты, углеводы (ТаблЛ).

Большой кигорэо в качестве источника питательных веществ для возбудителя чумы представляют также кормовые дролжи. Ода выпускаются з промнвлекном масштабе, характеризуются полноценным химическим составом Ш.Й.Коротченко с соавт., 1966; П.Е.Ладан с соавт., 1972) к уже нашій применение при выращивании раз» личных мякрооргшзмов (Г.К.Скрябин с соазг., 1965; Е.Г.Бориоен-ко, 1967; Л,Г.Бендас, IS7I» З.М.Андреева, Н.И.ГридневЕ₀ Iv/5jj В.К.Голдшмид, Р.Г.Ряполова, IS80; нЛі,Гриднеза, Л,С.Пономарёва,

mm).

Паи удалось разработать из кормовых дрояжой две гогеатвдь~ ныв осксвы: эистраку дрожжевой очиценный сухой (ЭДОС) и фосфор-нокислотный гидролизаі №).

Препарата содержат? все основные компоненты» необходимые для развития чумного микроба, -причём азотистые вещества в ЭДОС представлены в основном аминокислотами к нязкомолекулярвыда: пеігекдакн, а в ФГ преямущестеешю пептидами с высокой молекулярной массой (Табл.1). Налажено лабораторное изготовление дрожжевых основ.

К числу перспективного сырья для питательных сред можно отнести я подсолнечный шрот, являющийся продуктом переработки семян подсолнечника. Б шроге присутствуют до 50$ белка, 2Л% безазотистых веществ (Е.Ю.Яарюшкина с соавт., 1972). Однако наличие в годсолначном ироте соединений, обладающих бактериоста-тичестшм эффектом (феколкарбоновыо кислота), не позволяет использовать его непосредственно для получения гидролиэатоз. Поэтому пгедсте.влялось целесообразным разработать вначале технологию

извлечения из подсолнечного шрота белка, лишённого і^енолкьрбо-ноеьос кислот, а затеи подобрать оптимальный режим изготовления из балка гидролиз ата.

В результате была предложена методика, обеспечивающая получение сухой питательной основы, представляющей, по существу, евлшокислотно-пепгядный концентрат с ношением небольсого количества зольных элементов, углеводов и нуклеиновых кислот. Фенолкарбоновые кислоты в гкдролизате белка подсолнечного шрота (ГШШ) отсутствуют. В нзц обнарузашавтея в свободном состоянии практически все необходимые для роста возбудителя чумы аминокислоты (ТаблЛ).

Такиы образом, сконструированы новые препараты, которые могу* использоваться в качестве питательных белковых осноь для чумного микроба: автолизат селезёнки, гидролизат белка пшеничных отрубейц экстракт кормових дрояжен, фосфорнокислотный гидролизат дрожжей, гидролиэат белка подсолнечного шрота. Разработанные питательные основы изготавливаются в сухом вида, технология приготовления их достаточно проста и легко может быть воиспроизведена в промышленных масштабах. По своей экономической эффективности препараты превосходят существующие аналоги.

Новые основы были использованы при конструировании различных питательных сред для возбудителя чумы.

ГЛАЗА 2. Конструирование питательных сред для лабораторной диагностики чумы

Анализ литературы позволил прийти к выводу, что повисить эффективность диагностики чумы можно при использовании питательных сред, отвечающих следующим требованиям: они должны

обеспечивать высокую удельную скорость рома культуры, обладать высокой чувствительное?^ к высокой выпзванкоетьк; на roix должны расти штаммы, выделенные в различных природное очагах к отличающиеся своими питательными потребностями; морфология коло-ний долзша быть -типичной для чумного микроба» скрещенные культуры должны сохракято биологические свойства, используемые для идентификации T.pectis . Среда должны обеспечивать рост возбудителя чуш при температура 28 и 37 С, изберательно угнетать рост сопутствующей микрофлоры при взделеіши чзїєзой культури чумного микроба из загрязнённого матзриааа, изготавливаться в сухом эяд$ из доступного дешевого сырья. Технология приготовления сред должна быть максимально упрощена, но содержать этапов филмфшнн, осветления, корректирооки рН и стерилизации автокяа-вировачяем.

При конструирования таких сред возникла потребность в опз-равивной оценка удельной скорости роста культуры чумного микроба} что обусловило шобзіодшость исслэдований по разработке простого способа определения/* . За основу ногой методики была принята модель» предложенная ( S.J.Pirt _t 1967). Однако она применима лишь к колониям, имеющим форму уплощённой полусферы с розным краем по границе с агаром, а особенностью колоний Т.pas-tic , выращенных на традиционных средах, является такой характерный структурный признак, как «кружевная" зона, расположенная по её окружности.

