Научное обоснование совершенствования подходов к идентификации и молекулярному типированию Vibrio cholerae в системе микробиологического мониторинга Миронова Лилия Валерьевна

Введение к работе

Актуальность исследования. Ситуация по холере в мире в современный период седьмой пандемии остается напряженной в связи с постоянными эпидемическими осложнениями в эндемичных странах, межгосударственными и трансконтинентальными завозами возбудителя, в том числе и на ранее свободные от инфекции территории. С начала текущей пандемии ВОЗ зарегистрировано 7824934 случая заболевания в 171 стране мира [Онищенко Г.Г. с соавт., 2015; WER, 2016].

Резкий рост заболеваемости холерой в мире произошел в 2010-2011 гг. и был обусловлен крупномасштабной, связанной с завозом инфекции из Южной Азии эпидемией на о. Гаити и серьезными эпидемическими осложнениями в других странах Карибского бассейна [WER, 2011, 2012]. С 2012 г. прослеживается тенденция к снижению числа зарегистрированных случаев холеры, и в 2015 г. в ВОЗ поступила информация о 172454 заболевших в 42 странах мира [WER, 2013, 2014, 2015, 2016]. Наряду со снижением интенсивности эпидемического процесса в странах Карибского бассейна, в структуре заболеваемости холерой в мире увеличивается удельный вес африканского континента и наблюдается рост числа заболевших в странах Азии. В 2014-2015 гг. в азиатском регионе вспышки холеры протекали в Афганистане (103545 случаев), Ираке (4965 случаев), Индии (4920 случаев), на Филиппинах (4547 случаев), Пакистане (1218 случаев), Непале (1013 случаев). В октябре 2016 г. крупная вспышка холеры началась в Йемене, где по состоянию на 14 ноября 2016 г. зарегистрировано 4119 больных с летальностью 13 % [, Archive Number: 20161115.4627984]. Практически ежегодно регистрируются завозы холеры в страны Америки, Австралию, Азию и Европу, а в отдельные годы – на территорию Российской Федерации [Москвитина Э.А. с соавт., 2015; Титова С.В. с соавт., 2016 WER, 2013, 2014, 2015, 2016].

Широкое распространение холеры, вовлечение в эпидемический процесс новых территорий, высокие уровни заболеваемости и летальности на современном этапе седьмой пандемии являются результатом действия комплекса социально-экономических, природно-климатических, биологических факторов. В структуре биологических факторов, определяющих особенности течения эпидемического процесса при холере, большое значение имеет гетерогенность популяции и пластичность генома этиологического агента седьмой пандемии, что, вместе с наличием в эндемичных очагах оптимальных для реализации механизма горизонтального обмена генетической информацией условий, лежит в основе эволюционных преобразований возбудителя. Так, генетические изменения вибриона Эль Тор привели к трансформации его биологических свойств и, по сути, формированию в начале 90-х годов прошлого столетия нового атипичного варианта возбудителя холеры – Vibrio cholerae El Tor, обладающего способностью продуцировать холерный токсин классического типа, а позднее – варианта с дополнительной заменой в нуклеотидной последовательности гена холерного токсина классического типа [Safa A. et al., 2010; Chin C.S. et al., 2011]. Следует отметить, что изменения наблюдаются и в структуре островов патогенности, островов пандемичности холерного вибриона, профиле резистентности микроорганизма к антибактериальным препаратам [Grim C.J., 2010; Taviani E. et al., 2010; Reimer A.R. et al., 2011; Sjlund-Karlsson M. et al., 2011; Talkington D., 2011]. Указанные модификации генома V. cholerae El Tor явились причиной повышения патогенного потенциала возбудителя, что, вместе с сохранением им высоких адаптационных

свойств, определяет способность генетически измененных вариантов к широкому распространению и требует совершенствования системы молекулярно-генетического мониторинга для своевременного обнаружения и характеристики холерного вибриона.

Наряду с указанными тенденциями, вариабельность вибриона Эль Тор определяется и существованием эпидемически неопасных штаммов, выявляемых практически ежегодно в объектах окружающей среды в благополучный по холере период. Кроме того, в водной популяции микроорганизмов часто обнаруживаются вибрионы non О1/О139 серогрупп, являющиеся индикатором наличия оптимальных для жизнедеятельности холерного вибриона условий в экологической нише.

