Моноклональные антитела к поверхностным антигенам чумного микроба Бичуль, Ольга Константиновна

Введение к работе

Актуальность темы. Несмотря на то. что чума в современных условиях не имеет значительных эпидемических проявлений, существование обширных природных очагов в. различных регионах земного шара, в том числе на территории нашей страны, сохраняет опасность заражения "людей чумной инфекцией. Для своевременного проведения в природных очагах чумы первичных противоэпидемических мероприятий, направленных на снижение вероятности заражения человека и исключения антропоноэиого распространения инфекции, больаюе значение имеет раннее выявление возбудителя чумы, а также меры профилактики среди населения. С этой цельп разрабатываются различные диагностические и вакцинные препараты Шалецкая О.В.. 1987; Тениралиева Г.А.. 1988; Marschail G.C.. 1974; Mayer К.К.. 1974; Reisnan R.E.. 1970).

Особое внимание при создании диагностических препаратов уделяется изученио поверхностных структур чумного микроба, так как серологическими исследованиями установлено . что к ним относится большая часть видо- и группоспецифических антигенов (Анисимов П.И.. 1985; Пустовалов В.Л.. 1986; Butler Т.. 1983). Серодиагностика возбудителя чумы, в настоящее время, главным образом, базируется на обнаружении поверхностного капсульного антигена ( FI ) или же антител к нему,выявляемых в сыворотках животных. Однако хорошо известно, что наличие капсульного антигена на поверхности микробной клетки не является постоянным признаком, так как зависит от температуры культивирования возбудителя, наличия 65 МД рУТ плазмиды и ряда других факторов (Орлова Т. М.. 1963: Burrows Т. W., 1962). Кроме того, в природных очагах чумы наряду с типичными капсулообразующими штаммами нередко выделяются бескапсульные варианты чумного микроба, что создает определенные трудности при их диагностике ( ИетлинВ.Н., 1970; Кондраикина К. И., 1971; Бибякова В.А.,1972). В последнее время появились также сообщения об обнаружении FI у других микроорганизмов и антител к нему в сыворотках животных не контактировавших с Y.pestls (Басова Н.Н.. 1982; Маре-ев В.И., 1982; Анисимов П.И., 1983;Апарин Т.П.. 1989). Обычно это объяснялось неточной идентификацией чумного микроба или возможной его гипердиагностикой. Однако сравнительный анализ специфичности

капсульного антигена и препаратов, выделенных аналогичными методами из природных штаммов других представителей сеиейства Enterobacterlaceae. позволил выявить общую для некоторых энтеро-бактерий антигенную детерминанту с ишунохимическими свойствами FI (Косее Л. В.. 1992). Это обстоятельство, как считай авторы, также может ограничить использование антикапсульных диагностику-мов для обнаружения возбудителя чумы.

Существующие в настоящее время диагностические препараты, созданные на основе других поверхностных антигенов чумного микроба, в отличие от антикапсульных, позволяют выявить типичные и атипичные формы возбудителя, однако не дифференцируют его с другими близкородственными микроорганизмами (Дьяков СИ.,1972; Щербаков А. Л., 1984: Баканурская Т. П.. 1992).

Связанные с диагностикой чумы трудности определяют необходимость поиска новых поверхностных видоспецифических антигенов с целью создания на их основе гест-систем, позволяющих выявить возбудитель чумы независимо от его способности синтезировать FI.

Наряду с диагностической значимостью исследование поверхностных антигенных субстанций весьма перспективно в плане изучения иммуногенеза при чумной инфекции и выявления антигенов, стимулирующих защитные реакции макроорганизма, так как известно, что в целом иммуногенность микробной клетки, определяется не только иммунохимическими свойствами входящих в ее состав специфических антигенов, но и степенью их доступности для распознающих систем макроорганизма (Ляиенко В.В.,1982).