Было обнаружено, что типичные для возбудителя чума яолэ-нчи формируются при прочности агарового геля 550-680 г по прибору В&лента. При уменьшении прочности до 300 г колонии теряют характерные признаки и приобретает вид полусферы с ровным кра-

ем. Выявленная закономерность косила универсальный характер и наблюдалась на средах, приготовленных нз различных питательншс основ.

Ь последующем была установлена связь между увеличением радиуса сферических колоний чумного микроба в единицу времени и удельной сиоростью роста культуры, что подтвердило данные, полученные ( S.J.P.trfe , 1957} на других бактериальных моделях, и позволило разработать простую ызтодику для оценки и, r.pe*ti3.

Успех в конструировании диагностические сред для возбудителя чуш зо многой зависит от того, насколько верно отобраны для экспериментов препараты,, язлящиеея основным источником питания. Они должны изготавливаться в сухом вгеде из непищевого сырья, быть экономически эффективными, но давать осадка при 'растворении. Химический состав препаратов должен перекрывать известные питательные потребности чумного микроба.

Поэтому в качестве основы диагностических сред для т.pes-tla' мы испытывали автолизах селезёнки, дрожжевой экстракт, ги-дролкэат белка подсолнечного крота, гидролиза? кератосодержа-щего сырья (А.В.Гончаров с соав., 1936) и гидрслизат белка отрубей, которые отвечают всем перечислзнннм выше требованиям.

На первом ггеле отрабатывали оптимальную рецептуру среды для каждого из этих препаратов.

Максимальная скорость роста возбудители чумы наблюдалась на средах из дротокевого экстракта и атзтолкзата селезёнки. Скорость размножения бактерий на других питательна основах была существенно ниш, что, как выяснилось, связано с лимитацией ь\\-ташнг їй группы й и нуклеиновыми основаниями. Снять лимитацьо по этим компонентам удалось путём обогащения срзц минимальном

- 20 ,

количеством дрожжевого экстракта или щелочного зкстракта отрубей.

D результате было сконструировано девять диагностических питательных сред для T.pestis (ДЭ_>ПЭД_>ПЭО,0ЭД,0Э0, КЭД,КЭ0,АС, АСЭД). Всэ онк обеспечивали в условиях 2д С рост чумного шк» роба при посевной дозе 10 м.кл. с покаэателзм прорастания 5. Через 48 часов инкубации формировались колонии диаметром более I_s0 мм с типичной морфологией.

В последующем были выбраны среды наиболее перспективные для выявления возбудителя чумы. Основный критерием для этого явились способность сред обеспечивать рост иташов чуйного кзш-роба, выделенных в различных природных очагах и характер роста культур при 37 С.

Эксперименты показали, что наибольшей универсальность» обладает среды ДЭ и АСЭ.Ц, наименьшей - агар Хоттингера (Табл.2). 3 порядке снижения этсго показателя среда можно было расположить следующим образом: ДЭ-АСЭД-КЭ0-КЭД-0ЭД-АС41ЭД43ЭО-0ЭД-агар Хоттингьра.

Другими словами, все сконструированные среды по своей универсальности превосходят агар Хоттингера и по этой причине являются перспективными для выделения т.pes tie . Тем не менее, дальнейшие исследования по разработке сухой элективной питательной среды мы проводили, непояьзуя преимущественно среду ДЭ, чех кох ока отличается наибольшей универсальность», а её питательная основа (дрожжевой экстракт?) намечена к широкомасштабному выпуску в блшсайшие годы. Однако не вызывает сомнений, что по море необходимости, можно будет завершить научно-техническую разработку и других срзд, сконструирован их сухие электигшые варианты.

Таблица 2

ПОКАЗАТЕЛЬ ШВЕРСМЫЮСТИ ШШГОШ ШШОШЫЖ йШ

Сэеды

12 ІЗ ЇЇ2

I _ Число штаммов, дающих росї более 50 колоний из 100 микробных кяегок при 28 С

ш
._ . ,,... всех штаммов) через 48 часов выращиваю

5. - Число штаммов, дакяих при 28 С ррст штаммов с типичной морфологией _

6. - Число шташоп, дащих рост более сО колоний из 100 микробных кдаток при 37 ^ЫС

7. - Число штаммов, выросших при 37 ^иС

8. - Число штаммов, обеспечивающих через 48 часов инкубации при 37 С рост колоний диаметром более 0,8*да

9. - Суммарная оценка универсальности среды при 28 "С 10 - Суммарная оценка универсальности среды при 37 С il - Обиая оценка универсальности среды

:2 - Показатель

і.'Л - Условная опенка

Остановив свой выбор на дрозтгевой питательной ераде₀ необходимо било дать расширенную оценку её вегетирующмх сгвдйе«э ко откопени» к возбудителю чумы и їьіяскиїь,, на возникнут дм осложнения при идентификации культур, выращенных на ней.

