Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1 Рибонуклеазы различного происхождения и их биологические эффекты 13
1.2 Онконаза – РНКаза Rana pipiens с противоопухолевой активностью 15
1.3 -Сарцин – высокотоксичная РНКаза гриба 17
1.4 BS-РНКаза – природный димер 17
1.5 Барназа и ее применение в биотехнологии 18
1.6 Биназа – РНКаза c противоопухолевой и противовирусной активностью 1.6.1 Характеристика фермента 21
1.6.2 Биосинтез биназы
1.6.3 Противоопухолевые свойства биназы 26
1.6.4 Противовирусная активность биназы
1.7 Бальназа – РНКаза Bacillus altitudinis 29
1.8 Молекулярные детерминанты, определяющие цитотоксичность 31 РНКаз
1.9 Димеризация белков и ее роль в их биологической 38
активности
1.10 Димеризация рибонуклеаз 42
Экспериментальные исследования 46
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Штаммы бактерий 46
2.1.1. Условия культивирования бактерий 46
2.2 Выделение и очистка гомологичных РНКаз B. altitudinis и B. pumilus 46
2.2.1 Ионообменная хроматография на колонке с использованием ДЭАЭ- 46
целлюлозы КМ-32 и фосфоцеллюлозы Р-11
2.2.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография 47
2.3 Рибонуклеазная активность з
2.4 Определение концентрации белков 49
2.5 SDS-электрофорез в ПААГ 49
2.5.1 Окрашивание гелей серебром 51
2.6 Определение РНКазной активности методом зимографии 51
2.7 Вестерн-блот 51
2.8 Масс-спектрометрический анализ 52
2.9 Нативный электрофорез
2.10 Гель-фильтрация 53
2.11 Оценка противоопухолевого потенциала ферментов 53
2.11.1 Клетки 53
2.11.2. Определение цитотоксичности РНКаз с использованием реагента 53 WST
2.12 Иммунопреципитация 54
2.13 Биоинформационный анализ 55
2.14 Статистическая обработка результатов 56
ГЛАВА 3. Результаты исследований 57
3.1 Выделение и очистка внеклеточных РНКаз (биназы и бальназы) из 57
культуральной жидкости бацилл с использованием методов ионообменной хроматографии
3.1.1 Исследование динамики роста Bacillus altitudinis и биосинтеза бальназы
3.1.2 Идентификация и оценка гомогенности полученных белковых препаратов РНКаз методами масс-спектрометрического анализа
3.2 Исследование структурных особенностей гомологичных РНКаз 70
3.3 3D-моделирование молекул РНКаз и их димерных структур 77
3.4 Оценка цитотоксического потенциала полученных препаратов РНКаз: 80
биназы и бальназы
3.5 Белок-белковое взаимодействие биназы с ГТФазой K-Ras 81
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 84
4.1 Методы выделения и очистки гомологичных РНКаз из природных 84
штаммов-продуцентов
4.2 Структурная организация бальназы и биназы 87
4.2.1 Стабильность димерных структур 90
4.2.2 Моделирование структур димеров гомологичных РНКаз
4.3 Цитотоксичность РНКаз 92
4.4 Ингибирование MAPK/ERK сигнального пути биназой при связывании 94 с K-Ras
Заключение 98
Список сокращений и условных обозначений 101
Список литературы
- Онконаза – РНКаза Rana pipiens с противоопухолевой активностью
- Выделение и очистка гомологичных РНКаз B. altitudinis и B. pumilus
- Идентификация и оценка гомогенности полученных белковых препаратов РНКаз методами масс-спектрометрического анализа
- Моделирование структур димеров гомологичных РНКаз
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.
Каждый год во всем мире растет число онкологических больных. Несмотря на огромное количество проводимых в области противоопухолевой терапии исследований смертность от онкологии непрерывно растет [Чиссов и др., 2012]. В Татарстане каждый 48-ой житель республики болен раком. Высокая смертность больных злокачественными образованиями связана с низкой эффективностью и отсутствием селективности у применяемых сегодня препаратов для лечения онкологических болезней [Чиссов и др., 2012]. Проблема низкой клинической эффективности лекарственных средств, главным образом связана с отсутствием избирательного действия и высокой токсичностью применяемых препаратов. В настоящее время важнейшей задачей является поиск принципиально новых противоопухолевых агентов, отличающихся направленностью действия, селективностью в отношении раковых клеток и низкой иммуногенностью [Mitkevich et al., 2015]. В связи с этим особое внимание исследователей привлекают ферменты класса гидролаз – рибонуклеазы (РНКазы). РНКазы играют ключевую роль в метаболизме РНК, гидролизуя полинуклеотидные цепи РНК по двух стадийному пути с образованием олигонуклеотид-2',3'-циклофосфатов в качестве промежуточных продуктов и последующим их расщеплением до соответствующих производных 3' – фосфорной кислоты [Kumar, Walz, 2001]. На сегодняшний день известно значительное количество РНКаз, обладающих селективным цитотоксическим действием по отношению к раковым клеткам [Ardelt et al., 2009]. Ранее считалось, что биологические эффекты РНКаз обусловлены их каталитической активностью, однако недавно показано, что снижение уровня тотальной РНК не фатально для клетки, а является лишь пусковым механизмом в каскаде клеточных регуляторных механизмов, приводящих к запуску апоптоза [Mitkevich et al., 2010].