Таким образом, дальнейшее изучение поверхностных антигенов чумного микроба представляет определенный интерес в плане создания диагностических препаратов, а также определения роли антигенов возбудителя чумы и антител, полученных к ним.' в развитии инфекционного процесса при чуме. Для решения этих вопросов в настоящее время требуется привлечение новых методов исследования. Одним из наиболее перспективных направлений в этом отношении является гибридомная технология,открывшая новые возможности для выполнения исследований подобного рода.

Цель работы. Получение коллекции моноклональных антител к поверхностным антигенам чумного микроба, изучение их функциональных свойств, выявление и использование видоспецифических моноклональных антител для диагностики типичных и атипичных штаммов

Y.pestls и дифференциации их с другими представителям семейства Enterobacterlaceae. Задачи работы:

1. Разработать (оптимальные условия получения гибридом, сек-ретирущих ыоиокяомальные антитела к поверхностным антигенам чумного микроба.

2. Создать коллекции гибридом, стабильно вырабатывающих мо-ноклональные антитела к антигенным детерминантам поверхностных структур возбудителя чумы.

3. Охарактеризовать свойства полученных моноклональных антител, определить их антигенную направленность, исследовать активность МКА в различных серологических реакциях, изучить иммунобиологические свойства моноклинальных антител в условиях "In vivo" и "in vitro".

4. Изучить эффективность использования коллекции МКА для выявления типичных и атипичных штаммов чумного микроба независимо от их способности синтезировать капсульний антиген.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. В результате проведенных исследований получен набор гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к поверхностным антигенам Y.pestls.

Получено две группы гибридом, секрегирующих. ИКА IgG и IgH, выявляющие видоспецифические и родоспецифические , детерминанты, экспрессированные на поверхности микробной клетки возбудителя чумы, а также гибридомы . продуцирующие МКА к эпитопам, обусловливающим перекрестные реакции с близкородственными микроорганизмами.

Установлено, что I группа ИКА выявляет поверхностный антиген чумного микроба, представленный в иммуноблоттинге двумя зонами,, соответствующими фракциям с М.м. 23 000 и 46 000 Д. Вторая группа МКА направлена к антигену FI возбудителя чумы.

С помощью полученных МКА проведен антигенный анализ типичных м атипичных музейных штаммов чумного микроба, .выделенных в природных очагах чумы, а также штаммов, полученных в генетических экспериментах.

Установлено, что МКА к FI чумного микроба с большей эффективностью, чем существующие коммерческие диагностикумы, выявляют антиген FI. а также штаммы, синтезирующие калсульный антиген, как. ,при 37 С, так и при 28 С.

Определено, что МКА I группы выявляют бактерии возбудителя чумы, выраженные при 37 С и 28 С, независимо от плазмидного состайа, способности синтезировать капсульный антиген, а такие фазы диссоциации.

Показана возможность с помоцью ИКА I группы проведения дифференциальной диагностики типичных и атипичных штаммов чуішого микроба, выращенных при 28 С, с другими близкородственными микроорганизмами, включая У.pseudotuberculosis.

Установлено, что количество данного антигена, синтезируемое на поверхность микробной клетки, зависит от фазы диссоциации возбудителя, его инвазипности, а такае температуры выращивания.

Изучена функциональная активность МКА, направленных к различны!.! антигенам чумного микроба. В опытах "in vivo* получены даннае. указывающие на способность МКА в комплексе с антигеном оказывать модулирующее действие на иммунный ответ. В опытах "in vitro" показано,что стимуляция защитных свойств макроорганизма происходит за счет индукции ишунокомплексом МКА-антиген иммунного ответа лимфоцитов, а такае снияения антифагоцитарных свойств микроорганизма.

Изучен эффект совместного действия МКА различной специфичности. Установлено, что смесь разных ИКА обладает большей активностью, чем каждое МКА в отдельности. Показано, что эффект про-тективности зависит от специфичности и концентрации НКА.

Практическая ценность работы. Полученная коллекция стабильных гибридных культур, продуцирующих МКА к поверхностным антигенам Y.pestls, использована в качестве источника стандартных моноспецифических иммуноглобулинов для разработки усовершенствованных диагностических препаратов.