Все изложенное диктует необходимость разработки и внедрения эффективных
схем индикации, идентификации и молекулярного типирования V. cholerae для
совершенствования системы микробиологического мониторинга холеры,

установления путей завоза, закономерностей распространения и сохранения возбудителя, а также реконструкции филогенетических событий в процессе становления новых вариантов патогена.

Степень разработанности проблемы. Совершенствование

микробиологического мониторинга в системе эпидемиологического надзора за холерой определяется внедрением в диагностический процесс современных высокоинформативных технологий [Кутырев В.В., 2013; Онищенко Г.Г. с соавт., 2013, 2016; Шарова И.Н. с соавт., 2013]. В настоящее время основанные на амплификации нуклеиновых кислот методы детекции холерного вибриона успешно применяются при исследовании клинического материала, в то время как эффективность такого подхода на этапах бактериологического исследования в системе мониторинга вибриофлоры объектов окружающей среды в полной мере не охарактеризована. Кроме того, не определены методологические аспекты использования прямого белкового профилирования на основе MALDI-ToF масс-спектрометрии в схеме лабораторной диагностики холеры для ускоренной идентификации возбудителя, отсутствуют доступные базы данных референсных белковых профилей V. cholerae, не установлена диагностическая ценность метода и перспективы его применения в мониторинговых исследованиях вибриофлоры поверхностных водоемов.

Молекулярное типирование V. cholerae осуществляется с применением
широкого круга методов, заключающихся в амплификации отдельных участков
генома возбудителя, рестрикционном анализе, секвенировании определенных генов-
мишеней или полногеномном секвенировании. Вместе с тем для определения
эффективности использования отдельных подходов или их сочетания при проведении
эпидемиологического и филогенетического анализа необходима оценка

дискриминирующей, типирующей способности и эпидемиологической

конкордантности методов. Кроме того, открытым остается вопрос о стабильности используемых для типирования генетических маркеров, а также закономерностях и направлениях их изменчивости в стрессовых условиях пребывания холерного вибриона.

Полиморфизм биологических свойств вибриона Эль Тор отражается на разнообразии эпидемиологических проявлений холеры. При этом молекулярно-эпидемиологические закономерности холеры в Сибири и на Дальнем Востоке не охарактеризованы, в частности, не проанализирована структура популяции

V. cholerae по комплексу детерминант пандемичности, персистенции при разных эпидемиологических ситуациях, не установлена возможность завоза генетически измененных форм патогена на территорию. Учитывая известную гетерогенность генома циркулирующих в эндемичных очагах атипичных вибрионов Эль Тор [Lee J.H. et al., 2009; Safa A. et al., 2010; Kim E.J. et al., 2015], необходимо изучение состава и структурных особенностей организации генетических детерминант патогенности штаммов V. cholerae El Tor, изолированных при эпидемических осложнениях в Сибири и на Дальнем Востоке, а также разработка эффективной схемы генотипирования, позволяющей систематизировать и классифицировать генетически измененные варианты и проводить молекулярно-эпидемиологический анализ осложнений по холере. Доказанное волнообразное распространение холеры в мире в период седьмой пандемии с эволюционными преобразованиями возбудителя в районе Бенгальского залива [Mutreja A. et al., 2011] диктует необходимость проведения филогеографического анализа и определения места изолированных в регионе в период эпидемических осложнений штаммов V. cholerae El Tor на глобальном эволюционном древе патогена.

Применение комплексного подхода к анализу молекулярно-генетической структуры популяций вибриона Эль Тор на территории Сибири и Дальнего Востока позволит проанализировать закономерности развития эпидемических осложнений, механизмы появления, сохранения и микроэволюционных преобразований вибрионов в объектах окружающей среды, установить генетическое родство и возможные направления дивергенции отдельных клонов патогена.

Цель исследования: совершенствование микробиологического мониторинга и оценка популяционной гетерогенности V. cholerae на основе комплексного анализа особенностей структурной организации отдельных локусов генома, протеомного профиля и механизмов генетической трансформации возбудителя.

Задачи исследования:

1. Провести ретроспективный анализ ситуации по холере в России в современный период седьмой пандемии с углубленной характеристикой проявлений инфекции в сибирском и дальневосточном регионах на разных этапах пандемии.

