Моноклональные антитела к О-антигену возбудителя холеры Бурлакова, Ольга Спартаковна

Введение к работе

Авгаальнооть темы. Проблема холеры,^- особенно оотро ios-яявшал в начале 7-й паядемдд, яе утратила овоей автуал*ноотя до настоящего вреыевя. Високая вчболвьземоогь продолжает ежегодно регяотряроватхоя в 20-30 отравах ыяра (Г.М.Медвповяй, 1989; С.М.Нухаыедов, В.Г.Свредяя, 1990; Бел, ВОЗ, 1969-1992).

Холера проодвла яа вое воятдяеяты я вызвала тан вошиві я опядення различной ингевоявностя. Это объяанявтоя зяачятелі-ним увеляченявм ш последнее деоятилотял овязвЯ меж^у государствами, небывалим до этого объемом международной миграция яа-оеленяя, яятеяоявяим загрлзнаняеы оврухаощев ореды, прежде воего гидросферы, что г вонечпом итоге обусловило увалячеПЯ9 потенцдалмой воаыожноотя заражения ладей при заново холеры. За время последней павдемял холера яеодновратно аааоаалао» в Японяо, Аягляп, Нападу, Авотрло, СНГ, Чехооловавяо я другяе отраш. Рооояя поддерживает яятеяоявпые ввояомячесйяе я нулв-туряые овлэя оо отраяамя Юго-Вооточяой Азия, Индия, Афряв», Бллжяего я Среднего Booтона, что воздает реалмуп угрозу заяо-оа холеры в нашу ограяу. Поэтому в СНГ постоянно проводятоя значительный объем мероприятий, направленных яа предупреждеиве ванооа я раопроотрананвл отого особо опасного заболевания. Средя яях одно яа первых ыеот занимает овоевремеяная дяагяоо-тдва холеры.

Для дяагяоогячеовях лабораторий но толио огечеогвеяяых, во я зарубежных необходимы вноовоначеотвеяяы* оиецифачвовяе препараты для диагпоотива я идеятяфивации возбудителя холеры. Коымерчеовяе вддо- ж тяпоопеодфичеовяе поллвлоаалышв оыворот-яя, используемые для оерологячеовях рвавгаб, обладают рядом яедоогатвов, оредя воторых оояовяыня являютоя ямзвяе тптры дяагпоотячеояях препаратов, неполная воопроизводямоот* я гете-

рогеяяооть оывороточных иммуноглобулинов, обусловливающая по-ревроотнуп реаятиЕнооть о блязвородствеяшмя ыиярооргани8мамя, что существенно свняаег вероятность обнарухеиия холерного вибриона в яооледувмок материале < i.Y.Dor-ovnn , I982j J.c.roo-ley, I969j s.u.win'Uo . 1972). Следует оообо подчерянуть, что возбудитель холеры хараятерлвуегоя вкракенной изменчивостью» что тавхв затрудняет правильную и бкотрую диагноотяяу в той ия-фввцпи я отражаетоя на эсГ?«ктявяостя профилаитячеових я проти-ноэпвдемичеових мероприятия.

Преодоление указанных препятствий возможно при использовании молоопецифачеояих иммуноглобулинов. Пути в оозданяв . теот-одотем нового появления для диагноотявя я ядентифияация возбудителя холеры отярыаапт успехи я облаотя гибридоыной технология (Р.В.Петров, 1982; А.С.Новохатовий, 1983; s.Chooh , л.и.ошарЪвИ * Z986). В доотушой литературе представлены отдельные работы зарубежных яаоледова гелей, в яоторнх опяоано получение ЫКА в антигенам холерного вибриона 01 группы я использование их в оеродиагяоотявв (B.GuatafBoon , 1984; T.Ito, Т. tokota 1987} zhu Zon t Shu-bo Ziiane, 1988).

