Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современная система классификации актиномицетов основывается на принципах полифазной таксономии 9
1.1. Фенотипические признаки, используемые для классификации и идентификации актиномицетов 11
1.2. Характеристики генома, используемые в классификации и идентификации актиномицетов 16
Глава 2. Систематика и экология актиномицетов семейства Microbacteriaceae 18
Глава 3. Актиномицетно-нематодные комплексы 32
3.1. Краткая характеристика нематод подсемейства Anguininae 32
3.2. Актиномицетно-нематодные комплексы 35
Экспериментальная часть
Глава 4. Материалы и методы 38
4.1. Объекты исследования 38
4.2. Обработка галлов и посев образцов 38
4.3. Изучение морфологических и культуральных признаков 38
4.4. Изучение физиолого-биохимических признаков 43
4.5. Изучение хемотаксономических признаков 44
4.6. Молекулярно-генетические методы 46
Результаты
Глава 5. Выделение микроорганизмов 48
Глава 6. Таксономическое изучение актиномицетов с диаминомасляной кислотой (ДАМК) в клеточной стенке 56
6.1. Штаммы ВКМ Ас-1401т, ВКМ Ас-1802 и близкие организмы 56
6.2. Штаммы ВКМ Ас-1390т и ВКМ Ас-1799т из галла на Festuca rubra 62
6.3. Штаммы из галлов на листьях Cousinia onopordioid.es, семенах Agrostis sp. и стеблях Elymus repens 64
6.4. Штаммы ВКМ Ас-1790 и ВКМ Ас-1792 из семенных галлов на Agrostis sp 66
6.5. Штамм ВКМ Ас-1800 из филлосферы Androsace sp 67
Глава 7. Таксономическое изучение актиномицетов, содержащих ДАМК и орнитин в клеточной стенке 68
Глава 8. Таксономическое изучение актиномицетов с орнитином в клеточной стенке 71
Глава 9. Таксономическое изучение актиномицетов с лизином в клеточной стенке 73
9.1. Штаммы ВКМ Ас-2059т и ВКМ Ас-2062 из семян рябчика русского и клематиса 73
9.2. Штамм ВКМ Ас-1396 из листового галла на Festuca rubra 74
Обсуждение результатов
Глава 10. Выделение и описания новых таксонов актиномицетов 75
10.1. Новый род Leifsonia и его видовой состав 75
10.2. Новый род Agreia и его видовой состав 83
10.3. Новый род Okibacterium и вид Okibacterium fritillariae 86
10.4. Новые виды Rathayibacter caricis и Rathayibacter festucae 90
10.5. Plantibacter agrosticola sp. nov., Plantibacter elymi sp. nov. и Plantibacter cousiniae sp. nov 94
10.6. Agromyces albus sp. nov 103
10.7. Curtobacterium calamagrosticola sp. nov 106
10.8. Frigoribacterium mesophilum sp. nov 108
Глава 11. Местообитание бактерий изученных таксонов и актиномицетно нематодные фитопатогенные комплексы 110
Заключение 118
Выводы 120
Литература 121
Список публикаций по теме диссертации. 137
- Фенотипические признаки, используемые для классификации и идентификации актиномицетов
- Штаммы ВКМ Ас-1401т, ВКМ Ас-1802 и близкие организмы
- Новый род Leifsonia и его видовой состав
- Местообитание бактерий изученных таксонов и актиномицетно нематодные фитопатогенные комплексы
Фенотипические признаки, используемые для классификации и идентификации актиномицетов
Морфологические и культуральные признаки - как и у большинства культивируемых микроорганизмов - традиционные таксономические характеристики актиномицетов. Физиолого-биохимические признаки, такие как образование кислоты из углеводов, гидролиз различных веществ, использование разнообразных соединений в качестве источников углерода или азота, устойчивость к ингибиторам роста, способность расти при определенных температурах и рН, образование различных ферментов, отношение к кислороду и др. широко применяются для дифференциации видов (Красильников, 1970; Агре, 1986; Cross and Alderson, 1988). Физиолого-биохимические признаки, однако, в особенности у актиномицетов, значительно варьируют в зависимости от состава среды выращивания и ряда других факторов. Использование стандартных микробных идентификационных систем типа API, Biolog, Vitek и др. в определенной степени позволяют решить подобные проблемы (Rossello-Mora and Amann, 2001). Другим подходом к решению проблемы является использование методов нумерической таксономии и компьютерной обработки данных (Sneath, 1972).