Механизм действия РНКаз, а главное, природа их селективности до сих
пор до конца не изучены. В отличие от РНКаз млекопитающих, РНКазы
микроорганизмов не подвергаются действию ингибитора РНКаз,
присутствующего в организмах животных и человека [Leland, Raines, 2001]. Широкие возможности для биоинженерии этих ферментов делают их весьма привлекательными для разработки новых щадящих терапевтических средств, не повреждающих ДНК. Для бактериальных РНКаз, секретируемых родом Bacillus, установлено противоопухолевое [Makarov et al., 2008; Ulyanova et al., 2011] и противовирусное [Shah-Mahmud, Ilinskaya, 2013] действия. Особого внимания заслуживает избирательность действия РНКаз бацилл по отношению к опухолевым клеткам, экспрессирующим определенные онкогены: ras, kit, AML/ETO и FLT3[Mitkevich et al., 2015]. Молекулярный механизм действия РНКаз не обязательно включает проникновение фермента в клетку эукариот; более того, при интернализации нормальными эпителиальными клетками последние не погибают [Cabrera-Fuentes et al., 2012]. Вероятно, решающее значение в поражении опухолевых клеток имеет первичное взаимодействие экзогенных РНКаз с поверхностью клетки и их доступ к мембранным белкам
сигнальных путей, в связи, с чем особенно важно детально исследовать молекулярную организацию РНКаз.
Способность образовывать димеры обнаружена у многих представителей РНКаз: панкреатической РНКазы А [Liu et. al., 2001], рибонуклеазы семенников быка (BS-РНКазы) [Gotte et. al., 2012], РНКазы L [Garvie et al., 2013] и других. Известно, что димеризация РНКазы T E. coli необходима для эффективного гидролиза РНК [Zuo, Deutscher, 2002], а активация РНКазы L, участвующей в иммунном ответе клеток на вирусную инфекцию, происходит путем образования димеров [Garvie et al., 2013]. Показано, что димерная BS-РНКаза представлена двумя типами димеров различной стабильности, причем только высокостабильные димеры обладают цитотоксическими свойствами [Gotte et. al., 2012].
Для бактериальной РНКазы Bacillus pumilis 7Р (биназы) показана возможность образования димеров в кристаллах, данных о димеризации фермента в растворе в литературе не представлено [Polyakov et al., 2010]. Биназа селективно ингибирует рост клеток, экспрессирующих специфические онкогены: ras, kit, AML1/ETO и FLT3, при этом, не оказывая значимого токсического влияния на нормальные клетки организма [Ilinskaya et al., 2007; Mitkevich et al., 2010; Mitkevich et al., 2013; Mitkevich et al., 2015]. Исследование биологических свойств биназы позволяет рассматривать ее в качестве перспективной альтернативы традиционным химиотерапевтическим средствам в щадящей терапии злокачественных новообразований. Биназа не обладает свойствами суперантигена, введение фермента в живой организм не приводит к индукции поликлонального Т-клеточного ответа, что говорит о низкой иммуногенности белка [Ilinskaya et al., 2007]. Кроме того, действие фермента не блокируется ингибитором РНКаз млекопитающих (ИР) ввиду отсутствия сродства ИР к филогенетически отдаленной РНКазе [Sevcik et al., 2002].
Естественным аналогом биназы является рибонуклеаза Bacillus altitudinis - бальназа, которая отличается по первичной последовательности от биназы лишь одной заменой аминокислоты: аланина в положении 106 (Ala106) на треонин (Thr106) [Дементьев и др., 1993]. Высокая степень гомологии новой РНКазы с биназой предполагает наличие у нее схожих цитотоксических свойств и структурных особенностей, которые на сегодняшний день остаются не изученными.
Таким образом, определение цитотоксического потенциала новой РНКазы, а также оценка ее структурных особенностей в сравнении с известной биназой позволят внести вклад в понимание механизма образования димеров у РНКаз и роли димеризации в проявлении цитотоксичности этих ферментов. Кроме того, станет возможным оценить влияние единственной аминокислотной замены аланина на треонин на структуру и функции ферментов. Выявление цитотоксических свойств новой РНКазы и возможного селективного действия в отношении опухолевых клеток внесет вклад в развитие противоопухолевых терапевтических средств нового поколения.
В связи с этим целью настоящей работы является характеристика структурных особенностей и биологического действия экстрацеллюлярных
бациллярных РНКаз: новой РНКазы B. altitudinis и ее гомолога – РНКазы B. pumilus.
В работе были поставлены следующие задачи:
-
Разработать универсальный метод выделения и очистки гомологичных рибонуклеаз B. pumilus (биназы) и B. altitudinis (бальназы) на основе природных продуцентов.
-
Провести сравнительную характеристику структурных и биологических свойств новой РНКазы B. altitudinis и ее гомолога – РНКазы B. pumilus.