В экспериментах использовали 80 музейных юашсв чумного микроба, выделенных в 10 различных црнродньк очагах ш сяянчаю-' щжся по минимальным питательным потребностям. Исследования проведали б сравнении с агаром Хоттингера.

Полученная информация свидетельствовала о преимуществе ДЭ перид эгой средой по способности обеспечивать рос» культур при посевной дозе 100 микробных клеток. Большинство шаммен форкн~ ровало на дрожжевой среде через 48 «ас» инкубации при 2Н С колонии диаметром превышающим 1,& мм с типичной корфологней, адо позволяло легко обнаруживать их при просмотре посевов»

Антигенный состав клеїок возбудителя чумы, выращенных н& дротзвоЯ среде, интенсивность их дншшя при окислении глюкозы и глпконовой кксйоты, активность фершзнтов углэводаого обмене (гексокшаза, альдолаза, фоофогадсоизошраза), не отличалась ст Еналогичньк показателей культур» инкубярованньа на агарэ Хсттмнгера.

После дескти последовательных пересевов на ДЭ бактерии чумы сохраняли свои основные биологические свойства: ферментатив-нул активность по отношению к угяеведам, спиртам» мочевине, лакмусову молоку, характер роста на голодно-кксяом и беспептонном arapaxv чувствительность к фагу, вирулентность для белых мышзй и морских свинок, содержание фракции Т.

Приведённые эксперименты позволили сделать вывод, что дрожжевая среда го бактериологическим параметрам соответствует

требованиям, которым должны отвечать среды для диагностики чу-мы к дояускве? возможность с высокой эффективностью осуществ^-' яята выделение r.pestis- из исследуемого материала. Процесс . идентификации к дифференциации бактерий, выросших на ДЗ, не представляє* затруднений. Это явилось ещё одним аргументом а пользу конструирования дрожжевой элективной среди.

Прк создании подобного рода препаратов приходится сталки-, вет&ся е проблемой избирательного подавления роста вульгарного ирсявЯцЧасто загрязнявшего материал, исследуемый на чуму. Причиной служит большая устойчиьость протея к раэли<яшм ингибиторам, чем кокховых бактерий, кишечной палочки я другой хонтаки-нирущей флсры (Г.Н.Нестерова, 1975; a«P.Krl«el;j et al ., 1964). По литературным данным г.ротей наиболее чувствителен к генциан-вкоявту (В.Ы.Тумаиояий, I94d).

Мы изучили возможность использования в качесгье элективных факторов 52-х соединений, обладающих антибактериальной активностью. В их число входили различные красители, ПАВ, ингибиторы гликолиза, терминального дыхания, антибиотики, сульфамидные препараты, производные океияинилина, препарати ннтрофураясвого ряда. Однако бгыее эффективного по избирательному угнетающему действия на протей препарата, чем генциаквиолет, обнаружить не удалось. Поэтому генцианвиолег бьш использован для придания дрожжевой среде элективных свойств.

В результате многочисленных опытов, в тон числе и с использованием метода математического планирования экспериментов (В.Е. Бирюков, 1969), была сконструирояана питательная среда, обеспечивавшая надёжное вьделенне возбудителя чумм при наличии d пробе Ю микробных клеток r.pe«ti.a и I0^J-I0^ «леток вульгарного протея.

В материале, исследуемом на заражённость «іумньми бактериями, наряду с протеем и другими чувствительными к гекшанвио-лету микроорганизмами, могут встречаться формы устойчивые к этому препарату. В подобной ситуации может существенно снизиться вероятность выделения чистой культуры чукного микроба. Поэтому следовало расширить спектр ингибирумцей активности дрок-яевой среды, дополнив её новыми элективными факторами»

Необходимый эффект был получен при использовании эритромицина, что позволило значительно повысить¹ степень подавления роста сопутствующей шярофяоры и обеспечило надёжной выделение возбудителя чумы из различных объектов при инкубации посевов как в условиях 28 С_в так и при 37 С.

Последующие эксперименты были посвящены разработке сухого варианта элективной дрояжевой питательной среды. В результате был сконструирован сухой препарат (среда СДЭЧ), не -гребущий при приготовлении рабочих форм «гара взвешивания компонентов, осветления, фильтрации„ корректировки рИ, стерилизации авїокла-вированиеы. Среду можно приготовить, располагая лишь источником тепла п водой, что позволяет использовать её в самых непри-собленных условиях.

