Введение к работе
з
Актуальность темы. Изучение молекулярных биохимических основ взаимодействия растений с ризосферной микрофлорой является одной из основных фундаментальных проблем почвенной микробиологии. Важнейшим направлением в этой области биологии является исследование механизма инфицирования корней растений ризосферними микроорганизмами.
Этап инфицирования при взаимодействии растений и микроорганизмов во многом обеспечивает эффективность процессов фиксации азота и биосинтеза фитогормонов бактериями в симбиотическом и ассоциативном ризоценозах. Молекулярные механизмы процесса бактериальной инфекции у растений частично изучены на симбиотических (бобово-ризобиальный симбиоз) и патогенетических моделях, в то время как данные о механизме более широко распространенной ассоциативной инфекции практически отсутствуют.
В отличие от патогенной и симбиотической инфекций при ассоциативном взаимодействии не наблюдается формирования фенотипических симптомов (внешних проявлений инфекции) - некротических зон и клубеньков. В процессе колонизации ассоциативные микроорганизмы не проникают внутрь клеток, а колонизируют поверхность корня и межклеточное пространство. Однако, в литературе практически отсутствуют данные о процессах, происходящих в этом ком-партменте при ассоциативной инфекции. Наименее исследованной областью формирования ассоциативного ризоценоза является изучение компонентов поверхности бактерий и их функций в обеспечении эффективности процесса колонизации растения-хозяина.
В ряде работ показана существенная роль бактериальных лнпополисахаридов (ЛПС) и гликолитических ферментов в процессах распознавания и инфицирования растения-хозяина, однако, их роль при ассоциативном взаимодействии остается неясной.
Представляется важным исследование внеклеточных белков, продуцируемых растением при бактериальной инфекции. Наибольший интерес среди них представляют гликозидазы и семейство гидроксипролинбогатых белков (ГПББ), обеспечивающих распознавание и адаптацию растения к бактериальной инфекции.
Цель її задачи исследования. Основной целью данной работы являлось исследование молекулярных механизмов , обеспечивающих распознавание и эффективную колонизацию корней пшеницы ассоциативными микроорганизмами рода Azospirillum. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать влияние колонизации ризосферными микроорганизмами
растений пшеницы на состав белков клеточных стенок корней.
-
Исследовать специфичность изменения содержания гидроксипролинбогатых белков клеточной стенки при ассоциативной инфекции и определить количественные проявления эффекта при инокуляции различными штаммами A.brasilense.
-
Исследовать влияние ассоциативной инфекции на спектр внеклеточных гликозидаз корней пшеницы.
-
Выяснить роль поверхностных полисахаридов A.brasilense в процессе инфицирования растения-хозяина.
-
Исследовать изменение спектра внеклеточных белков A.brasilense при взаимодействии с клеточной стенкой растения-хозяина.
Научная новизна работы. В работе впервые показано влияние ассоциативной инфекции на индукцию адаптивных реакций в корнях пшеницы. Установлено, что уровень накопления ГПББ в клеточных стенках корней носит штамм-специфичный характер, зависит от компетентности штамма ассоциативного микроорганизма и может служить количественным параметром для оценки эффективности колонизации корней при ассоциативной инфекции. Выявлено штамм-специфичное увеличение активности внеклеточных ферментов в корнях при ассоциативной инфекции. Показано, что ЛПС является одной из детерминант- распознавания микроорганизма растением и его участие в индукции биосинтеза внеклеточных белков растения и увеличении активности гликолитиче-ских ферментов. Показана индукция у азоспирилл специфичных внеклеточных поллпептидов под воздействием препарата клеточной стенки корней пшеницы. Выявлена индукция внеклеточных гликолитических ферментов микроорганизмов под воздействием компонентов клеточных стенок растения-хозяина.
Практическая значимость работы. Проведенные исследования создают основу для разработки методов количественной оценки эффективности ассоциативных взаимодействий по проявлению ответных реакций растений, что чрезвычайно важно при разработке и применении экологически чистых бактериальных удобрений, основанных на использовании ассоциативных азотфиксирующих микроорганизмов.
Особое значение имеет возможность установления количественных оценок компетентности различных штаммов по отношению к злаковым растениям и выявление основных детерминант - ЛПС и внеклеточных гликозидаз, обеспечивающих их распознавание растением. Эти результаты делают возможным целенаправленное создание штаммов ассоциативных микроорганизмов, сочетающих высокую азотфиксирующую активность и специфичность инфицирования и колонизации корней злаков, что необходимо для повышения эффективности бактериальных удобрений.
Разработанные автором методы исследования внеклеточных белков растеши и микроорганизмов используются при проведении плановых НИР в лабораторні биохимии ИБФРМ РАН. Кроме того, методики выявления и анализа полипепти дов и полисахаридов, специфических для ассоциативного взаимодействия, при меняются в исследовательской практике лаборатории физической химии клеточ ных структур (ЛФХКС) ИБФРМ РАН.
Материалы диссертационной работы нашли применение на кафедре биохимш и биофизики СГУ при подготовке спецкурсов "Методы препаративной биохи мии" и "Биологически активные вещества", а также при подготовке курсовых і дипломных работ.
На защиту выносятся следующие основные положения:
-
Разработка методов выявления и анализа внеклеточных белков растений і микроорганизмов, синтезируемых в процессе колонизации корней пшеницы ас социативными бактериями рода Aiospirillum.
-
Выявление индукции синтеза гидроксипролинбогатых белков и группы вне клеточных гликолитических ферментов в корнях пшеницы в ответ на колониза цию (инфицирование) Aiospirillum brasilense.
-
Обнаружение штаммовой специфичности в проявлении ответных реакций ; пшеницы, определяемой компетентностью штаммов Azospirillum к растению хозяину.
-
Выявление специфических внеклеточных полипептндов A.brasilense, синтезируемых в присутствии фрагментов клеточной стенки корней пшеницы.
-
Установление участия лнпополисахарида и индуцибельных гликозидаз A.brasilense в индукции адаптивных реакций растений при ассоциативной инфекции.
Работа выполнена в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в соответствии с планом НИР по теме: "Изучение молекулярных механизмов взаимодействия растений и микроорганизмов" (научный руководитель профессор В.В. Игнатов, N гос. регистрации 01890057691).
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на: VIII Eastern Europe symposium on biological nitrogen fixation-Nitrogenfix-92, Saratov, (Russia), 1992; Advanced research workshop on Azospirillum and related microorganisms, Sharvar, (Hungary), 1994; I-European nitrogen fixation conference, Szeged, (Hungary),1994; 9-ом Баховском коллоквиуме по азотфиксации, MocKBa,(Russia), 1995; 10-th International Congress on Nitrogen Fixation, St.Petersburg, (Russia), 1995; International Workshop on Associative interactions of nitrogen-fixing bacteria with plants, Saratov, (Russia), 1995; а также на отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ в отечественной и зарубежной печати.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 108 страницах, иллюстрирована 7 рисунками и содержит 4 таблицы. Список использованных литературных источников включает 165 наименований.