-
Доказать существование природных димеров гомологичных бациллярных РНКаз биназы и бальназы, установить принципы их структурной организации, оценить стабильность димерных структур и вклад в проявление противоопухолевой активности.
-
Оценить возможность белок-белкового взаимодействия биназы с рецепторной ГТФазой Ras в трансформированных SV-40 клетках эпителия легких MLE-12 и определить вклад этого взаимодействия в апоптоз-индуцирующее действие биназы.
Научная новизна. Разработан универсальный метод выделения и очистки низкомолекулярных РНКаз: бальназы и биназы из природных-продуцентов B. altitudinis В-388 и B. pumilus 7P, позволяющий получить гомогенные препараты ферментов в три этапа. Впервые получен гомогенный препарат новой РНКазы - бальназы с удельной активностью 1.2106 ед./А280, оценен ее цитотоксический потенциал, показано, что фермент обладает избирательной цитотоксичностью в отношении линии опухолевых клеток аденокарциномы легких человека (A549) и не снижает жизнеспособность нормальных клеток эпителия легких. Уровень цитотоксичности гомологичных бациллярных РНКаз биназы и бальназы в первые 24 ч совпадает, ферменты снижают жизнеспособность опухолевых клеток на 28-30%, через 48 ч токсический потенциал бальназы остается на прежнем уровне, а биназы увеличивается на 14%. Впервые установлено, что гомологичные РНКазы представляют собой природные димеры, различающиеся способом образования и стабильностью димерных структур. Показано, что высокая стабильность димеров биназы обусловлена возможностью обмена доменами между мономерами белка; димеры бальназы не способны к обмену участками по swаpping-механизму, в связи с чем ее димерные структуры обладают более низкой стабильностью. Обнаружена корреляция между цитотоксичностью РНКаз и стабильностью их димеров. Впервые получены доказательства того, что избирательная цитотоксичность биназы на ras-экспрессирующие клетки обусловлена прямым взаимодействием биназы с ГТФазой Ras, что приводит к блокированию MAPK/ERK - сигнального пути и индукции апоптоза в опухолевых клетках.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в рамках диссертационной работы данные могут быть использованы в биотехнологии в качестве методологии для получения гомогенных препаратов РНКаз. Обнаруженные в ходе работы структурные особенности РНКаз важны
для общего понимания механизма образования димеров у белков и их роли в жизнедеятельности клетки. Различия в стабильности димеров гомологичных РНКаз позволяют оценить вклад димерных структур в проявление каталитических и биологических эффектов РНКаз.
Концепция гибели опухолевых клеток за счет селективного
каталитического расщепления мРНК онкогенов впервые дополнена новыми данными: доказано, что бациллярная РНКаза - биназа впрямую связывается с онкогенным белком Ras, что приводит к блокированию MAPK/ERK-сигнального пути и апоптозу опухолевых клеток. Близкая гомология двух ферментов опосредует их использование в качестве моделей для исследования роли и функций аминокислотной замены аланина на треонин в формировании пространственной структуры белков и ее влияние на их функциональную активность. Полученные результаты о прямом взаимодействии биназы и белка Ras могут лечь в основу разработки нового подхода в таргетной терапии опухолевых заболеваний.
Методология и методы исследования. Задачи исследования решены с
применением микробиологических, физико-химических и молекулярно-
биологических методов исследования (ионообменная хроматография, SDS-
электрофорез, эксклюзионная хроматография, высокоэффективная жидкостная
хроматография, масс-спектрометрические и иммунохимические анализы).
Использованы также методы моделирования структур белков в программах
ClusPro и I-Tasser, оптимизированы возможные взаимодействия мономеров
РНКаз в процессе их димеризации. Для оценки потенциального
противоопухолевого действия исследуемых РНКаз применены методы анализа активности митохондриальных дегидрогеназ в культурах раковых и нормальных эпителиальных клеток. Полученные результаты обработаны стандартными математическими методами статистики.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработан универсальный метод выделения и очистки гомологичных РНКаз B. pumilus (биназы) и B. altitudinis (бальназы) из культуральной жидкости бацилл-продуцентов, позволяющий с высокой эффективностью получить гомогенные препараты ферментов;
-
Бальназа и биназа представляют собой природные димеры с открытыми каталитическими центрами мономеров. Стабильность бальназы снижена ввиду неспособности мономеров к обмену доменами, что связано с единственной аминокислотной заменой (Thr106-Аla106) в ее молекуле по сравнению с биназой;
-
Цитотоксическое действие бактериальных РНКаз по отношению к опухолевым клеткам коррелирует со стабильностью их димеров, которая связана с соотношением стабильных swapping-димеров и менее стабильных форм, образованных нековалентными связями;
-
Противоопухолевое действие биназы связано с ее прямым взаимодействием с ГТФазой K-Ras на поверхности опухолевых пневмоцитов MLE-12, приводящим к блокированию MAPK/ERK - сигнального пути и индукции апоптоза в опухолевых клетках.
