Введение к работе
Актуальность пробле м.ы.
Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний - один из основных факторов, обеспечивающих эффективность комплекса лечебных и противоэпидемических мероприятий (Самойлова с соавт., 1990; Наркевич с соавт., 1991; Анисимов с соавт., 1992; Айкимба-ев, 1992, 1994; Наумов, Самойлова, 1992; Беляев, Прохода, 1994 и
ДР-).
Результат лабораторно-микробиологического исследования, в свою очередь, зависит от номенклатуры и качества диагностических препаратов, применяемых для идентификации микроорганизмов - возбудителей различных заболеваний человека и животных.
В настоящее время предприятиями страны осуществляется выпуск многих диагностических сывороток, отвечающих современным требованиям к подобного рода препаратам. Однако постоянно расширяющиеся сведения о систематике микроорганизмов, их антигенных свойствах, о их роли в патологии человека, с одной стороны, и о свойствах антител - с другой, интенсивный поиск новых природных и синтетических соединений, обладающих высокой иммуностимулирующей активностью, требуют постоянного совершенствования технологии изготовления и повышения качества диагностических препаратов.
. Методы экспресс-анализов являются необходимыми для своевременного решения целого ряда эпидемиологических, эпизоотологичес-ких, микробиологических и других вопросов. В связи с этим остается актуальным совершенствование существующих и поиск новых высокочувствительных, специфичных, простых в выполнении, доступных широкому кругу исследователей экспрессных методов анализа. Среди них в настоящее время для избирательного концентрирования и обнаружения антигенного материала, в тем числе бактериальных клеток, широко применяют иммуносорбционные методы (Шаханина с соавт.,' 1969; Сербезов и др. 1973; Рыбкин, 1978; Закревский, 1980; Шимко, Леви, 1990 и др.). Дополнительные удобства и значительные преимущества перед общепринятыми методами появились с началом использования сорбентов с магнитными свойствами, которые используются в качестве твердой фазы для селективного концентрирования
- A -
на их поверхности различных антигенов и микроорганизмов (Smith, 1977; Lea et al., 1985; Пушкарь, Ефременко, Климова и др., 1985 и др.). Широкий диапазон объёмов исследуемых проб (от нескольких сот микролитров до многих кубических метров жидкостей), возможность исследования сильно загрязненных объектов позволяют проводить более качественную диагностику инфекционных заболеваний, а также значительно расширяют возможность "мониторинга внешней среды на наличие различных инфекционных агентов.
Магноиммуносорбёнтные диагностикумы (МИС) только начинают внедряться в практику отечественного здравоохранения, однако успешные экспериментальные разработки не завершились их промышленным изготовлением, что связано с существующими многочисленными сложностями приготовления этих препаратов, в том числе с использованием дорогостоящих импортных реактивов. В связи со сказанным, остается актуальным дальнейшее совершенствование технологии, основывающейся на отечественной базе химических реактивов. Это отразится не только на стабильности, но и на экономической эффективности производства МИС.
Конструирование различных. МИБП (лшинесцирующих, агглютинирующих, магноиммуносорбентных, иммуноферментных и других) неразрывно связано с получением высокоактивных, специфичных гиперим-ыунных сывороток, многие этапы технологии приготовления которых нуждаются з доработке и глубоком детальном изучении.
Одним из актуальных вопросов в этом ряду является создание технологии получения полигрупповых диагностических препаратов для одномоментного выявления нескольких инфекционных агентов, что'значительно ускоряет и удешевляет проведение иммунобиологических анализов.
Цель и основные задачи исследования.
Цель работы - совершенствование технологии получения высо-котитражных гипериммунных поли- и моновалентных сывороток и конструирование на их основе различных медицинских иммунобиологических диагностических препаратов (МИБП).
Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:
оптимизировать и унифицировать условия выделения водорастворимых антигенных комплексов, используемых в производстве МИБП;
изучить возможность замены (на этапе выделения антигенов) высоковирулентных производственных штаммов микроорганизмов на авирулентные или вакцинные;
разработать высокоэффективную производственную схему иммунизации животных-продуцентов;
изучить условия возникновения иммунологической ареактив-ности в процессе иммунизации животных-продуцентов;
получить экспериментально-производственные серии поли- и моновалентных диагностических люминесцирующих иммуноглобулинов;
разработать технологическую линию производства магноимму-носорбентных диагностикумов;
сконструировать технические устройства и разработать методические приемы для работы с магноиммуносорбентными диагности-кумами;
сконструировать диагностические магноиммуносорбентные тест-системы' для выявления и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.
разработать условия стабилизации диагностикумов магкоим-муносорбентных.
Научная новизна работы:
разработаны научно-методические подходы к повышению эффективности получения гипериммунных сывороток", используемых для производства различных диагностических иммунобиологических препаратов;
доказана возможность использования антигенных комплексов вакцинных и авирулентных штаммов (вместо высоковирулентных) в производстве различных диагностических препаратов;
новыми являются данные о значительном стимулирующем эффекте феракрила при иммунизации животных-продуцентов;
доказано, что специфическая иммунологическая ареактив-ность может наступить при иммунизации животных-продуцентов любыми антигенами, что необходимо учитывать в производстве МИБП;
разработаны научно-методические подходы к производству
иммуноглобулинов диагностических чумных, туляремийных, бруцеллезных, сапных, мелиоидозных, сибиреязвенных полигрупповых люми-несцирующих сухих;
разработан оптимальный вариант технологии изготовления микрогранулированных полиакриламидных магноиммуносорбентов;
впервые разработаны технические устройства для работы с диагностикумами магноиммуносорбентными;'
разработаны методические приемы для работы с диагностикумами магноиммуносорбентными;
впервые проведена научно-технологическая разработка диагностических магноиммуносорбентных препаратов нового поколения на основе композиционного органоминерального декстранокремнеземного носителя (КМИС), технология производства которых полностью базируется на отечественных реактивах;
впервые разработан способ стабилизации диагностикумов магноиммуносорбентных методом лиофильного высушивания.
Практическая ценность работы:
- разработан и внедрен в практику отечественного здравоох
ранения медицинский иммунобиологический препарат - иммуноглобу
лины диагностические чумные, сапные, мелиоидозные, туляремийные,
бруцеллезные, сибиреязвенные (антиспоровые) полигрупповые люми-
кесцирующие сухие. Составлена и одобрена Учеными Советами Став
ропольского и Волгоградского НИПЧИ нормативно-техническая доку
ментация (экспериментально-производственный регламент).
В соответствии с приказом Ш СССР N 314 с января 1988 г. в Ставропольском НИПЧИ развернуто производство препарата. С 1988 года приготовлено 22 экспериментально-производственных серии ди-агностикума. Решением Госкомсанзпвднадзора РФ (информация за N01-12/833-25 от 30.11.94 г.) иммуноглобулины диагностические полигрупповые люмннесцирующие включены в номенклатуру препаратов, по которой создаются запасы на случай возникновения эпидемических осложнений в Российской Федерации;
- разработана технология изготовления диагностикумов магно-
сорбентных на основе микрогранулированных нолиакриламидных сор
бентов чумного, туляремийного, бруцеллезного, сибиреязвенного
(антиспорового), холерного, сапного, мелиоидозного, гепатитного
А; утверждена Комитетом Госсанэпиднадзора РФ нормативно-техническая документация на диагностикумы магносорбентные чумной и туляремийный для ИФА и РИФ (регламенты производства, ВФС, инструкции по применению); Комитетом МИБП принято решение (протокол N7 от 24.11.94 г.) о внедрении этих диагностикумов в практику здравоохранения; утверждена "Инструкция по изготовлению и контролю тест-системы диагностической для выявления вируса гепатита А иммуноферментным методом" (протокол N 2 от 26.02.93 г. заседания Ученого Совета СтавНИПЧИ);
оформлена технологическая документация на устройства для работы с МИС, изготовлены промышленные образцы этих устройств, выполненные в виде компактных укладок;
приемы для работы с диагностикумами магносорбентными оформлены в виде методических рекомендаций "Использование магно-иммуносорбентов в иммунологических методах выявления корпускулярных и водорастворимых антигенов возбудителей инфекционных заболеваний (бактериологический, иммуноферментный, иммунофлуорес-центный)", утвержденных Комитетом Госсанэпиднадзора РФИапреля 1995 г.;
созданы диагностические тест-системы на основе композиционных МИС для обнаружения и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний (чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы (антиспоровые), сапа, мелиоидоза, холеры, дизентерии) в иммуно-ферментном методе и методе количественной иммунофлуоресценции;
составлена программа Госиспытаний тест-систем диагностических магносорбентных чумных, туляремийных, сибиреязвенных (антиспоровых), бруцеллезных, холерных (монопрепаратов) сухих для ИФА и РИФ, приготовленных по новой технологии. Нормативно-техническая -документация, утвержденная Ученым советом СтавНИПЧИ (протокол N 7 от 16.06.1995 г.),представлена на рассмотрение в Федеральную комиссию по МИБП, дезинфецирующим и косметическим средствам МЗ РФ.
Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах по первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям (Ставрополь, 1995 г.) и семинарах для практических врачей и научных работников Госкомсанэпиднадзора по при-
менению магносорбентных препаратов в диагностике инфекционных заболеваний и мониторинге внешней среды на наличие инфекционных агентов (Ставрополь, 1991-1995 гг.)
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Научно-методические подходы к повышению эффективности получения гипериммунных сывороток, используемых для производства различных диагностических иммунобиологических препаратов (люми-несцирующих, агглютинирующих, магноиммуносорбентных).
-
Повышение технологичности производства иммуноглоблуинов диагностических чумных, сапных, мелиоидозных, туляремийных, бруцеллезных, сибиреязвенных (антиспоровых) полигрупповых люминес-цирующих сухих.
-
Оптимизированный вариант технологии производства микро-гранулированных полиакриламидных магноиммуносорбентов (МИС).
-
Технология производства диагностикумов магноиммуносорбентных нового поколения на основе композиционного органомине-рального декстранокремнеземного носителя (КШС).
-
Технические устройства и методические приемы для работы с ыагноиммуносорбентами при выявлении возбудителей инфекционных заболеваний и их антигенов бактериологическим, иммуноферментным анализами и количественной иммунофлуоресценцией.
-
Диагностические магносорбентные тест-системы для ИФА и КИФА чумная, туляремийная, бруцеллезная, сибиреязвенная (антиспоровая), холерная, гепатитная А.
Апробация работы и публикации.
Основные результаты диссертационной работы были доложены и представлены на итоговой научной конференции (Ставрополь, 21-22 декабря 1989 г.); научной конференции (Омск, октябрь, 1993); межгосударственной научно-практической конференции "Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфегадионных заболеваний", посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (Ставрополь, 1994 ); научной конференции, посвященной 60-летию Иркутского противочумного института (Иркутск, октябрь, 1994 г); научной конференции Ставропольсісого отделения Российского научного общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Ставрополь,
февраль, 1995 г.); конференции Ставропольской сельскохозяйственной Академии (Ставрополь, апрель, 1995); рабочем совещании представителей противочумных институтов России, занимающихся разработкой и производством МИБП (Ставрополь, 16-18 мая, 1995 г.); первой конференции по биотехнологии Северо-Кавказского региона "Современные достижения биотехнологии" (Ставрополь, 1995); Международной научно-технической конференции "Пища. Экология. Человек" (Москва, 4-7 декабря 1995 г.).
Основные результаты диссертации изложены в 47 научных публикациях, 3-х заключительных отчетах, а также в 12 нормативно-технических документах (инструкции, ЭПР, ВФС).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5-ти глав, заключения, выводов и списка литературы. Она изложена на 327 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц и 33 рисунка. Список литературы включает 367 отечественных и 95 зарубежных литературных источников.