На СДЭЧ растут ауксотртфные мутанты г.pastes , нуздащие-ся в самых различных аминокислотах, витаминах, что значительно перекрывает спектр питательных потребностей» известий для природных штаммов. На ней формируются аопулчции ъоэбудителя чумы с типичжюи биологическими свойствами.

ГЛАВА 3. Разработка набора питательных сред для культивирования возбудителя чумы при 23 и 37 С

Большое число работ, опубликованных в последние годы по проблеме физиологии микроорганизмов, убедительно свидетельствуют, что микробная клетка чрезвычайно пластична, фенотипическая изменчивость оё огромна (И.Л.Работнова с соав., 1933; J.D.Harriot et al.» 1981; М.Н.Воуог et ai. , I?84; L.J.Oonsalea et al,I98S; L.aaason, B.Holbein . 1985; j.H.Wlllieon, G.C Johnston, 1985). Это заставляє? микробиологов пересматривать ряд устоявшихся представлений и самое пристальное внимание уделять вопросам выращивания бактерий, стремясь разработать методики, обеспечивающие управление ростом клеток.

Анализ достижений, накопленных в области культивирования микроорганизмов, позволил най наметять пута» ведущие к.управления процессом роста чумного вдакрсба₈ одним из которых может быть использование набора питательных сред, обладающих высокими вегегирующики характеристиками в условиях 23 и 37 С, и в so же время отличающихся компонентным составом.

Особенностью возбудителя чум; является то, что оптимум температуры для его роста находится в пределах 27-439 С, а реализация патогенного потенциала наблюдается ь условиях ^{іи riV3} , т.е. при 37 С. Однако размножение r.i>e>»ti6 при "той теаетерлтуре сопровождается увеличением питательных-потребностей (У.Т.Арышаоза с соав.„ 1900; л.Brownlew, Я./«еяаіяел , I960), что создает сущз- ственные прзпгтствия для достижения высоких значений скорости роста и выхода бактериальное массы - показателей, которые наиболее паяны для сред, используемых при культивировании чумного микроба.

Дій їого₀ чтобы повысить вероятность раарабоїка сред с hs~ обходйшшк вєгетерущими свойствами в условиях 37 С, од испытывали:: большое число различных питательных основ, содержащих ес необходимые для эффективного раздаояешш возбудителя чумы соединения. В экспериментах применяли автолиза? сеяезёнки₀ гидролиза* белка отрубей,, гидролизам белка подсолнечного Эфоте,, дрозиевой экстракт, фосфорнокисло тный гидролизат кормовых дрожжей^ гадро-лизкт керагосодеряащего сырья^ панкреатический перевар кяса ио Хоттикгеру, казеиновый гидролиэат средней степени расцепления, кукурузный экстракт. Критерием при выборе оптимальной основы служила её способность обеспечивать максимальную удельную скорость росї>а T.peetis при 37 С,

Было обнаружено, что скорость роста чумного микроба в больной степени определяется видом основы и её концентрацией, прячем при использовании всех препаратов отмечалась одинакорая зависимость изучаемого показателя от содержания питательных веществ, которая во всех случаях имела фор*^у гика (Рис.1). Подобная форма кривой была обусловлена действием лимитирующих и инги-бирующих компонентов. В стадии повьшения скорости роста наблюдается лимитирование недостатком питательных веществ, а в фазе-снижения рост контролируется ингибиторами. Однако максимальное значение онороста роста и необходимая для его достижения концентрация основы реько отличались у различных препаратов₅ что было связано с особенностям!* их химического состава. Наибольшая величина показателя скорости роста наблюдалась на средах из автоли-зата селезёнки и дрожжевого экстракта.

Выход бактериальной массы во всех опытах достигал максимального значения при концентрации ссноеы, превып-ающей оптимальную

гт -

ГИ75

(KHimiraveJuo б^_С ^еи esHYado) Rtedo їл/вчіул а 'пэое* иснчи-сиЗэляер Уохяд ^)

-т—

—г-

О

-»—

—т-

+

т-

Ч-

t- VO U1

-t-

ьч»-<і-і»-«і-і»-і>-іООСООСООО

для скорости роста культури. Обнаруженная закономерность была объяснена, «сходя из фактов, имеющихся в литературе (С.Дя.Перт, 1978 j Р.Стейниер с соавт., 1979) и свидетельствующих о том, что выход микробных клеток определяется концентрацией лимитирующих факторов и менее чувствителен к ингибиторам, чеы скорость, роста.