Достоверность результатов проведенных исследований подтверждается высокотехнологичной современной экспериментальной базой, в основу которой легли многократные эксперименты, выполненные на высокоточном оборудовании; полученные данные представлены в виде статистически достоверных результатов, опубликованных в международных и отечественных научных журналах.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на
Всероссийской заочной научно – практической конференции с международным
участием «Микробиология в современной медицине» (Казань, 2013), Второй
ежегодной заочной научно-практической конференции, приуроченной к 200 -
летию Казанского государственного медицинского университета
«Микробиология в современной медицине» (Казань, 2014), XXI
Международной научной конференции «ЛОМОНОСОВ – 2014» (Москва,
2014), IV Международной научно-пратической конференции "Постгеномные
методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине" (Казань,
2014), симпозиуме «Биомедицина», посвященному 25-летию партнерства
между Казанским государственным университетом и Гиссенским
университетом им. Ю. Либиха (Гиссен, 2014), 7-й Республиканской конференции молодых ученых «Молодежь и инновации Татарстана» (Казань, 2015).
Место выполнения работы и личный вклад соискателя.
Представленная работа выполнена лично автором на кафедре микробиологии
Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского)
федерального университета. Научным руководителем совместно с
диссертантом определена основная цель исследования, поставлены задачи
исследовательской работы, сформулированы выводы. Автором диссертации
лично проанализированы и обработаны данные литературы, выполнены
лабораторные исследования, проведены анализ и статистическая обработка
полученных результатов. Материалы публикаций готовились и оформлялись
диссертантом под контролем научного руководителя. Масс-
спектрометрические исследования проведены на базе междисциплинарного центра геномных и протеомных исследований Казанского Федерального Университета. Эксперименты по взаимодействию биназы и ГТФазы Ras выполнены в рамках стажировки в лаборатории Института исследований сердца и легких им. Макса-Планка, г. Бад-Наухайм, Германия.
Связь работы с научными программами. Исследования выполнены в
рамках Российской Правительственной Программы повышения
конкурентоспособности Казанского федерального университета среди ведущих
мировых научно-исследовательских центров и поддержаны грантом
правительства Республики Татарстан (2015 г.), грантами РФФИ 16-34-00448мол_а «Сравнительный анализ геномов бацилл для определения генетических детерминант, обусловливающих сверхсинтез внеклеточных гуанилпредпочитающих РНКаз» (руководитель), РФФИ 15-04-07864_а «Секретируемые рибонуклеазы как фактор конкурентоспособности бацилл» (исполнитель), а также грантом Российского Научного Фонда № 14 -14-00522
«Природные димеры микробных рибонуклеаз: выявление и свойства» (исполнитель).
Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, среди которых 3 публикации в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации, 7 публикаций в научных журналах, входящих в перечень базы данных Scopus/WoS и 5 тезисов конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, выводов, заключения и списка цитированной литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 19 рисунков. Библиография включает 176 наименований.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему
научному руководителю академику АН РТ, д.б.н., профессору ИФМиБ КФУ
О.Н. Ильинской за неоценимую помощь при подготовке диссертационной
работы, ценные советы и всестороннюю поддержку. Автор благодарен
Ульяновой В.В. за обсуждение полученных результатов и внимательное
отношение к работе, профессору Гуилермо Баррето за предоставленную
возможность проведения экспериментов на базе своей лаборатории. Автор
благодарит А.П. Ложкина, Р. Шах Махмуд, В.И. Вершинину, А.Р. Каюмова,
П.В. Зеленихина, А.И. Колпакова, А.М. Зиганшина за поддержку и помощь в
работе. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам
Междисциплинарного центра коллективного пользования КФУ А.В. Лайкову, А.А. Тойменцевой, аспирантам кафедры микробиологии В.В. Ходжаевой и Ю.В. Сокуренко, а также всем коллегам-сотрудникам кафедры микробиологии КФУ за всестороннюю помощь и доброжелательную рабочую атмосферу.
Онконаза – РНКаза Rana pipiens с противоопухолевой активностью
Онконаза принадлежит к суперсемейству РНКаз А и состоит из 104 аминокислотных остатков. Молекулярная масса белка – 11820 Да, изоэлектрическая точка 9.7 [Ardelt et al., 1991]. N-концевой остаток в молекуле онконазы представлен пироглутаминовой кислотой, которая является неотъемлемой частью активного центра фермента, включая, также пять аминокислотных остатков: His10, Lys31, His97, Thr35 и Phe98 [Ardelt et al., 1991]. Пироглутаминовая кислота и дисульфидный мостик на С-конце делают онконазу чрезвычайно стабильным белком [Notomista et al., 2001], устойчивым к протеолизу [Arnold et al., 2006]. Ингибитор РНКаз млекопитающих не действует на онконазу, поскольку в последовательности фермента отсутствуют аминокислоты, ответственные за взаимодействие с ИР [Sevcik et al., 2002].