В 1986 г. во время впидешш холеры я Бангладеш в полевых условиях были иопытаны вольететы ыоноялоналышх антител в ЛИС холерных вибрионов о язотиоцианатом ^шоореоцена для обнаружения ВОЗбуДИТеЛЯ ХОЛеры В ПИТЬеВОИ И РОЧНОЙ ВОДЄ ПООЛЄ Я0НПЄНГ-

рирования и подращивания я яапопительяоЯ ореде. Полученные данные флвореоцеятяоЯ «щвроояодия о помощью МКА во воех олуча-ях полноотыэ оовпадаля о результатами более трудоемяих традиционных ЫетОДОВ ( I'.IUBrayton. Ы.Ь.Таг plin» 1987). С ПОМОЩЬЮ

ИФЛ о моноялональяыия антителами» опецифечнши я холерному товоияу, товоин был обнаружен в пробах отула холерных больных.

- б

Дроби балл доотавлеаа да Бангладеш в Швеца» на льду пря -4 С, Я яооледованы в течение 5 днвО пооло отбора. В 13-тя яз Г7-тя pod тоБОяя бил обнаружен без предварительного выоева пробы ( A«M.3vennerftoin_f u.wiicotrom , 1986). Тавпм образом, очввад-но, что МКА в аилу своей унявальяоп яапраїленяоотя а яядпвя-дуальдыы антигенный детермінантам позволяет разработать ей ях ооновв уоовершенотвованяые диагноотячеовие препарат для серо-логячеовой вдептяфялацая и ди^оренциапдя возбудителя холера, яонлючять ложяополояителъние реаяцяя, лоторие вознявав» при работе о полявлоналышыя оыворотваня.

Ваалов теоретячеовое я правтячеовое зяаченяв яяеет дальне {toe е яэучэняв антигенного строения 0-специ?ичеового воыплея-оа холерных вибрионов, ияделеняе яыыуяогенных антигеаных детерминант ЛПС я пояоа молвиуллрных отрувтур, пригодных для вонотруирования оаятетячеовях яавцвд ва ооновв вонпловоа протея тявных антигенов.

Каотоявдя работа выполнена в ранвах плановой теки * 144-2-88 "АнтигешшА аяеляз холерных вибрионов о использованием набора цоАОЛлояальяюс аятятел, регяотрядаонлый номер 063374 01.88.0.

Цель работы. Получешш волловпия мояовлопальяых антител в антигенним детерминантам ЛПО холерного вибриона, изучение о ях поыоздо ямиуяобйояогячесвдх овоЛатв антигенов лабораторных штаммов Т. choloraoOI я ооздание на ях ооновв теог-ояотем ^ч длл дяагяоотявя я ядеятяфивапяи холерных вибрионов 01 группы,

Ооновнш задача иоолсдоваиия^

1. Разработать оптимальные уоловяя получения гибридом,
оевретярующах моновлоиалыше антаталя в О-антягену холерного
всбриояа.

2, Создать яодлеедию гибридом, отабпльпо продуцйрукгдах

моаовлоаальные антитела в аятягеавым детврмявавтам 0-чшецафа-. чаевого воыпленоа холерного яябряояа.

3» Иаучят» oaoSoTia, аятигеаяуп опвцяфячяооть я ялімуяо-вяологячеовуп автажяооть оантезируемых гвбрвдомаая ыоновло-вальных яымуяоглобуляяоя.

1. Изучен 8!Швтяялооть яопользовавяя воллевцая ЫКА при автигеавом анализа типичных я атяпячяых ттаымоя холарвнх яяб-ряояоя в проваратої ЛПС.

2. Получить опецяфячяло я v.choioruo 01 нояъвгярояаявне о ШЦ препарати МКА для прямого яыиуяофяворвоцеатяого метода.

3. Получать опецяфичеовяе я v.cholera* 01 стафаловоя-яояие роагевти ва .оонове ыоноопецифячвовдх ямыувоглоо'улввоя для реакция воагтлютаяацяя ва стевла.

Научная яовязпа я теоретдчаовая значяцооть работы.

В результате проведенных доследований получав набор гибридом, продуцврувдах мояовлональные автятела я различным он-тятедлым детеруянадтам 0-яоыплевоа v.cv-.iorao 01.

Получены гдбрддомн, продуцирующие ?Ш ic

Уотаноядеяо, что яоеледолаввыо ыововловальяые автятела направлены я ЛПС холерного вябрдоаа. Определено чяоло в пря-нервая проотранотввнная ловолязацвл аятягеиамх детермяяавт ЛПС, раопоалявяежых ыояояловальвыыя антятеламя.