Хемотаксономические признаки, отражающие химический состав и строение клетки и клеточной стенки, являются одной из наиболее значимых групп фенотипических признаков в систематике актиномицетов. Биосинтез полимеров и органических молекул бактерий детерминирован большим числом генов, поэтому хемотаксономические признаки обычно хорошо коррелируют с филогенетическим положением организмов. Эти химические соединения или особенности их строения могут быть удобными маркерами на всех таксономических уровнях. Они также удовлетворяют требованиям точности и простоты идентификации. Наряду с морфологическими, они являются основными критериями, дифференцирующими роды актиномицетов на фенотипическом уровне (Goodfellow and Cross, 1984; Goodfellow and Minnikin,1985). Хемотаксономические признаки (наряду с морфологическими) входят в перечень так называемых «Минимальных стандартов» описания новых родов этой группы (Schumann and Prauser, 1994). Ниже приводится краткая характеристика наиболее часто используемых хемотаксономических признаков актиномицетов.
Тип клеточной стенки - постоянный признак, не зависит от условий выращивания актиномицетов и общий для большинства представителей различных родов актиномицетов (Lechevalier et al., 1971). У актиномицетов и близких им организмов выделено несколько различных типов клеточной стенки на основании присутствия характерных дифференцирующих аминокислот и Сахаров (Lechevalier et al., 1971; Goodfellow, 1989).
Пептидогликан (муреин) - основной компонент клеточной стенки грам-положительных бактрий, обусловливающий ее ригидность. Пептидогликан состоит из полисах аридных цепей, связанных поперечно короткими пептидами. В тетрапептидной цепочке пептидогликана большинства актиномицетов присутствует диаминопимелиновая кислота (ДАПК) в форме LL- или DL-стереоизомеров, представители нескольких родов содержат лизин, а также орнитин. В последнее время интенсивно идет изучение группы бактерий, в пептидогликане которых присутствует диаминомасляная кислота (ДАМК). Актиномицеты значительно различаются по составу и строению пептидогликана. Состав и строение этого полимера - довольно стабильные характеристики организма, а признак "тип пептидогликана" имеет высокую таксономическую значимость (Suzuki et al., 1994). Различают два типа полимеров, в зависимости от расположения межпептидного мостика, связывающего тетрапептидные цепочки. В пептидогликане А-типа перекрестная связь осуществляется через концевую аминогруппу диаминокислоты в положении 3 одной пептидной субъединицы с карбоксильной группой D-аланина в положении 4 другой пептидной субъединицы (Schleifer and Kandler, 1972). Перекрестная связь в пептидогликанах группы В осуществляется через диаминокислоту, связывающую ос-карбоксильную группу D-глутаминовой кислоты в положении 2 одной пептидной субъединицы с карбоксильной группой D-аланина в положении 4 другой пептидной субъединицы. В третьем положении тетрапептида присутствуют 2,4-диаминомасляная кислота (ДАМК), гомосерин, лизин или орнитин (Schleifer and Kandler, 1972). Среди актиномицетов, пептидогликан В-типа характерен исключительно для организмов семейства Microbacteriaceae.