Онконаза связывается с плазматической мембраной клетки электростатически [Johnson et al., 2007] и проникает внутрь путем энергозависимого эндоцитоза [Haigis, Raines, 2003], опосредованного АР-2/клатрином [Rodriguez et al., 2007]. В цитозоле онконаза разрушает 28S и 18S рРНК, а также тРНК, что приводит к ингибированию трансляции [Wu et al., 1993]. РНКаза расщепляет тРНК между двумя гуаниновыми основаниями в последовательности UGG, присутствующие в структурно важных регионах: вариабельной петли или D-руки [Suhasini, Sirdeshmukh, 2007]. Небольшое количество расщеплений происходит также в GU и CU последовательностях. Кроме того, одной из мишеней онконазы является некодирующая РНК, которая участвует в контроле экспрессии генов путем РНК интерференции [Ardelt et al., 2003]. Показано, что обработка клеток онконазой останавливает сайленсинг глицеральдегид 3-фосфат-дегидрогеназного гена в клетках аденокарциномы легких человека А549, опосредованный миРНК [Zhao et al., 2008]. В клетках Hela индуцированная онконазой цитотоксичность инициирует каскад реакций, активирующих c-Jun N-концевую киназу (JNK), каспазу-9 и далее каспазы-3 и -7. Каспаза-8, или опухолевый супрессор р53, не участвуют в этом процессе [Lee, Raines, 2008]. In vitro, онконаза проявляет цитотоксичность по отношению к широкому спектру опухолевых клеточных линий, таких как: клетки глиомы крыс 9L, лейкемии человека К-562, аденокарциномы толстой кишки человека Colo 320 СМ, лейкемии человека HL-60, рака предстательной железы человека LNCaP и JCA-1, ободочной кишки человека НТ-29 и клетки лимфомы человека U937 [Ardelt et al., 2009]. В настоящее время, онконаза совместно с доксорубицином проходит III стадию клинических испытаний против злокачественной мезотелиомы легких человека [Ardelt et al., 2009]. 1.3 -Сарцин – высокотоксичная РНКаза гриба
Среди грибных риботоксинов особый интерес представляет токсин Aspergillus giganteus MDH 18894 - -сарцин. Риботоксин состоит из 150 аминокислотных остатков и принадлежит к группе 1 рибосом-инактивирующих белков [Olson et al., 1965]. Это наиболее значимый член семейства грибных риботоксинов, обладающий РНКазной активностью и классифицирующийся как циклизующая РНКаза. Аминокислотные остатки: His50, Glu96 и His137 участвуют в катализе [Lacadena et al., 1999]. -Сарцин проникает в клетки путем эндоцитоза и ингибирует биосинтез белка за счет расщепления фосфодиэфирной связи 28S рРНК, образуя так называемый -фрагмент, размером 0.4 кБ [Correll et al., 2004]. -Сарцин вызывает гибель клеток рабдомиосаркомы человека путем индукции апоптоза. Инкубация опухолевых клеток с -сарцином приводила к фрагментации ДНК, активации каспазы-3 и расщеплении поли(АДФ-рибозы)-полимеразы [Olmo et al., 2001].
Рибонуклеаза семенников быка - фермент с молекулярной массой 27218 Да и изоэлектрической точкой 10.3, представляет собой природный димер двух типов [Gotte et al., 2013]. В первом случае димеризация белка происходит за счет ковалентных взаимодействий между аминокислотными остатками Cys31 и Cys32, димеры второго типа образованы путем обмена N-концов -спиралей фермента [Gotte et al., 2012]. Олигомеризация BS-РНКазы опосредует цитотоксичность этого фермента, - лишь димеры, образованные за счет «swapping»-взаимодействий способны убивать опухолевые клетки [Gotte et al., 2013].
Апоптоз, запускаемый BS-РНКазой, связан с активацией каспаз-8 и -9 и подавлением экспрессии Bcl-2 в некоторых линиях карцином [Kotchetkov et al., 2001]. Показано, что фермент проникает как в нормальные, так и в малигнизированные клетки щитовидной железы и фибробласты [Bracale et al., 2002], а также проявляет цитотоксические свойства по отношению к раковым клеткам щитовидной железы [Antignani et al., 2002]. BS-РНКаза индуцирует апоптоз миелоидных клеток ML-2 и NB-1, NB-2 клеток нейробластомы [Marinov, Soucek, 2000]. Ввиду высокой селективности РНКазы к опухолевым клеткам тироидного происхождения in vitro, этот фермент был выбран в качестве лечебного средства против агрессивного тироидного рака [Spalletti-Cernia et al., 2003].
Выделение и очистка гомологичных РНКаз B. altitudinis и B. pumilus
В качестве продуцента РНКазы B. altitudinis использовали природный микроорганизм - B. altitudinis В-388, любезно предоставленный центром «Биоинженерия» РАН (г. Москва). В ходе работы исходный штамм Bacillus thuringiensis var. subtoxicus В-388 был переопределен как B. altitudinis В-388 в соответствии с международной классификацией микроорганизмов [Ulyanova et al., 2016]. Выделение и очистку биназы проводили на основе природного штамма-продуцента - B. pumilus 7P (ранее B. intermedius 7Р) [Ulyanova et al., 2016], полученного из Всероссийской коллекции промышленных организмов.