Ивучева фувяцаояальяая аятяжнооть мовояловальвых антдтел я рввличввм онтягеввым двтершшантам 0-внтягева холерного вяб-ряова. Проведав о поыощьв воллевцая ЫКА анализ антягепоя тя-

пішшх и атлпичншс штошої, грапофорцаиим, їраиаконьюганго» я йндуцир018нних uytantos холорных яибркоцоя. Уогановлэпо, чго атипичные шгашш и мутант, полученные а процеоое геиэгичэокой оалокции чаогично уірачивасї О-антиганнуп апациЬичносгь, а дэ-торыиналш, о кохорыии ззаииодаііоїїуют иойоклоиальвыо внїіко-ла, предотаяланн на клезочнои повврхноогм ноапачатольнии чио-лом поморов онгигэшшх догариинант.

Уатанозл.зио, что опвцииичевизя окіиїіооїь моноклонэльяцх впитал і реакциях агглюишации, проішштошім и иццуноілворао-ценции виз читально шов диагносшчаоких агглюїипирующгх холерных ouгоро го и.

Практическая ценность роботи.

Полу чанная коллекция агабилыых гибридних культур, продуцирующих Ш к онзигвншш доївриинанїаи юзбудягвля холори, аопольэоааны а начаоїзв шїочіішю» отандоргтіх vio но on відиінч оо— шіх иммуноглобулинов для разрибогкм усозоршвногвоьонных диаг-поохичооких пропаратоэ.

Гибридный юдзн ГХ-го/оі t продуцирующий ипюклоиолышо igO к видоонуїди-іипоокоцу онгигону v.ohoieruo 01 » депонирован в специализированной колликцин порвяиїоошх соиагичооиих илагок позвоночных ВоасоюзиоІІ коллекции клоточшіх ісульїур гад номером ВСІШ (II) 3S6 Д.

Гябридоиз ГХ-В7/0Г , продуцвдювдя ігоноіслонзльніів і^о к овроявроспвци&нчаокоиу онїигоиу юабудителя ходорц, экопрооои-роааішому на клетках вїошоз холорных вкбрітно» уодїко ооровз-ра Огааз, оащпщева озгороиии ояидатольоізои 'г 15*12^4 ог 8 ок-гября І9Ь9 года,

Получани и иопнівли диагнооїичгіокао прапіірлха UKA, копхи-ї'йроаанвих о ФИТЦ длп дкагносгики и идоптп<$икоцкя яоабудигоЕЯ

холери шгашгоэ r.choitre* , относящихся tt oepoiapy Oreia, s прямом иииувофлюореоцватном методе.

Получав я И0ІШГ8И стафилококковый мовоклоивланый soar* гдюгииирующий дяагаоотикум для идевгификации иташгая 7.ofaol«-»* 01 і реакция коагглюїиаации ва отвило.

По реаудиатеи жышллвнвой работы были разработаны

"ИЯОТРУКПНЯ ПО ИЗГОїОВЛЗНіт И ВОВХрОЛО К0-р08ГвЙїОЯ ДШіГНОО-

тичеоких холерных шиокловалышх сухих для реакции коегглоти-' ввит ва отекло"і которая одобрена Ученый Соаегом Poctosokdгона-До иу иэучио-исолэдогатвльокого противочумного ивотитута .. uapta 1990 г., протокол to 4; "Экопериивптэльно-проивзюдот-веввый регламент йо кзготоиовип и контролю винупогпобуливов диагностических холерних иойокдовальных лшиаеоцирующих оу-хвх" был утзерхдан Учепыи Созетоы Роотоэокого-на-Дову научно* ноодедовательокого протйгочуыяого ивотитута Zk кввя 1988 г«» протокол h 9.

Иопытавия пре паро тої во освозе ШСА лрозедоны ва бааа Ростовского и Иркутского иэучно-исслодоаагельоккх противочумных институтов.

Представленные в октябре 1990 г. во акспоаиаии "Прогрэо-СИИ8Я технология з произюдогвв лекаротзезвых оредоті" препараты "Иммуноглобулины диагностические холерные моиокло-иельные люіашоонирующио^п отмечены, серебряной медалью ВДНХ СССР.