Менахиноны (компоненты дыхательной цепи) способны синтезировать грам-положительные бактерии, в отличие от грам-отрицательных, которые обычно синтезируют убихиноны. Таксономическое значение имеют структурные вариации менахинонов, а именно длина и степень гидрированности изопреноидной цепи. Таксономически значимыми считаются главным образом преобладающие компоненты, тогда как минорные компоненты чаще всего не учитываются. Изучение большого количества штаммов актиномицетов показало, что большинство родов характеризуется одним или двумя преобладающими менахинонами. Представители семейства Microbacteriaceae вьщеляются среди большинства актиномицетов наличием длинноцепочечных негидрированных менахинонов (Collins and Jones, 1980, 1981,1983; Goodfellow and Minnikin, 1985).
Миколовые кислоты - комплекс длинноцепочечных высокомолекулярных 3-гидрокси-2-разветвленных кислот (С20-С90) - широко применяются для дифференциации различных групп актиномицетов, имеющих пептидогликан А-типа. Как правило используются данные о наличии и структуре миколовых кислот (Collins et al., 1980). Ранее считалось, что на содержание и качественный состав миколовых кислот внешние условия практически не влияют. В настоящее время имеются сведения, что состав миколовых кислот клеток зависит от среды, на которой выращивается микроорганизм и температуры его культивирования. Количество миколовых кислот также изменяется (увеличивается) с возрастом культуры (Нестеренко и др., 1985). Миколовые кислоты - хороший маркер организмов подпорядка Corynebacterineae. Имеются, однако, редкие исключения, например, вид Corynebacterium amycolatum, представители которого не имеют миколовых кислот (Collins et al., 1988). Представители семейства Microbacteriaceae не содержат миколовых кислот (Park et al., 1993).
Состав жирных кислот - один из важных хемотаксономических признаков, но его таксономическая ценность долго подвергалась сомнению ввиду того, что состав жирных кислот в значительной степени зависит от возраста культуры и условий ее культивирования -состава среды, температуры, рН. Однако при соблюдении общих требований к выращиванию культур качественный состав групп жирных кислот достаточно постоянный. В настоящее время этот признак является важньм диагностическим критерием и оказывает существенную помощь в характеристике и идентификации актиномицетов с дифференцированным мицелием (Агре, 1986; Kampfer and Kroppenstedt, 1996). Для актиномицетов семейства Microbacteriaceae характерно преобладание насыщенных изо-метилразветвленных и антеизо-метилразветвленных жирных кислот (Collins et al., 1980). У некоторых представителей семейства, однако, обнаружены специфические липидные компоненты. Так недавно были описаны роды Frigoribacterium и Subtercola, содержащие 1,1-диметокси-антеизо-пентадекан (Kampfer et al., 2000; Mannisto et al., 2000).
Штаммы ВКМ Ас-1401т, ВКМ Ас-1802 и близкие организмы
Штамм ВКМ Ас-1401 выделен из галла на корнях Роа annua, индуцированного нематодой Subanguina radicicola (Московская обл.); ВКМ Ас-1402 - из филлосферы Calamagrostis sp. (участок "Змеиные горы" Центрально-Черноземного заповедника, Белгородская область). Бактерии образуют на коринебактериальном агаре гладкие, блестящие, маслянистые колонии желтого цвета. Клетки представляют собой подвижные, способные к ветвлению палочки длиной 4-6 мкм и диаметром 0,6-0,9 мкм, которые на 3-4 сутки фрагментируются до более коротких (около 2,0-2,5 мкм) подвижных элементов. Клеточная стенка этих штаммов содержит глицин, глутаминовую ислоту, ДАМК и аланин в молярном соотношении приблизительно 1: 1:2: 1. Сахара клеточной стенки представлены глюкозой, галактозой, маннозой и доминирующей рамнозой. Менахиноны были представлены МХ-11, в минорных количествах присутствовали MX-10 и MX-12 (табл. 8).,Основные фосфолипиды - фосфатидилглицерин и дифосфатидилглицерин. Среди жирных кислот штамма ВКМ Ас-1401 определены: 36,3% антеизо-15:0, 45,4% антеизо-17:0 и 15,6% изо-16:0. Остальные жирные кислоты (16:0, изо-15:0, 15:0, изо-17:0, 18:1 и изо-18:0) были представлены в малых количествах - около 1% или менее. Миколовые кислоты не выявлены. Штаммы ВКМ Ас-1401т и ВКМ Ас-1802 имели оптимум роста при температуре 24-28С. По морфологическим и хемотаксономическим характеристикам штаммы ВКМ Ас-1401т и ВКМ Ас-1802 были схожи с Corynebacterium aquaticum ВКМ Ас-1400 , выделенным Е. Leifson (1962) и сохраняемым во многих мировых коллекциях. Они отличались по утилизации адонита, D-арабинозы, инозита, мелицитозы, раффинозы и L-сорбозы в качестве источника углерода, гидролизации эскулина, желатины и крахмала, продуцированию сероводорода H2S (табл. 9). Было проведено сравнительное изучение штаммов ВКМ Ас-1400 т, ВКМ Ас-1802 и ВКМ Ас-1401 т по 158 фенотипическим характеристикам. Последующий нумерический анализ подтвердил их принадлежность к одному фенотипическому кластеру родового уровня и выявил существенную фенотипическую обособленность штамма ВКМ Ас-1802.