Бактерии культивировали при температуре 37С в шейкер-инкубаторе «INFORS HT Standard» (Швейцария) с интенсивностью качания 200 об./мин. на низко-фосфатной среде [Znamenskaya et al., 1999], содержащей (%): пептон, обедненный неорганическим фосфатом (Семипалатинский мясокомбинат) – 2, глюкозу – 1, CaCl2 – 0.01, MgSO47H2O – 0.03, NaCl – 0.3 и MnSO4 – 0.01; pH 8.5. Накопление биомассы анализировали на фотоэлектрокалориметре КФК-2 при длине волны 590 нм.
Для хроматографического разделения ферментов использовали ДЭАЭ-целлюлозу КМ-32 фирмы «Реанал» (Венгрия) и фосфоцеллюлозу Р-11 фирмы «Ватман» (Англия), которые готовили, как описано [Golubenko et al., 1979]. Выделение и очистку двух РНКаз проводили по одной схеме. Бактериальные культуры B. altitudinis и B. pumilus выращивали до достижения стационарной фазы роста, 28 и 24 часа соответственно [Schulga et al., 2000]. Культуральную жидкость бактерий подкисляли ледяной уксусной кислотой до рН 5.0 и центрифугировали при 6000 об/мин 30 мин на холоду. Супернатант разводили стерильной дистиллированной водой в 2 раза и пропускали через ДЭАЭ-целлюлозу, уравновешенную 10 мM Na ацетатным буфером, рН 5.0. После сорбции отрицательно заряженных белков на анионобменнике, полученный раствор наносили на колонку (50200 мм) с фосфоцеллюлозой Р-11, уравновешенной 10 мM Na-ацетатным буфером, рН 5.0. После сорбции РНКазы, катионобменник промывали 10 мM Na ацетатным буфером (рН 5.0) до значения А280 = 0.05 в промывных водах. Далее колонку уравновешивали 20 мМ Na-фосфатным буфером, рН 7.0. Элюцию белка проводили 200 мМ Na-фосфатным буфером, рН 7.0. Скорость элюции составляла 2 мл/мин. На каждом этапе выделения проводили отбор проб по 2 мл для контроля количества белка и каталитической активности фермента. Содержание белка определяли на спектрофотометре «Smart Spec» (Bio-Rad, США) при длине волны 280 нм. Удельную активность РНКазы рассчитывали как отношение суммарной РНКазной активности к количеству биомассы. Количественное определение активности рибонуклеаз проводили методом спектрофотометрического анализа продуктов гидролиза высокополимерной дрожжевой РНК [Anfinsen et al., 1954]. Фракции обессоливали и концентрировали с помощью картриджа Spin-X UF (Bio-Rad, США).
Жидкостную хроматографию быстрого разрешения проводили c использованием системы FPLC «BioLogic DuoFlow» фирмы (Bio-Rad, США) на колонке UNOS6 (1253 мм) (Bio-Rad, США). Белки элюировали в линейном градиенте концентрации NaCl от 0 до 1.0 М в 10 мМ Na 48 фосфатном буфере, рН 7.0. Элюцию белков проводили со скоростью 2 мл/мин
Рибонуклеазную активность в культуральной жидкости бактерий определяли по количеству кислоторастворимых продуктов гидролиза РНК модифицированным методом Анфинсена [Anfinsen et al., 1954]. Реакционную смесь, состоящую из 0.05 мл ферментного раствора, 0.25 мл РНК (1мг/мл) и 0.2 мл 0.25 М трис-НСl буфера (рН 8.5) инкубировали 15 мин при температуре 37С. Реакцию останавливали добавлением 0.1 мл охлажденного 0.75%-ного раствора уранилацетата в 25%-ой хлорной кислоте. После 10 мин. инкубации на льду осадок удаляли центрифугированием в течение 2 мин при 12000 об/мин 0.2 мл надосадочной жидкости разводили в 20 раз дистиллированной водой и измеряли оптическую плотность раствора при 260 нм на спектрофотометре «Smart Spec Bio-Rad» (США). В качестве контроля ставили пробы на поглощение субстрата (вместо фермента добавляли 0.05 мл дистиллированной воды) и на поглощение ферментного раствора (вместо РНК добавляли 0.25 мл дистиллированной воды). За единицу РНКазной активности принимали количество фермента, которое вызывает увеличение оптической плотности в опытных образцах, по сравнению с контрольными, на 1 оптическую единицу за 1 час инкубации в пересчете на 1 мл ферментного раствора – опт.ед./млчас. Активность фермента определяли по формуле:
Идентификация и оценка гомогенности полученных белковых препаратов РНКаз методами масс-спектрометрического анализа
С целью изучения свойств новой рибонуклеазы Bacillus altitudinis – бальназы и проведения сравнительного анализа структурных особенностей гомологичных РНКаз - бальназы и биназы (РНКаза Bacillus pumilus) проводили выделение и очистку ферментов методами ионообменной хроматографии. В качестве продуцентов белков использовали природные штаммы B. altitudinis B-388 и B. pumilus 7P. Известно, что секреция биназы начинается на 22-ой час культивирования микроорганизма, в период стационарной фазы роста, максимум накопления фермента в среде происходит на 24-26 ч инкубации [Знаменская с соавт., 1980; Знаменская с соавт., 1994]. Биосинтез биназы ингибируется добавлением в среду неорганических фосфатов [Знаменская с соавт., 1980], в связи с чем культивирование биназы и бальназы, как ее близкого гомолога, проводили на низко-фосфатной среде. Изучение динамики роста и биосинтеза бальназы показало, что фермент секретируется в начале фазы замедления роста культуры, максимальное накопление белка в среде происходит на 28-34 ч культивирования (Рисунок 1). Максимальное значение РНКазной активности в культуральной жидкости B. altitudinis составило 19700 опт. ед/млч на 30-ый час инкубации (Рисунок 1).