2. Оптимизировать подходы к индикации и видовой идентификации V. cholerae на основании скрининга молекулярно-генетических детерминант и определения профиля константных белков микробной клетки.

3. Охарактеризовать вариабельность генома изолированных в Сибири и на Дальнем Востоке штаммов V. cholerae по комплексу мобильных генетических элементов, определяющих патогенность, пандемичность, персистентный потенциал, и проанализировать особенности организации детерминант патогенности генетически измененных вариантов холерного вибриона биовара Эль Тор.

4. Установить закономерности импортации генетически измененных клонов возбудителя холеры Эль Тор на территорию Сибири и Дальнего Востока по результатам полногеномного SNP-типирования.

5. Провести мультилокусный анализ числа вариабельных тандемных повторов в геноме штаммов V. cholerae О1 El Tor, изолированных в Сибири и на Дальнем Востоке при разных эпидемиологических ситуациях. Определить закономерности распространения V. cholerae отдельных MLVA-профилей в период осложнений по холере и в водных экосистемах на фоне эпидемиологического благополучия.

6. На основании макрорестрикционного картирования геномной ДНК охарактеризовать клональную структуру популяций холерного вибриона разной эпидемической значимости и провести ретроспективный молекулярно-эпидемиологический анализ осложнений по холере в Сибири и на Дальнем Востоке.

7. Оценить филогенетическое родство штаммов V. cholerae разной эпидемической значимости на основании определения нуклеотидных последовательностей группы генов «домашнего хозяйства».

8. Изучить в эксперименте стабильность комплекса генетических локусов V. cholerae в разных условиях пребывания микроорганизма.

9. Усовершенствовать алгоритм применения молекулярных методов в системе микробиологического мониторинга холеры.

Научная новизна работы. Проведена оценка эффективности внедрения
молекулярных технологий в систему лабораторной диагностики холеры. Показана
информативность применения ПЦР-скрининга с целью индикации детерминант
холерного вибриона в обогащенных пробах объектов окружающей среды.
Установлена высокая аналитическая и диагностическая ценность определения
таксономической принадлежности микроорганизмов рода Vibrio по профилю
константных белков микробной клетки на основе MALDI-ToF масс-

спектрометрического анализа.

Впервые установлен завоз на территорию Сибири и Дальнего Востока атипичных генетически измененных клонов возбудителя холеры Эль Тор, несущих классическую аллель гена субъединицы В холерного токсина. С применением разработанной схемы генотипирования измененных клонов V. cholerae El Tor по комплексу ассоциированных с патогенностью детерминант (ctxB, rstC, rstR, tbr, TLC) установлена дифференциация их на генотипы, коррелирующие с направлением завоза возбудителя. Показана целесообразность применения данной схемы типирования в эпидемиологическом расследовании случаев завоза инфекции, а также для анализа структурных особенностей генома измененных клонов вибриона Эль Тор.

Впервые по результатам полногеномного SNP-типирования показана принадлежность изолированных на территории Сибири и Дальнего Востока при эпидемических осложнениях в 1990-е гг. штаммов V. cholerae El Tor к кладам второй и третьей волн глобального распространения холеры, определены структурные особенности и вероятные источники завоза различных клонов возбудителя.

На основании макрорестрикционного картирования хромосомной ДНК, изучения числа вариабельных тандемных повторов и определения нуклеотидной последовательности генов «домашнего хозяйства» охарактеризована клональная структура популяций V. cholerae при разных эпидситуациях в Сибири и на Дальнем Востоке и дана оценка эффективности и значимости применения отдельных методов типирования в молекулярно-эпидемиологическом или филогенетическом анализе.

Впервые проведен молекулярно-эпидемиологический анализ осложнений по холере в регионе по результатам комплексной характеристики генетических локусов. Установлена клональность отдельных вспышек с формированием субклональных близкородственных вариантов патогена в период эпидемических осложнений.