Анализ 16S рДНК штамма ВКМ Ас-1401 (1480 пар оснований) показал, что этот штамм вместе с Corynebacterium aquaticum ВКМ Ас-1400 , а также Clavibacter xyli subsp. cynodontis ВКМ Ас-2041 и Clavibacter xyli subsp. xyli Fl А (таксономическая принадлежность которых к роду Clavibacter подвергалась сомнениям) входит в обособленный филогенетический кластер в составе семейства семейства Microbacteriaceae; значение "bootstrap -анализа - 98% (рис.7). Штамм ВКМ Ас-1401т показал 98,4 и 98,1% сходства 16S рДНК с Corynebacterium aquaticum и Clavibacter xyli subsp. cynodontis. Сходство 16S рДНК между Clavibacter xyli subsp. cynodontis и Clavibacter xyli subsp. xyli составляет 98,8% (Lee et al, 1997). Анализ 16S рДНК штамма ВКМ Ас-1802 и его дальнейшая идентификация не проводились.
С целью определения видовой принадлежности штамма ВКМ Ас-1401 , изолированного из галла, был определен уровень его ДНК сходства с филогенетически близкими Corynebacterium aquaticum ВКМ Ас-1400т и Clavibacter xyli subsp. cynodontis ВКМ Ас-2041т. Результаты исследования показали, что три эти штамма принадлежат к трем различным геномовидам.
Уровень ДНК-ДНК гомологии между ВКМ Ас-1401т и Corynebacterium aquaticum ВКМ Ас-1400т составлял 44,1%, а каждого из этих организмов с Clavibacter xyli subsp. cynodontis ВКМ Ас-2041 - 40,9 и 40,1%, соответственно. Штаммы геномовидов различались фенотипически: по составу Сахаров клеточных стенок, оксидазной реакции, устойчивости к 5% NaCl, тесту Фогес-Проскауэра, способности образовывать H2S и ряду физиологических характеристик (табл. 9; подробные характеристики приведены в описаниях видов).