Полученные материалы дали основание считать, что, используя в качастве единственного источника питательных веществ, препарат с неустановленным химическим составом, практически невозможно сконструировать среду, которая в равней степени обеспечивала бы оптимальные условия для скорости роста чумного микроба и для^- выхода бактериальной массы. С целью получения максимально возможного количества ыикробных клеток необходимо увеличивать концентрацию питательной основы, что приводит к глубокому инги-бировании скорости роста культуры. И, наоборот, при концентрации основы оптимальное для скорости роста, в среде содержится относительно небольшое количество субстрата, лимитирующего размножение, вследствие чего выход бактериальной массы недостаточно высок.

Казалось бы, что наиболее правильным является дифференцированный подход при конструировании питательных сред для культивирования возбудителя чумы..При получении микробной массы следует использовать более высокую концентрацию питательной ос-ногыо чем в средах, предназначенных для выращивания чумного микроба из единичных клеток. Однако необходимо учитывать, что при концентрации основы, превышающей оптимальную для скорости роста T.paatiB > последняя контролируется ингибиторами, а это неизбежно отразится на фенотипе растущей популяции к осложнит получение сравнимых результатов при изучении биологин возбудителя чумы.

-29-.

С нашей точки зрения, при конструировании питательных сред для выращивания чумного микроба, прежде всего, следует исходить из способности среды обеспечивать высокую скорость роста бактерий» Выход из микробной массы целесообразно повышать, не увеличивая концентрацию основы, т.е. не вводя ингибиторы, а дополняя состав среды факторами, лимитирующими размножение. Это позволит сохранить скорость роста культуры ка прежнем уровне и одновременно увеличить йькод микробных клеток.

Поэтому для повыпения выхода бактериальной массы необходимо было провести исследования по идентификации факторов, лимитирующих размножение возбудителя чумьт при 37 С на средах ил автолизата селэзёнки и дрожжевого экстракта, поскольку эти препараты обеспечивают максимальную скорость роста культури,, а по-лучшнал информация позволит осуществить целенаправленную оптимизация их по уровнп микробного урожая»

Эксперименты показали, что лямитация выхода бактериальной массы возбудителя чумы при 2Г> С йызвака одним из следующих соединений: цистеин, метионин, лейцин, изолейцин, треонин, аргинин, урацил, CaCIg, углеводы (глюкоза, ксилоза). XapaKvep лимитации зависел от ауксотрофяости птамма, вида и серии питательной ОСНОВЫ.

Бал отмочен факт, что. все, идентифицированные нами, лимитирующие компоненты входят в число соединений, отнесённых к числу незаменимых для i.pesL-ta (У.ТДрнклаева с соавт., 1978, 1979). Поэтому вполне логичным представлялся вывод, что, с пальм увеличения микробного урожая, среды необходимо обогащать теми химическими веществами, по отношению к которым чумной микроб является ауксотрофом, причем их перчень должен быть макси-

малыю широк, поскольку а связи с большм диапазоном штаыновых различий в питательных потребностях r.pestis (И.Л.Мартнневсннй, Л.М.Осадчая, IS63j Я.Н.Классовскмй и др., I97G} Л.А.ПеИсахис, В.М.Степанове 1978) и недостаточной стандартностью комплексных питательных препаратов, только в этой случае макно охватить весь возможный спектр лимитации.

Наиболее эффективный путь, ведущий к достижению подобного результату нам видепся в обогащении автолиза^а селезёнки и дрожжевого экстракта препаратами природного происхождения, содержащими взсь набор химических соединений, в которых нувдает-ея большинство штаммов возбудителя чумы. К числу их мокко отнести гидролизат белка отрубей_s гидролизат белка подсолнечного шрота, казеиновый гидролизат, фосфорнокчслотный гидролизат кормових дрожжей, перевар мяса по Хоттингеру.

Использование для оптимизации различных комплексных питательных основ, наряду с возможностью более полно и с меньшими затратами охватить весь спектр возможной лимитации, позволив как мы надеялись, сконструировать набор питательных сред, отличающихся по своему составу л обеспечивающих высокие показатели скорости роста и выхода бактериальной массы чумного микроба в условиях 37 С.

Проведённые исследования позволили разработать семь пита-, тельных сред, обладающих высокими вегетирущциш: свойствами при 37 С (среды СО, СК, Q1, ДХ, ДК, ДО, ДО, Основным источником питательных веществ в средах СО, СК, СП служит аатолизат селезёнки, в средах ДК, ДХ, ДП, ДО - дрожжевой экстракт. С целью увеличения концентрации лимитирующих выход бактериальной массы факторов в состав сред вводится допо;жигельно казеиновый гидро-

- ЗІ -

лизат ССК, да), гидрол.чзат белка пігеиичнах отр5'бей (СО, ДО), гч~ дролиэат белка подсолнечного шрота (СП, Щ), перевар по Хоттчн-гору (ДХ).

