Введение к работе
Актуальность проблемы. Большие резервы в обеспечении почвы азотом сосредоточены в биологической фиксации атмосферного азота, в частности симбиотнческон, осуществляемой клубеньковыми бактериями в симбиозе с бобовыми растения* ми (Мишустин, Шильникова, 1973; Мишустин, 1979). Полноценное использование ризобнй зависит от понимания их взаимоотношений'с бобовыми растениями, умения управлять процессом жизнедеятельности симбионтов в естественных условиях и при производственном культивировании (Доросинскнй, 1970).
Клубеньковые бактерии характеризуются сложным циклом онтогенеза {Израильский с соавт,, 1933; Jordan, 1962). Знание этого цикла может облегчить управление их жизнедеятельностью. На полиморфизм рнзобий безусловно влияет двойственный характер их существования в природе — сапро-фитизм в отсутствии растения-хозяина и снмбпотрофнзм при его наличии. Кроме того, в почве и тканн растения-хозяина могут создаваться условия, требующие приспособительных потенций микроорганизмов. Это и колебания температуры, н воздействие продуктов метаболизма растений и почвенных микроорганизмов, и различных препаратов химической промышленности, все шире применяющихся в сельском хозяйстве. Являясь неспорообразукшимн, клубеньковые бактерии течі не менее выживают в условиях почвы, сохраняя жизнеспособность. В связи с этим можно предположить, что они должны иметь в онтогенезе формы, устойчнвые'к факторам воздействия внешней среды. Такой способностью к перенстенции обладают Л-формы бактерий, которые можно рассматривать как одну из форм сохранения вида в природе (Тимаков, Каган, 1973; Прозоровский с соавт., 1981).
Несмотря на упоминание отдельными авторами (Cabezas de Herrera, 1956; Яковлева, 1975) возможности существования Л-форм в цикле развития ризобнй, в литературе отсутствуют сведения о наличии у них процесса Л-трансформацин, не разработаны приемы получения Л-форм н не известны их свойства. Изучение процесса Л-трансформании у клубеньковых бактерий представляет интерес не только в плане познания
ЦЗГ.Т?, к:7ч:::і 6::-j-7^" - J
fact, г,д. 1.:.:л in/ з,
онтогенеза. Получение in vitro морфологически атипичных форм, характерных для отдельных этапов процесса Л-транс-формашш, может пролить свет на природу устойчивости рнзобнн к неблагоприятным условиям почвы, служить основанием рекомендаций приготовления эффективных бактерпаль-ных препаратов.
Разработка способов получения морфологически атипичных форм может позволить решать вопросы практического значения, например, такие, как уточнение способности к азот-фиксации искусственно полученных бактерондных форм, или такие, как выяснение устойчивости ризобий к фагам, которые, как известно, являются неблагоприятным фактором при производстве нитрагина.
Цель и задачи исследований. Цель работы — установление способности клубеньковых бактерий к процессу Л-траисфор-мацин под действием Л-трансформирующнх агентов в условиях in vitro.
Для выполнения работы были поставлены следующие за
дачи: *
-
Изучение влияния Л-трансформнрующих агентов на рп-зобнн и разработка способов получения морфологически атипичных форм, представляющих отдельные этапы процесса Л-трансформацнн.
-
Изучение культуральных, морфологических н анатомических свойств полученных in vitro морфологически атипичных форм рнзобнн и сравнение их с исходными культурами.
-
Анализ способности к стабилизации п реверсии морфологически атипичных форм клубеньковых бактерий в условиях чистых культур и при пассировании через растение-хозяина.
Научная новизна. Впервые в лабораторных условиях под действием Л-трансфорчирующих агентов получены различные морфологически атипичные формы рнзобнн гороха, люцерны, люпина. Установлено, что эти формы представляют собой отдельные этапы процесса Л-трансформашш. Разработаны способы получения морфологически атипичных форм рнзобий. С помощью методов фаэово-контрастной, электронной трансмиссионной н сканирующей микроскопии изучен характер влияния различных Л-трансформирующнх агентов и условий культивирования на культуральные, морфолого-анатомичс-ские и физиологические свойства ризобий. Отмечено, что все искусственно полученные формы отдельных этапов процесса Л-трансформации клубеньковых бактерий являются жизнеспособными вариантами, имеющими сходство с формами, существующими в природе. Изучен процесс инфицирования растений люцерны различными морфологически атипичными формами гомологичных рнзобнн. Проиедено сравнение впру-
лентных свойств морфологически атипичных форм и ннтакт-ных клеток ризобий люцерны. Рассмотрена способность к стабилизации и реверсии морфологически атипичных форм рнзо-бий гороха, люцерны, люпина.