Новый род Leifsonia и его видовой состав
Филогенетический анализ последовательностей 16S рДНК показал, что штамм ВКМ
Ас-1401т, выделенный из галла на корнях Роа annua, индуцированного нематодой Subanguina radicicola (Московская обл.), формировал отдельную ветвь на филогенетическом древе семейства Microbacteriaceae вместе с Corynebacterium aquaticum ВКМ Ас-1400т, невалидным штаммом, выделенным Leifson (1962) из дистиллированной воды, и Clavibacter xyli subsp. cynodontis ВКМ Ас-2041т и Clavibacter xyli subsp. xyli F1A, таксономическая принадлежность которых к роду Clavibacter давно подвергалась сомнению (рис.7). Наш изолят ВКМ Ас-1401 близок также к Corynebacterium aquaticum и Clavibacter xyli subsp. cynodontis и по основным хемотаксономическим характеристикам. Эти три штамма отличались от наиболее близкого по хемотаксономическим критериям рода Agromyces наличием D- и L-изомеров ДАМК в составе пептидогликана (Sasaki et al., 1998); агромицеты имели L-ДАМК изомер. Изолят ВКМ Ас-1401 и Corynebacterium aquaticum не имели тейхоевых кислот в клеточных стенках (Наумова, персональное сообщение), в отличие от ряда штаммов рода Agromyces, которые содержали этот полимер (Shashkov et al., 1995; Гнилозуб и др., 1994). Altenburger et al. (1997), исследуя состав полиаминов штамма ВКМ Ас-1401т (обозначенного в этой работе как Agromyces sp. DL-89), установили, что общие полиамины нашего изолята были 0,62 ммоль г"3 в отличие от полиаминов агромицетов, составлявших 0,21-0,28 ммоль г"1. Кроме того, представители рода Agromyces неподвижны (Gledhill and Casida, 1969; Zgurskaya et al., 1992; Suzuki et al, 1996), в то время как наш изолят, Corynebacterium aquaticum и Clavibacter xyli subsp. cynodontis подвижные. Интересен и тот факт, что организмы изученной нами группы, за исключением штамма Corynebacterium aquaticum , известны как патогены (Davis et al., 1980, 1984; Metzler et al., 1997) или были изолированы из растений с явными признаками заболеваний, тогда как природной средой обитания агромицетов считается почва (Gledhill and Casida, 1969; Zgurskaya et al., 1992; Suzuki et al., 1996; Takeuchi and Hatano, 2001). Таким образом, филогенетическое и фенотипическое сходство штаммов ВКМ Ас-1401т, Corynebacterium aquaticum и Clavibacter xyli subsp. cynodontis и их отличия от описанных родов позволяют выделить эти организмы в отдельный род семейства Microbacteriaceae (Park et al., 1993). Мы назвали этот род по имени ученого Einar Leifson, который изолировал и описал Corynebacterium aquaticunt (Leifson, 1962). Основные фенотипические характеристики, дифференцирующие новый род Leifsonia от других родов семейства Microbacteriaceae с ДАМК в клеточной стенке, приведены в таблице 14.
Анализ ДНК-ДНК сходства штаммов ВКМ Ас-1401т, Corynebacterium aquaticum ВКМ Ас-1400 и Clavibacter xyli subsp. cynodontis ВКМ Ac-2041 показал, что штаммы относятся к различным геномовидам. Этот факт, а также их фенотипические отличия (по составу Сахаров клеточных стенок, оксидазной реакции, устойчивости к 5% NaCl, тесту Фогес-Проскауера, способности образовывать H2S и ряду физиологических характеристик) (табл. 15) всидетельствуют о том, что эти организмы могут быть отнесены к разным видам рода Leifsonia.
Оба медленно растущих штамма Clavibacter xyli subsp. cynodontis и Clavibacter xyli subsp. xyli, являющихся фитопатогенными организмами отличались от Leifsonia aquatica и Leifsonia poae морфологически и по физиологическим характеристикам, включая состав сред для культивирования и источники выделения (табл.15). Эти подвиды имели более низкий состав Г+Ц ДНК (66 моль%) (Davis et al., 1984), чем Leifsonia aquatica ВКМ Ас-1400т (около 70 моль%) (Yamada and Komagata, 1970; Dopfer et al., 1982). Эти отличия между Clavibacter xyli subsp. cynodontis и хорошо растущими штаммами Leifsonia aquatica и Leifsonia poae подтвердил низкий уровень ДНК-ДНК сходства между этими штаммами 40,1 и 40,9%, соответственно. Филогенетическое сходство штаммов двух различных подвидов Clavibacter xyli было показано ранее (Lee et al., 1997). Основываясь на совокупности всех этих данных, предложены новые виды Leifsonia aquatica (типовой вид рода) с типовым штаммом Leifsonia aquatica BKM Ас-1400т и Leifsonia poae с типовым штаммом BKM Ас-1401т, a Clavibacter xyli с двумя подвидами реклассифицированы как Leifsonia xyli (Davis et al., 1984): Leifsonia xyli subsp. xyli (Davis et al., 1984) и Leifsonia xyli subsp. cynodontis (Davis et al., 1984).