Препараты влдо- и сороиароапэцифичоских (Оговз) IfltA ио-поладуптся в шучло-лослодовйтильоі&х разработках в лаборатории гибридоы, ишупооорбоптов, молекулярной биологии и говети-кя холоры, отделе оноциалаБзцяи врачей Ростова ко го-ва-Дону ва-учко-йоолэдог.аюльаг.ого институте, 8 токве и Ьаесоюзяом ИШЧИ

- э

^пМикроб" и ШШЧИ Оибирп и Дальнего Еооюкэ.

Осзоа.чна полодоїіиЯу уїіддигзоіяіо аа яаниу.ч

1. Гнбридоїм, получению nysoti соиетичесшой гнбрвдіий-шш ішунишс опдоиоцимя a гслогкаии иізлош шел, кродуапру»-цио шиоікоиолгішз овїИїола в 0-ші вигону холориого вибриояа, являягоп поточншсои оїоад'їргиих, шаокош'лтакиху спопк^ичоа-їзх апіител.'

2. Гибридош, продуцнруй"іиа !Щ к О-аигпгвну яоабудителл :-солори, облздаищгв различной оппгг.ї'лічиооїьз:

- перекрестной гааеросіїсцм'їг.чзоояїп о блиэкэродогзаднпии
шкроо'ргзиизмаит

обцзіі видовой дл.. sees ооро^вроз у. оЬоі*гя_а oij

- овровврной (Огаяа) ппоц5?Т'ич!іооїьв, поэгаляэдм прагодияь
идвиїпї'икаціш їозбуднїпдп холери, его анузриїлдояув оа-
рологнчпскув дп-ЭДервна.чэцип,

3. Видоопвлвдичеакиа и Огага-опециСдічаакив гибридош,
продуцирующие цоноклоиилышв пнгиїола к 0-ви«игвну та лир now
зебрионо, оаукої ноточвшоа бвологячоокп вкїиїннх вшуиогяойу-
дпноз, прз добавляющих ообой цаипии иноїруиоЕї для «ягнгеї 'пго
аіівлпза штзіаіол холерних игбриопоз psaлячного про!:охо:дашш,

о твісте установления нкіуяохізіичеокой вкгшгноош отдельных фракций ДІЮ,

Ь. С пошпья взторзіяй іяллокцин МКА к ЛИС хоячрноіч» ззяб-раоаа ИІП2ЛЄВЦ б впдоспаци&ічмкт: а * оеромроспзшфічоокях (Огзїз) аяеиі-впвнх дотариинэис»

3. Високая опацпїлчяосуа, чузсїзпмлькооїЬ и стабилл-иооїь saor-оиогом яа оопоао шпоішшлдаи овгитоя потюдлаї иопользогоїй кх для дгсягяеогккя к ітді}«їияяащ?я заабудиголя холораі

б. Получониыэ диагностические препараты швоюговальвых иммуноглобулинов, копыогировзвшх о ФИТЦ, превооходят го активности в 4-8 раз коїшерчоокиз голиклоиольныо ЛЕшщеоцовтиые

СИВОрЭТКИ, ПрОДИОЗВОЧОНПНв ДЛЯ ООрОЛОГИЧеОКОЙ ИДОНДИфИКацИИ

возбудитоля ходоры.

Апробация работы. Результаты исследований были долояош на научных конференциях иолодшс учета РІШ в 1987 и 1988 гг., as Вооооюзиоц оошіварз по МКЛ s апреле 1988 г., Ростов-іш-До-ну; на Всесоюзной научной конференции "Лктуолышэ вопросы микробиологии, лабораторной диагностики и профилактики холо-puⁿ, Ростов-на-Дону, 1988 г.; ца Всесоюзной конференции "Совращенные направления создания ыедициноких диагносітсуиов", Ыосква, I98S г. и ва отрэоловои Воаооюзвоц оовоцзнии "Соотоя-эиэ проблеш и паропокїїииг развития диагиоохики бактериальных инфекций", Оболенок, 1989 г. Іїаїориали диооертации обоуждаш на общоипетитутокой конференции РПЧИ в апрало 1992 г.

Публккзщш разультатов иослодотаний. Оановпыо галогония дносергзции огранены в 10 опубликованных научных роботах.