Практическая ценность. Полученные результаты позволяют рассматривать явление Л-трансформации как процесс сохранения вида в природе, присущий не только патогенным, но и сапрофитным микроорганизмам в неблагоприятных условиях в почве. Разработанные способы получения морфологически атипичных форм клубеньковых бактерий гороха, люцерны, люпина рекомендуется использовать при изучении их онтогенеза в чистой культуре и почве. Поскольку морфологически атипичные формы ризобий, частично или полностью утратившие клеточную стенку, сохраняют вирулентность, не исключена возможность использования подобных форм при производственном культивировании в процессе приготовления бактериальных препаратов'.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на научных конференциях молодых ученых ВНИИ риса г. Краснодар (10—11 марта 1981 г.) и ТСХЛ (9—11 нюня 1981 г.), а также на совместном заседании кафедр микробиологии и агрохимии (27 октября 1981 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.
Объем работы. Диссертация состоит из 145 страниц машинописного текста, 13 таблиц, 23 рисунков. Список литературы содержит 407 наименований, в том числе 236 зарубежных авторов.
Использовали эффективные (эф.) и неэффективные (неэф.) штаммы клубеньковых бактерий коллекции культур ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Пушкин Ленинградской обл.): Rhizobium leguminosarum— штаммы 245а эф. и 224 6 неэф., Rh. meliloti — штаммы 34 эф., 441 эф. н L5-30 эф., Rh. lupini — штаммы 359 а эф. и 400 неэф. Штаммы быстрорастущих культур выращивали и хранили на бобовом агаре, медленнорастущих — на среде Н. М. Лазаревой (1953).
Неблагоприятные условия культивирования, вызывающие гетероморфний рост бактерий (Пешков, 1954), создавали на среде Исварана (Iswaran et al„ 1973) и Кларка и Мальфа (Clark, Maalfe, 1967) путем снижения парциального давления кислорода, изменением температуры культивирования н истощением среды. Определение оптимальных для Л-трансформации рнзобнй условий культивирования осуществляли на среде Исварана (1,3% агара) с добавлением нормальной лошадиной сыворотки в дозе 4% и NaQ в дозе 2,5%. В ка-
. 3
честве Л-индукторов использовали пенициллин в концентрациях 100, ISO, 200, 2Г)0, 500 и 1000 Ед/мл и антибиотики, встречающиеся в почве (неомицин, стрептомицин, мономицин, тетрациклин, пенициллин, левомнцетни, эритромицин), а также глицин в широком диапазоне концентрапиft от 4% до 0,01%.
Формы несбалансированного роста получали путем длн-,тельного'(в течение 1 мес.) культивирования на среде Исва-рана с добавлением глицина в дозе 0,1% и градиента концентраций этой аминокислоты (0—0,3%). Для получения сфероид астоподобных форм использовали методы Вейса (Weiss, 1976) в модификации О. В, Филатовой (1980), Кона (Kohn, 1960) и Мейера (Meyer et al., 1961) в модификации С. Я. Дн-тяткнна (1965) с последующим высевом на среду Кларка и Мальфа (0,6% агара) с градиентами концентраций пенициллина'(0—100 Ед/мл), глицина (0— 03 %), лнзоцнма (0— 100 мкг/мл), NaCl (0—0,5%) и сыворотки (0—10%). Незавершенные Л-формы получали на среде Исварана с добавлением глицина в дозе 0,1% и сменой температур культивирования (первые две недели при 28*, две последующие — при 4С). Зернистые формы получали путем пассирования в жидкой среде Кларка и Мальфа с добавлением последовательно возрастающих концентраций глицина (от 0,05 до 1,0%), как на фоне сыворотки (10%) и NaCl (0,5%), так и без них. Фильтрующиеся формы получали фильтрацией суспензии культур через бактериальные фильтры (поры 0,3 мкм).
Вирулентность морфологических вариантов ризобії и люцерны (штамм 441) определяли в стерильном лабораторном опыте с растениями люцерны Medicago sativa. Стерилизацию осуществляли по Натману (Nutman>1949). Проростки иноку-лировалн из расчета 20—30 тыс. клеток ризобнй (определено методом посева) на одно растение (Калниньш с соавт., 1973). Опыт (5-кратная повторность) проводили на среде С. Л. Ков-ровцевой (1933) под ксеноновими лампами при длине светового дня 16 час на кафедре микробиологии ТСХЛ. О вирулентности исследуемых форм судили по сроку появления и количеству специфически искривленных корневых волосков и образовавшихся клубеньков.
Определение азотфнксирующей активности морфологически атипичных форм клубеньковых бактерий люцерны (штамм L5-30) осуществляли ацетиленовым методом (Калининская с соавт. 1973).
Культуральные и морфологические признаки ризобий на разных этапах Л-трансформации исследовали с помощью фа-зово-контрастной микроскопии. Изучение структурной организации осуществляли путем приготовления и просмотра препаратов целых клеток (Бирюзова с соавт., 1963) и ультратон-
кнх срезов (Константинова с соавт., 1975) морфологически атипичных форм рнзобнй с помощью электронного микроскопа JEM-100B при инструментальном увеличении .30000. Наблюдения за поверхностью и формой клеток проводили методом сканирующей электронной микроскопии на микроскопе «Jeol (JSM-50A)» и «Hitachi».