В 1999 г. японские микробиологи описали еще два вида рода Leifsonia - L. naganoensis и L. shinshuensis (Suzuki et al., 1999). Представители этих двух видов отличны от описанных нами видов по фенотипическим характеристикам, представленным в табл. 15 и обособляются на филогенетическом уровне (рис. 7). В 2000 г., после опубликования нами описания рода Leifsonia в Международном журнале систематической и эволюционной микробиологии {Int. J. Syst. Evol. Microbiol.), эти виды были валидированы (Suzuki et al., 2000). Таким образом, в настоящее время род Leifsonia включает 5 видов и два подвида:
Leifsonia aquatica
Leifsonia naganoensis
Leifsonia shinshuensis
Leifsonia poae
Leifsonia xyli:
Leifsonia xyli subsp. xyli
Leifsonia xyli subsp. cynodontis
Описание рода Leifsonia gen. nov.
Leifsonia (Leif.so ni.a. MX.
Leifsonia назван по имени Einar Leifson, который изолировал и описал первый организм этого рода).
Бактерии образуют колонии желтого или белого цвета, округлые, выпуклые, блестящие, непрозрачные и маслянистые. Клетки грам-положительные, не образующие спор, неправильные фрагментирующиеся до коротких или коккоидных элементов палочки. В молодой культуре клетки некоторых видов способны к ветвлению. Обычно подвижны. Некислотоустойчивы. Мезофилы. Облигатные аэробы. Каталазоположительны. Оксидазный тест вариабелен у различных видов. Имеют пептидогликан В-типа, содержащий глицин, глутаминовую кислоту , ДАМК и аланин в молярном соотношении около 1:1:2:1, оба изомера, L-ДАМК и D-ДАМК, представлены в равных количествах. Преобладающий менахинон МХ-11; MX-10 также присутствует. Сахара клеточных стенок представлены доминирующей рамнозой; в минорных количествах глюкоза, галактоза и манноза; некоторые виды имеют фукозу. Тейхоевые кислоты и миколовые кислоты отсутствуют. Основные фосфолипиды фосфатидилглицерин и дифосфатидилглицерин. Среди жирных кислот доминируют антеизо-15:0, антеизо-17:0 и изо-16:0. Концентрация полиаминов высокая; среди полиаминов преобладает путресцин. Г+Ц состав ДНК 66,0-73%. Некоторые виды различаются по устойчивости к антибиотикам. Формируют отдельный филогенетический кластер. Типовой штамм рода Leifsonia aquatica.
Местообитание бактерий изученных таксонов и актиномицетно нематодные фитопатогенные комплексы
До недавнего времени было известно четыре ассоциации актиномицетов и высокоспециализированных фитопатогенных галлообразующих нематод подсемейства Anguininae, в которых микробный компонент точно идентифицирован (табл. 23). Все ранее описанные актиномицеты-ассоцианты относятся к 4-м фитопатогенным видам рода Rathayibacter, используют определенный вид нематод (A. funesta, A. tritici или Anguina sp. ex Dactylis glomerata) в качестве вектора и заселяют галлы, индуцированные этими ангвинами на хозяйских растениях (Price et al., 1979; Sabet, 1954; Bird, 1981; McKay and Ophel, 1993).