При выделении и очистке ферментов штаммы-продуценты культивировали до максимального накопления РНКаз в среде: B. altitudinis B-388 - 28 ч, B. pumilus 7P – 24 ч. Известно, что обе РНКазы заряжены положительно [Дементьев и др., 1992; Golubenko et al., 1979], в связи с этим в качестве матрицы для сорбции белков использовали катионообменники различной модификации. Динамика роста культуры клеток B. altitudinis и биосинтеза бальназы: 1 – оптическое поглощение культуры OD590; 2 – активность РНКазы, опт. ед/млч; 3 – скорость роста культуры (, ч-1 ); 4 – скорость накопления РНКазы (, ч-1 ).
На первой стадии очистки белки сорбировали на фосфоцеллюлозе Р-11 (Whatman, Англия) при рН 5.0. Предварительно культуральную жидкость обоих микроорганизмов пропустили через ДЭАЭ-целлюлозу, с целью очистки от кислых и слабощелочных белков. Ферменты элюировали 200 мМ Na- фосфатным буфером, рН 7.0. Выход белка по активности, для бальназы составил 75% со степенью очистки 273, для биназы – 76%, степень очистки – 135 (Таблица 3).
Для оценки степени гомогенности элюированных фракций РНКаз, полученных на первом этапе очистке, был проведен SDS-электрофорез в 15% ПААГ (Рисунок 2). Исследованию подверглись элюаты с максимальной удельной активностью. В ходе анализа примесные белки были обнаружены во всех опытных образцах (Рисунок 2). Таблица 3 – Стадии очистки РНКазы B. pumilus и B. altitudinis
Стадия очистки Удельнаяактивность,ед./А280 Степень очистки Выход белка по активности, % биназа бальназа биназа бальназа биназа бальназа Культур. жидкость 2353 1250 1 1 100 100 Элюция с фосфо-целлюлозы Р-11 316 667 340 909 135 273 76 75 ВЭЖХ 1106 1.2106 425 960 40 Рисунок 2 - Электрофоретический анализ биназы и бальназы на разных стадиях очистки ферментов: 1А - биназа после элюции на фосфоцеллюлозе (пиковая фракция); 2А – биназа после первого этапа ВЭЖХ; 3А – коммерческий препарат биназы. 1Б – бальназа после элюции на фосфоцеллюлозе (пиковая фракция); 2Б – бальназа после первого этапа ВЭЖХ. Концентрация белка в каждой лунке составила 10 мкг. Для получения гомогенных препаратов белков использовали систему высокоэффективной жидкостной хроматографии FPLC Biologic DuoFlow (Biorad, США), ферменты сорбировали на колонке UnoS6 (1253 мм). Элюцию РНКаз проводили в 10 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7.0, в линейном градиенте NaCl от 0 – 1.0 М. Выход обоих ферментов детектировали при концентрации NaCl – 0.18 М (Рисунок 3А, 3Б).
Хроматографический профиль биназы, полученный с использованием FPLC системы «Biologic DuoFlow». Белки элюировали при концентрации NaCl - 0.18 М.
Полученный хроматографический профиль образцов бальназы и биназы указывал на неоднородность белковых фракций. SDS-электрофорез выявил наличие двух белков с молекулярной массой 12 и 25 кДа в обоих элюатах РНКаз (Рисунок 2А, 2Б).
Хроматографический профиль бальназы, полученный с использованием FPLC системы «Biologic DuoFlow». Белки элюировали при концентрации NaCl - 0.18 М. Стоит отметить, что электрофореграмма коммерческого препарата биназы, используемого в качестве контроля, была идентичной электрофореграммам опытных образцов биназы (Рисунок 2A). Известно, что ассиметричность хроматографических пиков может указывать не только на наличие чужеродных белков, но и на возможность присутствия у белков олигомерных структур [Сапрыкин, 2006]. В связи с этим нами был проведен ряд исследований с целью идентификации обнаруженных после первого этапа ВЭЖХ белков.
Каталитическая активность пиковых фракций биназы и бальназы была определена методом зимографии. Было показано, что у биназы оба белка с молекулярной массой 12 и 25 кДа обладали рибонуклеазной активностью, тогда как у бальназы способность гидролизовать субстрат была обнаружена только у белка с молекулярной массой 12 кДа (Рисунок 4).