Выявлены участки водных объектов сибирского и дальневосточного регионов,
в которых нетоксигенный холерный вибрион обнаруживается на протяжении ряда
лет, т.н. «участки риска», требующие комплексного подхода при организации и
проведении мониторинговых исследований. Установлена возможность

кратковременного закрепления (2-3 года) или длительной персистенции штаммов V. cholerae определенных MLVA-профилей в водных экосистемах на отдельных территориях с трансформацией генотипа и формированием близкородственных однолокусных вариантов холерного вибриона.

Впервые показано, что в экспериментальных условиях при воздействии неблагоприятных факторов среды возможна трансформация MLVA- и PFGE-профилей холерного вибриона при сохранении стабильности структуры генов «домашнего хозяйства». Установлено, что большей способностью к генетической изменчивости характеризуются геноварианты вибриона Эль Тор с классической аллелью гена субъединицы В холерного токсина.

Теоретическая значимость работы. Охарактеризованы молекулярно-
эпидемиологические механизмы возникновения и развития эпидемических
осложнений на неэндемичных территориях Сибири и Дальнего Востока,
заключающиеся в завозе сформированных в эндемичных очагах

высокоинфекциозных клональных вариантов возбудителя и возможной последующей дивергенции на близкородственные субклоны в процессе пребывания в объектах окружающей среды или при пассаже через восприимчивый организм в период вспышки.

На основании выявленных особенностей структурной организации генетически измененных вариантов V. cholerae El Tor на разных этапах седьмой пандемии высказана гипотеза о формировании новых клонов за счет трансформации Эль Тор-специфического СТХ профага и реорганизации сцепленных с ним генетических блоков.

Определены вероятные направления микроэволюционных преобразований холерного вибриона в процессе персистенции в водных экосистемах региона, выражающиеся в изменении MLVA-профиля с формированием однолокусных вариантов микроорганизма.

Выявлены закономерности адаптационной изменчивости и трансформации
генома холерного вибриона при воздействии неблагоприятных факторов
окружающей среды. Первичная реакция генома на стрессовое воздействие
преимущественно заключается в обратимой модификации по типу

дупликации/амплификации локусов, тогда как в более поздние сроки задействуются
механизмы более глубокой изменчивости. В неблагоприятных условиях среды,
наряду с формированием измененных субклонов, происходят последовательные
фенотипические адаптационные преобразования V. cholerae, в частности,

формирование «персистирующего» фенотипа, а в дальнейшем, при воздействии стрессовых условий, – переход в некультивируемое состояние с сохранением в популяции покоящихся форм вариантов возбудителя с исходными молекулярно-генетическими характеристиками.

Установлена эволюционная дистанцированность V. cholerae El Tor разной эпидемической значимости. На основании оценки особенностей организации генов жизнеобеспечения показано, что ctxAB^-tcpA⁺ варианты V. cholerae из окружающей среды являются самостоятельной клональной линией, демонстрирующей больший уровень гомологии указанных участков генома с эпидемически опасными штаммами холерного вибриона.

Теоретически обоснован комплексный дифференцированный подход к применению молекулярных методов в анализе структуры популяции V. cholerae,

выяснении закономерностей развития эпидемических осложнений и изучении филогенетической истории возбудителя.

Практическая значимость работы. Предложен и апробирован в рамках многолетнего мониторинга вибриофлоры поверхностных водоемов подход к ПЦР-скринингу видо- и серогруппоспецифических генетических детерминант холерного вибриона в обогащенных пробах из объектов окружающей среды.

Сформирована и интегрирована в программу MALDI Biotyper 3,0 панель
референсных масс-спектров V. cholerae, обеспечивающая возможность ускоренной
идентификации микроорганизма на основе MALDI-ToF масс-спектрометрии.
Разработаны методологические основы и алгоритм применения MALDI-ToF масс-
спектрометрии в лабораторной диагностике холеры, предусматривающий
дифференцированный подход к пробоподготовке с учетом потенциальной
биологической опасности исследуемого образца.

Разработана схема генотипирования атипичных вариантов V. cholerae О1 El Tor по комплексу ассоциированных с патогенностью возбудителя детерминант (ctxB, rstC, rstR, tbr, TLC).

Усовершенствован алгоритм применения молекулярных методов в системе микробиологического мониторинга холеры.