С учетом имеющихся данных по биологии и экологии бактерий рода Rathayibacter, и высокого биологического сходства нематод подсемейства Anguininae (Price et al., 1979; Krall, 1991), обнаружение бактерий рода Rathayibacter в галлах, индуцированных ангвининами, было в определенной степени прогнозируемым. Бактерии, выделеные из галла на Festuca rubra, индуцированного нематодой Anguina graminis, отнесены к новому виду Rathayibacter festucae. Как упоминалось в обзоре литературы, неидентифицированные бактерии, ассоциированные с Festuca rubra, зараженной нематодой Anguina sp. и токсичной для скота, были ранее описаны Galloway (1961). Как можно предположить, похожие бактерии могли быть причиной токсикоза скота (1943-1949 гг.), вызванного присутствием в кормах Festuca rubra, зараженной нематодой Anguina sp. (Bird, 1981). Что касается другого описанного нами вида рода Rathayibacter - R. caricis - мы не обнаружили видимых признаков нематодной инфекции на осоке (Carex sp.), из листьев которой были изолированы бактерии. Однако имеющиеся данные по биологии и распространению высокоспециализированных фитопатогенных нематод подсемейства Anguininae и их специфичности в отношении ассоциированных бактерий позволяют с высокой степенью вероятности.предполагать, что Rathayibacter caricis также является ассоциантом нематоды вышеупомянутого подсемейства, и эта нематода, скорее всего, не принадлежит к видам Anguina tritici, Anguina funesta, Anguina graminis, Anguina agrostis или Anguina sp. ex Dactylis glomerata (табл. 23). Некоторые виды осок, как известно, являются хозяйскими растениями для нематод Heteroanguina carisis (Соловьева и Кролл, 1983), и, по всей вероятности эта или близкая нематода может быть вектором бактерий Rathayibacter caricis.
Проведенные нами исследования показали также, что актиномицеты семейства Microbacteriaceae присутствуют в поверхностно-стерилизованных галлах, индуцированных другими видами ангвинин на хозяйских растениях. В ряде случаев, бактерии одного вида преобладали или абсолютно доминировали среди микроорганизмов, выявленных методом высева. Эти бактерии отнесены к новым видам родов Agreia и Leifsonia, описанным авторами, или новым видам родов Curtobacterium, Rathayibacter и Plantibacter.
Бактерии валидно описанного вида - Agreia bicolorata - изолированы из листовых галлов, индуцированных нематодой Heteroanguina graminophila на растении Calamagrostis neglecta (Ehrh.) P. Gaertn et al. В пользу того, что Agreia bicolorata является ассоциантом нематоды Heteroanguina graminophila, свидетельствуют следующие факты:
а) бактерии этого вида составляли значительную долю среди изолятов, выросших на коринебактериальном агаре из суспензии размолотого галла на листьях Calamagrostis neglecta;
б) бактерии образуют обильный внеклеточный полисахарид, что характерно для бактерий, ассоциированных с нематодами (Bird, 1985);
в) бактерии вида Agreia bicolorata не встречались в филлосфере различных растений без видимых признаков нематодной инфекции и галлах, индуцированными другими видами ангвинин.
Желтопигментированные штаммы рода Agreia spp., выделенные из галла, индуцированного нематодой Anguina agropyri на Elymus repens (L.) Gould., и из филлопланы растений без видимых признаков нематодного заражения (принадлежащие, по всей вероятности, к другим видам рода), обнаруживались в единичных случаях. Организмы вида Subtercola pratensis (Behrendt et al., 2002), который мы предлагаем реклассифицировать в вид рода Agreia, выделен из травяной мульчированной смеси; признаки нематодной инфекции также не выявлены. Имеющиеся в настоящее время сведения позволяют заключить, что средой обитания актиномицетов нового рода Agreia являются различные растения и растительные субстраты. Отдельные виды рода, например, Agreia bicolorata, являются, по-видимому, ассоциантами ангвинин.