Структура диосіергации. Диооертвция излоаоыа ко 160 страницах машинописного тавота и ооотоит из введения, обзора ли-воратуры,. опиоания иагершлоз и методов исследования, результатов собственных иослодовавий, заключения, выводов и у газ зато ля литературы, включающего работы 50 отечественных и 135 сорубаяшх авторов. Работа иллюстрировала 5 риоункамн, 15 то-блицвіш и 7 фотографиями і

- Д-

СОБСТВЕН HUE ИССЛЕДОВАНИЯ Нагариалы в методы

Бакаариальиые пгашш и антигопы. В рйбога били иоподь-эозаиы 312 типичных шгаишол холерных їцбрионоз биодороя _el_ tor^H oholoroe оороворов Огавэ, Инабэ ц Гшоиииз, 86 а?н-пичиих шюиші v.cholerae слабоагглюїтшруюіуіхоп ходорішиа диаглооїичвоюпіа сыворогкаш; индуцирояонішо С-нутаиш, зкспорішвнїйльно подученные а РИЧИ о цопользозакиви супврау-тагвнов - д-иотроэоиотнлиопоашш я ц-иоіия-^лагго-ц-аяї-розогуаїшдшш (21 uirauu); аровофэрииикы и траки гапідгааиі (5 Dsauuoa)i 7 шгшмоз ,;-<їорц холерных габриоиол; холарнио иіб-риоии но 01 группа различных свровиров (64 etokuOi пролога-ВНїОЛЯ oouoitosa . Vihrlonaoeuo t l'ooudoiLoiiadiioeaa JL'nte-ro-buctorlaooao і sukxo прэлараты ЛИС, иодучониио по похода O.We3tphftl«it Ql, (1965).

Клотші. Еополмомйи ішшшшо шіалошшо клоточша линии X 653; клопа пареяизосшой нулыурн ішиишх аброблзсгов т,-92У и опарнэлышо кдагки киї'айокого хомяка СНО-КІ,

Еутатаиа» Использоьели тібредяих uivi-з?, ли;і;п ваіь/о масо oil 16-20 у,

Нцмунологичоские радішім, Коїод и«з;іри:л)!і :и ;;.'j я о іг^.<о ])^ о -цинции осуществляли на іІиксироїе.чпих мазках, иуиго^оьлчньих ио І илрд оуопонзші баїгеориааьійіх клеток,

Иілмувоіерншітяи!! оиодиз проводили на тзордоИ и?зав оорби-рогатішс з дуаиах полнотарологшс гаивлоЯ цольщх кіиї-ок бактериальных атсииоч ита пропоротой ЛИС,

Коикурвиїауо іюоші«9 пар ККА для онридедвпич иидакоэ ид-д:ітп2'.юоїи_промдил!і оогляоло нотодіїна, прздлоааіпюИ j'.,_1(JU0ti

В. ot ol.. I⁹⁸³'

Конкуренция аититол, нвыечвяных ферментом, о аятятелаыя, вокъпгированшыи о перовоядаэой хрена, проводили по следующей охенві на гошотияу адсорбировала антиген, затем внооили препарати МКА, раотятровашше двуяраташ разведениям. Добавлением МКА, меченного дермвятоц, определяли вояяуранцяю пары ЫКА sa ценхрк связывания на антигене.

Ин.ЧуяобЛОТЯНГ ООущвОТВЛЯЛД ПО ПОГОДУ H.Tonbin et el. (1979).

Уеаяцдю агглютинация, двойной яммунодяффузяя проводили по общепринятым ме годинам.

Определвішо влаоео иммуноглобулинов, продуцируемых гябрн-доивхя, проводили о покощко эдмуноформентного дзотяшірувщаго набора фармы ссаъаосЬсп (ШвоСцарил) по инотрувцяя изготовителя.

Статиотдчесют обработку результатов серологячеовях анализов проводили по И.П.Аошарану я А.А.Воробьеву, 1962.

Доотгюякпе грзг'пиов. Графячеоиуп обработяу данных проводила па вокгшаторо H-2S0 йщии "oaivotti" о использование!* гра?іичеового пакета "uraf-box"^a яятерантнвяом регяца.