Разработанные и усовершенствованные подходы к идентификации и молекулярному типированию V. cholerae включены в нормативно-методические документы федерального уровня: Методические указания МУ 4.2.2870-11 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней» (Москва, 2011); Методические рекомендации МР 4.2.0090-14 «Использование методов полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (рибопринтинг, электрофорез в пульсирующем поле) для идентификации возбудителей I–II групп патогенности» (Москва, 2015); Методические рекомендации МР 4.2.0089-14 «Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) для индикации и идентификации возбудителей I—II групп патогенности» (Москва, 2015).

На основании результатов исследования подготовлены информационные письма «О ситуации по холере в Сибири и на Дальнем Востоке в 2013 г. и прогнозе на 2014 г.», «О ситуации по холере в Сибирском и Дальневосточных регионах в 2014 г. и прогнозе на 2015 г.», «О ситуации по холере в Сибири и на Дальнем Востоке в 2015 г. и прогнозе на 2016 г.».

Материалы диссертационной работы послужили основой для подготовки методических рекомендаций: «Типирование штаммов Vibrio cholerae методом мультилокусного анализа вариабельных тандемных повторов (MLVA)» (Иркутск, 2010); «Выявление и генетический анализ атипичных вариантов Vibrio cholerae El Tor» (Иркутск, 2011); «Молекулярное типирование Vibrio cholerae с использованием пульс-электрофореза» (Иркутск, 2011); «Алгоритм создания геоинформационной системы пространственного распространения возбудителей опасных инфекционных болезней (на примере г. Иркутска)» (Иркутск, 2014); «Алгоритм анализа результатов мультилокусного сиквенс-типирования» (Иркутск, 2015).

Результаты исследования вошли в учебно-методические пособия:

Практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» (Москва, 2013 г.); Руководство к практическим занятиям по лабораторной

диагностике холеры для врачей-бактериологов (биологов) и преподавателей (Иркутск, 2012); Учебно-методическое пособие по лабораторной диагностике холеры (Иркутск, 2014).

Практическая значимость исследований подтверждена созданными на основе полученных материалов базами данных: «Vibrio cholerae eltor. Сибирь и Дальний Восток» (свидетельство о регистрации № 2012620754 от 10.08.2012 г.); «Географическая информационная система Vibrio cholerae О1 и О139, г. Иркутск» (свидетельство о регистрации № 2015620466 от 10.03.2015 г.); «Белковые профили масс-спектров микроорганизмов I-II групп патогенности для программы MALDI Biotyper» (свидетельство о регистрации № 2016620345 от 15.03.2016 г.) и «V. cholerae. Сибирь и Дальний Восток – Амплификационный профиль_MLVA-генотип» (свидетельство о регистрации № 2016620904 от 1.07.2016 г.).

В Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» депонированы штаммы: контрольные для типирования по комплексу ассоциированных с патогенностью детерминант – V. cholerae El Tor В-6892, V. cholerae El Tor В-6893, V. cholerae El Tor В-6894, V. cholerae El Tor В-6895 (свидетельства о депонировании № 245, 246, 247, 248 от 26.10.2011 г.); V. cholerae El Tor В-7521 с генотипом ctxAB^-tcpA⁺ и уникальным числом повторов в локусе VcB (свидетельство о депонировании № 1 от 24.01.2014 г.); V. cholerae El Tor В-7595 – спонтанный мутант, утративший комплекс ассоциированных с патогенностью генетических блоков (профаг CTX – гены ctxАB, rstR; профаг RS1 – гены rstR, rstС; токсин-связанный криптический элемент – TLC) (свидетельство о депонировании № 48 от 25.02.2014 г.).

В международную базу данных GenBank депонировано 184 нуклеотидных
последовательности генов V. cholerae, в т.ч. 21 последовательность гена ctxB
(регистрационные номера HM345946, HM366176-HM366179, HM590452-HM590461,
HM595735-HM595740); 145 последовательностей генов «домашнего хозяйства»
(регистрационные номера KC290712-KC290722, KC306672-KC306693, KC311931-
KC311938, KP120556, KP863719-KP863735, KP872307-KP872318, KF381324-
KF381327, KF421814-KF421817, KF476604-KF476615, KF498628-KF498631,
KF500058-KF500065, KF540041-KF540046, KJ670164-KJ670177, JN411691, JN571738,
JN579649-JN579655, JN591379-JN591384, JN607476-JN607480, JN622162, JN622163);
78 последовательностей таксономически информативных генов 16S rRNA, rpoB
(регистрационные номера KM396324-KM396331, KM364536, KM209331-KM209333,
KM262182-KM262187). Драфт-геномы четырех штаммов V. cholerae El Tor
размещены в GenBank (регистрационные номера проектов: JPLT00000000,
LUCN00000000, JZCC00000000, LYXT00000000).