Большинство бактерий предложенного нами другого нового рода - Leifsonia, так же, как и вышеупомянутые организмы рода Agreia, ассоциированы в природных условиях с растениями и растительными субстратами. Leifsonia xyli subsp. xyli - известный фитопатоген, вызывающий заболевания сахарного тростника (Saccharum officinarum) (Davis et al., 1984; Gillaspie and Teackle, 1989). Leifsonia xyli subsp. cynodontis в природе является ассоциантом Cynodon dactylon (L.) Pers и может вызывать заболевания этого растения (Davis et al., 1984). Бактерии описанного нами нового вида Leifsonia роае вьщелены из корневого галла на мятлике (Роа annua), индуцированного нематодой Subanguina radicicola. Хотя бактерии не доминировали среди изолятов и отсутствуют прямые данные об их взаимосвязи с нематодой Subanguina radicicola, нематода, несомненно, играет определенную роль в бактериальной инвазии корня (галла). Фитопатогенные нематоды повреждают корень в точке роста, и в этой микрозоне активно развиваются различные сапрофитные и эндофитные бактерии (Hallmann et al., 1997). Повреждение растительных тканей способствует проникновению ряда эндофитных бактерий (в их числе Leifsonia роае) в корень (галл) растения. Нематода Subanguina radicicola, однако, скорее всего, является вектором для бактерий вида Leifsonia роае, подобно тому, как это описано для ассоциаций Rathayibacter-Anguina (Price et al., 1979; Riley and Ophel, 1992). Бактерии вида Leifsonia роае (существенно обособленные филогенетически от других видов рода, рис. 7), сходные по составу клеточной стенки с бактериями рода Rathayibacter, не были выявлены нами и никогда не обнаруживались ранее другими авторами в многочисленных исследованиях, касающихся изучения микроорганизмов ризосферы и ризопланы растений.
Факт обнаружения видов Leifsonia naganoensis и Leifsonia shinshuensis в почве (Suzuki et al., 1999) не противоречит предположению, что растения и растительные субстраты основное местообитание бактерий рода Leifsonia. В почву бактерии могли попасть с отмершими растительными остатками. Вопрос о том, являются ли водоемы природным местообитанием бактерий вида Leifsonia aquatica (Leifson, 1962; Grove et al., 1999) или бактерии попадают туда с водными стоками, требует дальнейшего изучения.
Бактерии рода Plantibacter, выделенные из галлов, индуцированных фитопатогенными нематодами Anguina agropyri, Anguina agrostis и Mesoanguina picridis на растениях Elymus repens (L.) Gould (Московская обл.), Agrostis sp. (острова Кунашир и Сахалин, Дальний Восток) и Cousinia onopordioides Ledeb. (Туркменистан), значительно или абсолютно преобладали в высевах как из нестерилизованных, так и поверхностно-стерилизованных галлов. Штаммы предложенных нами новых видов Plantibacter agrosticola sp. nov., Plantibacter elymi sp. nov. и Plantibacter cousiniae sp. nov. строго ассоциированы с растениями Agrostis sp., Elymus repens и Cousinia onopordioides, которые являются растениями-хозяевами для нематод Anguina agrostis, Anguina agropyri и Mesoanguina picridis, соответственно. Хотя видовая принадлежность полевицы не была определена, вероятнее всего это Agrostis capillaris L. (синоним Agrostis tenuis L.), так как это растение является хозяином Anguina agrostis sensu stricto (Southey, 1973; Southey et al, 1990; Riley, 1987; Riley et al, 1988; Субботин, персональное сообщение). Мы не обнаружили Plantibacter spp. на контрольных, не зараженных нематодами образцах или частях растений Agrostis sp., Elymus repens (L.) Gould и Cousinia onopordioides Ledeb, а также в галлах, образованных другими видами нематод, в то время как другие виды бактерий, характерные для филлосферы (Curtobacterium spp., Microbacteriuum spp.), выявлялись часто. Исходя из полученных данных, можно предположить, что предложенные новые виды Plantibacter являются ассоциантами (симбионтами) соответствующих паразитических ангвинин и используют их как вектор, подобно тому, как было описано для Rathayibacter spp. (Bird, 1981; 1985; Riley, 1987). Следует подчеркнуть, что бактерии рода Plantibacter сходны с представителями Rathayibacter по морфологии, а также хемотаксономическим и ряду других фенотипических признаков, существенно обособляясь от них на филогенетическим уровне.