Всо ерздн обеспечивают интенсивный рост T.poatis при 37 С, о чзи свидетельствует-уровень яькода бактериальной насек» (2,0-6,0 млрд. микробных клеток с I (<л ерэды! м диаметр, Формирующих-ся на них через 72 часа иняуо'ацик колоний (1,9-3,8 <ш)« На средах растут ауксотрофнио мутанты возбудителя чухи, испытывающие потребность в лейцине, гистидиче, глицерине, пролине, рибофлавине, урациле, coptme, <$анилелаиинв_в тиамине, кикотушамнде, петио-кгае_в пантотенате Са, глутоминэво:5 кислоте, аспарагкновой кислоте, аргинине, кзолейданоо трбошне, цистеине, триптофане, лизине, здешне,, гуанине, пуринах, шримидинах, Bg. Однако выход микроб» ной массы этих штаммов существенно различается я зависит ої вида использованной питательной среды. Полученная информация позволила предвояить наиболее вероятную схему лимитации для наядой из сред, что, кожно надеяться, повысит эффективность проведения экспериментов по идентификации компонентов среды, ограничивающих выход микробной иассы различных природных штаммов чумного микроба с известными питательими потребностями.

Разработаннке среды изготавливается из дестуякого сырья, технология их приготовления просто и моиет быть легко воспроизведена в лабораториях питательных сред противочумных институтов.

ГЛАВА 4. Влияние температуры культивирования, состава питательной среды на некоторые биологические свойства чумного микроба .

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о високай пластичности метаболизма чумного микроба, о зависимости его фенотипа от компонентного состава питательной среды и температури культивирования (Б.И.ВеЙнблат, Е.Э.Бяхр&х, 1968; В.С.Рудник, I960; Н.Я.ІіЧиманюк, В.Н.Ыиаанькин, 1983; С.О.Водопьянов, И.П.Олейников, 1990; rf.T.CuBinetzky, й.К.ВгиЪакег, 19U2). Одншсо большинство таких сводений получено на средах, облададщих при 37 С ішз-кнки БеГетирукдами качествам, а резкое снижение скорости роста и голодание культуры, само по себе, накладывает существенный отпечаток на свойства формирующейся популяции (И.Я.Хмель, 1970; И.Л.Работнова, 1975; Л.Г.їианоьв, 1977). Поэтому было необходимо исследовать влияние температуры при выращивании возбудителя чумы rfa средах, обладающих высокими вегетирущими характеристиками в условиях 28 и 37 С. Кроме этого, следовало изучить различные биологические свойства і.ревьіз при культивировании на средах СО, СК, Ш, ДК, ДХ, ДО, ДО и определить оптимальные режимы инкубации (вид питательной среды, температура), обеспечивающие формирование популяции с необходимыми бактериологическими параметрами.

Результаты, полученные при исследовании скорости роста, выхода бактериальной массы, дыхательной активности чумного микроба, свидетельствовали о высокой эффективности метаболизма возбудителя чумы на разработанных средах в условиях 37 С. Установлень принципиальная возможность получения при 37 С такого хе выхода микробной массы, как и при 28 С. Тем не менее, материал

давал основания считать нереальним достижение клетками при 37 С

ТЄХ Значений СКОПОСТ.Ч роста, КОТОрьге ВОЗМОЖНЫ ІфИ ВНраЩІВйННИ

бактермн в условиях 28 С, и подтвердил, что температура 37 С превышает оптимальную для роста lopeatie . Увеличение температуру инкубации с 20 С до 37 С приводила к сниженіго эф^ктив-носги конструктивного метаболизма и в то ж.е времп сопрововдалосъ повышением интенсивности дыхания клгток. Подобный эффект, пс мнению И, Н.Помозговав (1974), свидетельствуете нарупении корреляции медгу процессами анаболиама и катаболизма, что должно способствовать усиления синтеза продуктов вторичного метаболизма.

Исследование антигенного спелтра чумного микроба о помощью методов двойной ишунодифЛуэии, линейного и перекрёстного имму-ноэлекгророрезов показало, что он в очень большой стзпени зависит от условии выращивания бактерий и существенно изменяется при перемене температури иняубаши_в вгща питательной среды» Из 45 выявленных антигенов, только 18 обнаруживались у всех кссле-довашых субкультур. Остальные 27 синтезировались лив» при 'определённых условиях выращивания. Это свидетельствовало о необходимости правильного выбора условий культивирования при эыделонии отдельных антигенов r.pasUa и о целесообразности использования разнообразных режимов выращивания при изучении антигенного состава возбудителя чумы. Применение набора разработанных наїж питательных сред, обеспечивает более полную {«нртйпическуэт реализации свойств, заложенных в геноме клетки,ь может способствовать . большей зффэк^ИЕности исследований, связанных с антигенным составом чутого микробе,