Научные и практически значимые материалы диссертационных исследований
включены в лекционные курсы дополнительного послевузовского образования при
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт

Роспотребнадзора.

Методология и методы исследования. В основе методологии исследования – комплексный молекулярно-генетический и молекулярно-эпидемиологический анализ на основании оценки ситуации по холере и результатов изучения группы генетических локусов и белковых паттернов V. cholerae. Кластеризация и оценка генетического родства и филогенетических взаимосвязей изолятов – по дистанционным алгоритмам и на основании байесовского анализа с определением

достоверности топологии дендрограмм посредством расчета апостериорной вероятности. Систематизация биологических свойств изучаемых штаммов V. cholerae и результатов генотипирования осуществлялась в базах данных на платформе Microsoft Access с интерактивным картографированием при использовании библиотек Leaflet и данных проекта mapbox.com.

Положения, выносимые на защиту:

1. Для современной ситуации по холере в России, в т. ч. в сибирском и дальневосточном регионах, характерна тенденция к снижению числа зарегистрированных случаев инфекции и обнаружение на фоне эпидемиологического благополучия нетоксигенных вариантов V. cholerae О1 и V. cholerae non О1/О139 преимущественно в «участках риска» водных объектов. В редких случаях в поверхностных водоемах обнаруживаются эпидемически опасные и потенциально эпидемически опасные изоляты V. cholerae О1 при отсутствии больных холерой на территории.

2. Внедрение в диагностический процесс молекулярно-генетической индикации детерминант холерного вибриона в обогащенных пробах из объектов окружающей среды и MALDI-ToF масс-спектрометрической идентификации морфологически сходных с V. cholerae культур обеспечивает повышение эффективности микробиологического мониторинга холеры.

3. При комплексном молекулярно-генетическом анализе однородные по наличию основных детерминант патогенности, пандемичности, персистенции и нуклеотидному контексту генов жизнеобеспечения популяции вибриона Эль Тор при эпидемических осложнениях в Сибири и на Дальнем Востоке демонстрируют гетерогенность по структуре ассоциированных с патогенностью геномных локусов, MLVA-, PFGE- и SNP-профилям с большей эпидемиологической конкордантностью данных пульс-электрофореза и SNP-типирования. Генетически измененные варианты V. cholerae О1 El Tor, послужившие этиологическим агентом эпидемических осложнений по холере в 1990-е гг., кластеризуются на группы в зависимости от периода пандемии, направления завоза возбудителя и относятся ко второй и третьей волнам глобального распространения инфекции, а в пределах одной вспышки популяция микроорганизма клональна с дивергенцией на близкородственные субклоны.

4. Изоляты V. cholerae О1 El Tor в благополучный по холере период
характеризуются присутствием «базового» набора генов, отдельных дополнительных
детерминант патогенности и необходимого для реализации адаптационного
потенциала комплекса генов. Значительный полиморфизм организации локусов
вариабельных тандемных повторов, проявляющих пространственно-временную
универсальность аллелей, и макрорестрикционных профилей, демонстрирующих
территориальную специфичность, свидетельствует о высокой гетерогенности водных
популяций холерного вибриона и вероятности микроэволюционных изменений при
персистенции V. cholerae в поверхностных водоемах, а также периодическом заносе
новых клонов микроорганизма в водные экосистемы.

5. PFGE- и MLVA-профили V. cholerae в процессе адаптации микроорганизма к
неблагоприятным условиям среды в эксперименте подвергаются трансформации,
обусловленной процессами дупликации/амплификации участков генома или
редукции, направленной на его компактизацию, что необходимо учитывать при
оценке результатов молекулярного типирования.

6. Алгоритм применения молекулярных технологий в микробиологическом
мониторинге холеры, усовершенствованный на основе системного анализа
информативности, дискриминирующей способности и эпидемиологической

согласованности комплекса методов, определяет дифференцированный подход к идентификации и типированию V. cholerae в рамках функционирования диагностической подсистемы эпидемиологического надзора за инфекцией и изучения закономерностей эволюции возбудителя.