Получены и испытаны диагностические препараты МКА, конъюги-рованные с ФИТЦ для диагностики и идентификации пташов Y.pestls. синтезирующих капсульный антиген. Полученные препараты . в отличие от существующих коммерческих, обладают большей чувствительностью и позволяют выявлять штанмы чумного микроба со сниженной продукцией PL

Получены и испытаны диагностические препараты МКА для выявления штаммов чумного микроба независимо от их плазмидного.состава, температуры культивирования и способности синтезировать капсульный антиген. Показана возможность использования их для диффе-

ренциации ыетодом непрямой иммунофлуоресценции возбудителя чумы с другими представителями семейства Enterobacterlaceae при температуре культивирования 28 С.

Результаты исследований легли, в основу "Методических рекомендаций по использованию моноклональных антител для выявления типичных ^чи атипичных штаммов чумного микроба и дифференциации их с другими представителями семейства Eaterobacterlaceae". утвержденных Ученым Советом Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института 31 июля 1992 г., протокол N 11; "Научно-технической документации по изготовлению и контролю .набора моноклональных антител к антигену FI Y. pestls для использования в иммунологических реакциях", утверндекная Ученым .Советом Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института 25 декабря 1991 г.. протокол N 16.

Испытания препаратов на основе МКА проведены на базе Ростовского и Волгоградского научно-исследовательских противочумных институтов.

Препараты МКА используются в научно-исследовательских разра
ботках различных лабораторий Ростовского-на-Дону противочумного
института. ~ _ч

Гибридные клеточные линии ГЧ-В8/Е5^хи Е6/Н8-ГЧ, синтезирующие ионоклональные антитела соответственно к антигену FI и поверхностному антигену чумного микроба, синтез которого не зависит от температуры культивирования и плазмидного состава штаммов, депонированы во Всесоюзной Специализированной коллекции перевиваемых клеточных культур под номерами ВСКК(П) 384Д и ВСКК(П) 434Д.

Основные положения, выдвигаемые на защиту:

5. Гибридомы, полученные путем соматической гибридизации иммунных спленоцитоэ с клетками ыиеломы мыши, продуцируют моноклинальные антитела к поверхностным структурам чумного микроба, обладающих различной специфичностью: I группа МКА выявляет поверхностный антиген чумного микроба , синтез которого не зависит от температуры культивирования и плазмидного состава штаммов, II группа направлена к FI возбудителя чумы.

6. МКА I группы выявляют калсульные и бескапсульные формы' чумного микроба, выращенные при 28 С и 37 С. независимо от их плазмидного состава и фазы диссоциации.

7. С помощью МКА I группы Е6/Н8. G11/F5 зозможно проведение'.

дифференциальной диагностики типичных и атипичных штаммов чумного микроба с другими близкородственными микроорганизмами при температуре культивирования 28 С методом непрямой иммунофлуоресцен-ции.

4. МКА II группы, полученные к капсульному антигену возбудителя чумы, с большей эффективностью, чем существующие коммерческие диагностикуиы. выявляют антиген FI в культурах, выращенных как при 37 С. так и при 28 С, что позволяет использовать их для обнаружения штаммов чумного микроба со сниженной продукцией капсульного антигена.

5. В опытах "In vivo" и "in vitro" установлена способность Шк в комплексе.с антигеном оказывать влияние на кинетику иммунного ответа.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на научных конференциях молодых ученых РПЧИ в 1988 и 1991 п\. на Бессоюзных семинарах по МКА в 1988 и 1989 гг.. Ростов-на-Дону; на Всесоюзной научной конференции "Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций". Оболенск, 1989 г.: на 2-й Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов", Москва. 1990 г.: на 1-м съезде иммунологов РСФСР. Новосибирск. 1992 г.: на Всесоюзной научной конференции "Организация эпиднадзора при чуме и меры ее профилактики", Алма-Ата, 1992 г.. Материалы диссертации обсундены на общеинститутской конференции РПЧИ в 22 июня 1993 г.

Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации отражены в 11 опубликованных научных работах.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 186 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего работы 117 отечественных и 130 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 6 рисунками, 22 таблицами и 4 фотографиями.