Содержание vvi -антигенов попыталось в поздние сроки раэви-ті*я культури T.pestts а достигало наибольшей величины на 8-9 сугки вирасипэкия при 37 'С. К этом;/ времени на всех средах на-

калливалось одинаковое количество антигенов, т.е. состав среды на оказывал влияния на кх синтез. Продукция V» - антигенов отвечала критериям, предложенным Ы.П.Ховрычевым (1934), что позво-лшіо отнести эти соединения к вторичным метаболитам возбудителя чумы. С целью получения *М - антигенов целесообразно использовать среды ДК и Ж, так как на них синтезируется минимальное количество фракции I, что должно облегчить зыделеиие и очисткуW -антигенов.

Эксперименты по определению фракции I свидетельствовали о том, чїо максимум накопления этого клеточного компонента наблюдается на третьи сутки инкубации при 37 С ч о чрезвычайно высо-ком различии способности сконструированных сред обеспечивать продукцию данного антигена. Наибольшее количество фракции I синтезировалось на средах СО и СП_в наименьшее - на ДК и ДХ (Табя.З). Различие бшо выражено настолько, что в культурах, выращенных на среде Ш при 28 С, содержалось такое же количество антигена, как на ДК при 3? С. Следовательно, температурный фактор не является безогоеорочно ведущим в регуляции синтеза фракции I. Нз в меньшей степени продукция антигена регулируется составом пита-тельной среда. Как и vsr - антигены, фракции I можно было причислить к зторичным метаболитам возбудителя чумы.

При определении оптимальных условий получения «мышиного" токсина чумного микроба было установлено, что для его накоплении целесообразно использовать среды СО и ДО, а инкубацию бактерий проводить при 2гі С.

Культуры T.peatis , выращенные на средах ДК, ДХ, ДО, несмотря на значительные отличия в содержании такого высокопротек-тивного антигена, как фракция 1, были равноценны по своим им-

Т&Оища З

Содержание фракции 1 чумного гикроба (ЕВ) в культура^ выращенных а различных условиях

! Максимальное разведенио I млрд. суспензии, обеспечивакдее положітедьную
Питательна? І реакшю агглютинации

среда | НІГА | РНАт .

! 3? С \ 23 С ~~1 37 С \ 26 С

_ 36 -

мунэгенчым свойствам. Температура, состав питательной среды существенного влияния на значения ЕД50 ^нв оказывали. На всех сре-дах₀ как при 37 С, так и при 28 С формировались популяции, обладающие зысокой июфиогенностыэ для лабораторных животных»

Выраженный иммунный ответ ка введение неболыясго количества микробных клеток может быть получен только при условии раэшоу.е-н:ш бактерий э макрооргачизме. Поэтому, учитывая выявленное нами отсутствие зависимости иммуногенкссти культур от содержания фракции I, можно было предположить, что развитие клеток в организма лабораторных животных приводит, под влиянием условий *» vivo „ -к перестройке их метаболизма и нивелированию различий в фенотипе, в том числе и по содержанию фракции I.

. Это предположение было подтверждено экспериментально. Оказалось, что титры антител к фракции І у белых шлей, ишунизиро-вашшх живыми культурами возбудителя чумы, выращенными при 28 С, не них8₀ чем у животных, иммунизацию которых проводили клетками, инкубиррваиныни при 37 С. В то яз время, при иммунизации белых мышей убитыми бактериями,титры антител к фракции I были значительно выше в том случае, если клетки выращивались при 37 С и содержали большее количество антигена.

Поэтому ножно считать, что размножение чумного микроба в организма восприимчивого животного сопровождается нивелированием различий в содержониі; фракции I, которые были в культурах перед введением их в макроорганизм. Вполне вероятно, что подобные изменания происходят и со многими другими клеточными компонентами.

Известно, что иммуногенность возбудителя чумы зависит от содержания жизнеспособных клеток в популяции (А.И.Тинкер с соаьт., 1966). Нами было установлено, что наибольшей жизнеспособностью

обладают культуры, инкубированные при 23 С,и в опытах со средами СО, СК„ СП показало, ото в этом случав они более иммукогешш. Максимальная жизнеспособность при 23 С отмечалась на среде СО, что позволило рассматривать её как наиболее перспективную для получения иммутагенных популяций чумного млкроба.

Как и в случае с иммуногенностыэ, вирулентность возбудителя чумы коррелировала с процентным содержанием ж:вих клеток в культуре и полуденные данные свидетельствовали о необходимости использования режима 28 С при определении № q культуры.