Степень достоверности результатов исследования и апробация работы. О
достоверности результатов работы свидетельствует достаточный объем исследований
с применением современных, высокочувствительных и специфичных методов с
автоматизированным учетом и оценкой результатов, комплексным подходом к
молекулярно-генетическому анализу, применением различных технологий

конструирования дендрограмм и адекватных методов статистической обработки полученных данных.

Материалы, изложенные в диссертации, представлены и обсуждены на:

– Международных научных конференциях и конгрессах: 9^th International
Meeting on Microbial Epidemiological Markers (Wernigerode, Germany, 2010), 21^th
European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Milan, Italy, 2011),
22^th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (London, United
Kingdom, 2012), 23^rd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases
(Berlin, Germany, 2013), «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций»
(Санкт-Петербург, 2013), «Перспективы сотрудничества государств-членов

Шанхайской организации сотрудничества (ШОС) в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Сочи, 2015);

– Межгосударственных научно-практических конференциях: «Актуальные
проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в
области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств –
участников СНГ» (Ставрополь, 2010), «Современные технологии в

совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на ЧС в области
общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера»

(Саратов, 2012), «20-летие сотрудничества в области санитарии и карантина между РФ и КНР» (Харбин, 2014), «Достижения в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в государствах-участниках СНГ в рамках реализации стратегии ВОЗ по внедрению Международных медико-санитарных правил (ММСП) (2005 г.) до 2016 года» (Саратов, 2016);

– Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием: «Молекулярная диагностика – 2010» (Москва, 2010), «Окружающая среда и здоровье населения» (Иркутск, 2011), «Молекулярная диагностика – 2014» (Москва, 2014), «Актуальные вопросы обеспечения противоэпидемических мероприятий в зоне чрезвычайных ситуаций» к 80-летию ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (Иркутск, 2014);

– Х съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов и инфекционистов (Москва, 2012); II Национальном конгрессе бактериологов (Санкт-Петербург, 2016); на заседаниях Проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» (48.04) Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ (Ростов-на-Дону, 2005-2015) и совещаниях специалистов по вопросам совершенствования

эпидемиологического надзора за холерой (Ростов-на-Дону, 2011-2014);

– Межрегиональной научно-практической конференции «Этиологические,
эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней» (Иркутск,
2010); научно-практических конференциях – «От эпидемиологии к диагностике
актуальных инфекций: подходы, традиции, инновации» (Санкт-Петербург, 2014),
«Актуальные вопросы инфекционной патологии на Дальнем Востоке Российской
Федерации» к 90-летию ФКУЗ Хабаровский научно-исследовательский институт
эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора (Хабаровск, 2015); Региональном
обществе эпидемиологов и микробиологов (Иркутск, 2014); научных конференциях
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт

Роспотребнадзора (2010-2016).

Диссертационная работа выполнялась в рамках плановых научных тем:
«Экологические аспекты эпиднадзора за холерой на территории Сибири и Дальнего
Востока» (№ ГР 01.20.0013861); «Эколого-эпидемиологические и молекулярно-
биологические закономерности проявлений седьмой пандемии холеры в Сибири и на
Дальнем Востоке» (№ ГР 01201068); «Характеристика биологических свойств и
генетической организации холерных вибрионов, выделяемых из объектов
окружающей среды на территории Российской Федерации» (№ ГР 01201352135);
«Молекулярные основы персистенции, эпидемического и патогенетического
потенциала холерных вибрионов различного происхождения» (№ ГР 182-4-16), а
также тем НИР, выполняемых по Федеральной целевой программе «Национальная
система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-
2014 гг.)» и Отраслевой программе «Научные исследования и разработки с целью
обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения

инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» (2011-2015 гг.).

Публикации по теме диссертации.

Основные результаты исследований отражены в 65 печатных работах, в т.ч. 15 – в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации результатов диссертации, 6 – в зарубежной печати, двух коллективных монографиях, трех учебно-методических пособиях, одном атласе, а также четырех базах данных.

Объем и структура диссертации.