Моделирование структур димеров гомологичных РНКаз
Димеризация РНКаз - одно из интригующих свойств ферментов этого класса, привлекающих внимание ученых всего мира. В настоящее время известно несколько представителей РНКаз, выполнение функции которых, тем или иным образом, зависят от димеризации их молекул. Так, например, РНКазе L и хемоаттрактантному белку -1 моноцитов (MCPIP1) образование димеров необходимо для проявления их антивирусной активности [Garvie et al., 2013; Lin et. al., 2013]. Наиболее полно сегодня охарактеризована РНКаза семенников быка – природный димер, представляющий собой смесь димеров различного типа [Gotte et al., 2012]. Среди микробных РНКаз димеризация РНКазы T E. coli необходима для эффективного гидролиза РНК [Zuo, Deutscher, 2002]. РНКаза J Bacillus subtilis присутствует в клетке в виде димеров или гетеротетрамеров (2:2) [Mathy et al., 2010]. Считают, что димеризация служит своего рода переключателем между экзо- и эндорибонуклеотической активностями фермента [Zhao et al., 2015].
Наиболее известный представитель бактериальных РНКаз - биназа, на протяжении нескольких десятилетий рассматривалась исследователями исключительно как мономер, способный димеризоваться лишь в условиях кристалла [Mitkevich et al., 2013]. Образование димеров у биназы в растворе рассматривалось теоритически возможное, но только при высокой концентрации белка [Poliakov et al., 2010]. Для бальназы никаких данных, описывающих структурную организацию фермента, в литературе нет. В ходе проведенной нами работы впервые было показано, что биназа и бальназа представляют собой природные димеры, отличающиеся стабильностью димерных структур.
Первым экспериментальным доказательством димеризации биназы послужили белковые полосы размером 12 и 25 кДа, полученные при проведении SDS-электрофореза гомогенного препарата биназы, очищенного в ходе данной работы (Рисунок 8Б). Бальназа на SDS-электрофорезе представлена одним белком с молекулярной массой 12 кДа (Рисунок 8А).
Электрофорез в денатурирующих условиях обеспечивает разделение белков согласно значениям их молекулярных масс. Добавление денатурирующих агентов, таких как додецилсульфат натрия и 2-меркаптоэтанол, приводит к разрушению всех видов нековалентных взаимодействий между молекулами и разрыву S-S связей [Laemmli, 1970]. В связи с этим присутствие на геле любых олигомерных белковых полос указывает либо на ковалентную природу связи в этих молекулах, либо на неполную диссоциацию олигомеров в связи с нарушениями пробоподготовки образцов.
Первичная последовательность биназы не содержит серосодержащих аминокислот [Aphanasenko et al., 1979], а значит образование ковалентных дисульфидных мостиков между мономерами в молекуле РНКазы невозможно. Показано, что в условиях кристалла биназа димеризуется за счет водородных и гидрофобных связей [Polyakov et al., 2002], которые должны разрушатся во время SDS-электрофореза.
Особый интерес на данном этапе представляли результаты SDS-электрофореза бальназы, представленные, в отличие от электрофореграммы биназы, только мономерной формой белка массой 12 кДа (Рисунок 8A).
Биназа и бальназа – ферменты, обладающие высокой степенью гомологии, первичная последовательность двух РНКаз отличается лишь одной аминокислотной заменой: аланина (Ala106) бальназы на треонин (Thr106) у биназы [Дементьев и др., 1993]. Сравнение генов двух РНКаз выявило их большое структурное сходство. Уровень гомологии нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих зрелые белки, составляет 84.4%. Установлено, что замены нуклеотидов присутствуют в третьем положении кодона, что не влияет на аминокислотную последовательность белкового продукта. Нуклеотидные последовательности гена, кодирующие лидерный пептид, имеют замены нуклеотидов, изменяющие смысловое содержание кодонов [Schulga et al., 2000]. В связи с этим уровень гомологии лидерных пептидов составляет лишь 79%, что, скорее всего, связано с их большей мутационной изменчивостью. Анализ нуклеотидных последовательностей в областях, прилегающих к генам РНКаз, выявил и идентичную организацию хромосомных локусов бальназы и биназы [Schulga et al., 2000]. Такая высокая степень гомологии подразумевает идентичную структурную организацию двух РНКаз, однако, димеры бальназы, в отличие от биназы, в денатурирующих условиях полностью диссоциируют на мономеры (Рисунок 8).
Электрофорез в нативных условиях, обеспечивающий разделение белков согласно значениям их изоэлектрических точек и молекулярных масс, показал, что биназа и бальназа димеризуются в растворе (Рисунок 10). Белковые полосы, характерные для мономерных форм РНКаз, присутствовали на геле в следовых количествах. Эксклюзионная хроматография показала, что биназа в растворе присутствует только в димерной форме (Рисунок 12), хроматографический профиль бальназы указывает на возможность наличия мономерных структур у фермента, однако, практически весь белок в растворе димеризован (Рисунок 12). Димеры биназы отличаются высокой стабильностью, добавление сильнейших денатурирующих агентов, таких как 8М мочевина и 6М гуанидинхлорид, привело лишь к частичной диссоциации димеров (Рисунок 13), кроме того, показано, что после денатурации димеры РНКаз легко ренатурируют (Рисунок 12).