Было установлено влияние состава питательной среди и температури инкубации на результат по определению МПК антибиотиков. Отмечено уменьшение чувствительности Т.рззІІЗ к доксицмклику, ряфампицину, гекташцчну и увеличение её к стрептомицину при изменении температури от 20 С до 37 С. Это свидетельствовало о необходимости максимальной стандартизации условий зыращиванкя ч;тл!ОГо микроба при исследовании его чувствительности к антибиотикам я, в частности, по такому параметру, как температура культивирования.

Полученные нами сведения позволили предложить схе*іу (Табл. 4), руководствуясь которой становится возмежнем с большей !эф-фективиостыо .решать некоторые вопросы, связанные с культивированием возбудителя чумы. Несомненно, что используя среды ЛД, ЛХ, ДП_в ДО, СО, СК, СП,появляется возможность более продуктивні подходить к реализации не только тех задач, которое служили объектом нашего изучения, но и целого ряда других проблем.

Таблица 4

Условия выращивания возбудителя чумы, обзсиевдша-ющиб получение поцудяцйй со свойствами, необходимыми прн реванш: некоторых биологичьскгос задач

Цель выращивания

в) А

В е< RJS 0> Ю

ID» <и t« ej

SH о

s?3S

39 о о

2S о

О Я

t-ч

Й к

OS «Cf

«5 w

a«

ag.

t-jS

ь a,

в s 9 » Ф s

и. a

о о

О S

КС КО Jl

23 3?

основанный на .измерении радиальной скорости роста сферических колонки чумного микроба.

6. С использованием новых питательных основ сконструировано девять диагностических сред для возбудителя чумы и показано, что по своей уьивзрсальности они превосходят агар Хотткнгера. Наибольшей универсальностью обладают среды из дрожжевого экстракта к ав~ толизата селезёнки. Дро.таевая среда обеспечивает рост штаммов чумного микроба из различных природных очагоь и обладающих разнообразным!* питательными потребностями. Культуры, выращенные нв ней, характеризуются высокой физиологической активностью и сохраняют все оснозные свойства, используемые при дифференциальной диагностике.

7. Разработана элективная дрожжевая среда, обеспечивающая в условиях 8 С и 37 С выделение «йогой культуры чумного микроба из материала, загрязнённого посторонней микрофлорой при наличии в проба 10 микробных клеток возбудителя чумы. Отработаны технология изготовления среды в сухом виде и способ её приготовления кз сухого порсшка, позволяющий использовать среду в сауых неприспособленных условиях.

8. Предложен новый методический подход, позволяющий получать среды, обеспечивающие одновремзино високио скорость роста и выход бактериальной массы чумного микроба, заключающийся в обогащении исходной среды предварительно идентифицированный факторами, лимитирующими уровень микробного урожая. С использованием этого метода сконструировано семь питательных сред для культивирования возбудителя чумы, обладающих высокими вегетирующиыи свойствами при температуре 8 С и 37 С и отличающихся своим компонснткнм составсм. Все среди изготавливаются из доступного сырья.

Эо Установлено, что при 3? С наблюдается нарушение корреляции между процессами анаболизма и катаболизма у чумного микроба, вырапшощееся в снижении jll культуры и одновременной увеличении интенсивности дыхания клеток. Подобный эффект приводит к повшению синтеза вторичных метабслитов возбудителя чумы. К их числу ножно причислить фракни» I, vv/ - акгигвны.

10. Определены условия (состав среды, температуря и продолжительность инкубации"), обеспечивающие максимальную продукцию фракции I, v.v - антигенов, «мышного" токсина чуїлюго микроба* При выделении у;?- антигенов культуру следует выращивать э течение 6-9 суток при 27 С на средах ДК или ДХ. Максимум синтеза фракция I наблюдается через 72 чеса инкубация при 37 С иа средах СО или Ш. Оптимальные условия дли получ-зния «мшгашс-го^я токсина характеризуются сло'дуюцики параметрами: среда СО или ДО, температура - 28 С, продолжительность выращивания - 'й часов.

11. Показано, что антигенный спектр возбудителя чумы в большой степени зависит от состава питательной среды, температуры культивирования. Из выявленных 45 антигенов, только 18 обнаруживаются у всех исследопанкых субкультур'. Остальные 27 синтезируются лишь при определённых условиях инкубации.

12. Обнаружено» что иммуіюгєнность культур I»peatla _{t зы}_ ращенных на питательных средах пр:і 37 С, несмотря на значительно большее количество фракции I, ниже, чом инкубированных в условиях 26 С. Это связало с перестройкой фечотипа бактерий при размножении в чунствительном макроорг-иизме и нивелированием различий в содержании фракции I, которые обнаруживались !& vitro . Более высокая иммуногенность популяцій, культивирован-

ных при 23 С, связана с большим процентом живых клеток.