Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Литературный обзор. Молекулярные механизмы регуляции азотного метаболизма в клетках бактерий 19
1.1 Введение 19
1.2 Ассимиляция азота и регуляция азотного метаболизма в клетках бактерий 20
1.2.1 Транспорт глутамина в клетку 20
1.2.2 Транспорт аммония в клетку 22
1.2.3 Поглощение нитратного и нитритного азота 23
1.2.4 АВС-транспортер AmtB 24
1.2.5 Белки AmtB и GlnK в клетках B. subtilis 29
1.3 Биохимические пути ассимиляции источников азота 30
1.3.1 Синтез глутаминовой кислоты 31
1.4 Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов азотного метаболизма 38
1.4.1 Регуляция азотного метаболизма в клетках E. coli 39
1.4.2 Регуляция азотного метаболизма в клетках B. subtilis 45
1.5 Семейство PII белков 54
1.5.1 Сенсорные свойства PII белков на примере GlnB Synechococcus elongatus 59
1.5.2 PII белок B. subtilis 63
1.5.3 PII белки Arabidopsis thaliana 64
1.5.4 PII белки Azospirillum brasilense 65
1.6 Регуляция метаболизма путем внутриклеточного протеолиза регуляторных белков 72
1.6.1 Направленный протеолиз в регуляции клеточного метаболизма 72
1.7 Образование биопленок у бактерий 73
1.7.2 Образование биопленок у B. subtilis 78
Глава 2 Материалы и методы исследования 81
2.1 Методы работы с бактериальными клетками 81
2.1.1 Штаммы 81
2.1.2 Плазмидные векторы 82
2.1.3 Среды и условия культивирования 83
2.1.4 Определение минимальной подавляющей концентрации 85
2.1.5 Определение цитотоксичности 85
2.1.6 Получение мембранной фракции клеток 85
2.1.7 Трансформация клеток E. coli методом теплового шока 86
2.1.8 Трансформация клеток E. coli методом электропорации 86
2.1.9 Трансформация клеток B. subtilis [Anagnostopolous et al., 1961] 86
2.2 Методы работы с рекомбинантной ДНК 87
2.2.1 Выделение геномной ДНК бацилл и лактобацилл методом фенол-хлороформной экстракции 87
2.2.2 Выделение плазмидной ДНК в препаративных количествах методом щелочного лизиса 87
2.2.3 Выделение плазмидной ДНК с помощью GeneJET Plasmid Miniprep Kit 88
2.2.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 88
2.2.5 Очистка амплифицированных фрагментов ДНК после ПЦР 91
2.2.6 Рестрикция ДНК 92
2.2.7 Дефосфорилирование ДНК 92
2.2.8 Лигирование ДНК 92
2.2.9 Получение ДНК-дуплексов путем гибридизации 93
2.2.10 Метод энзиматической сборки фрагментов ДНК по Гибсону 93
2.2.11 Электрофорез ДНК 93
2.2.12 Очистка ДНК из агарозного геля 94
2.2.13 Введение точечных мутаций в гены 94
2.3 Схемы получения рекомбинантных конструкций 95
2.3.1 Нокаутирование генов 95
2.3.2 Нокаутирование гена htrA в клетках B. subtilis 96
2.3.4 Получение рекомбинантного штамма B. subtilis с точечной мутацией G93A в белке GlnK 97
2.3.5 Клонирование мутантных генов tnrA B. subtilis 99
2.3.6 Конструирование плазмиды pGP-pTnrA 99
2.3.7 Клонирование мутантных генов glnR B. subtilis 100
2.3.8 Клонирование мутантных генов glnR и potA L. brevis 101
2.4 Методы работы с белками 101
2.4.1 Скрининг рекомбинантных штаммов, обладающих максимальной гиперпродукцией белков 101
2.4.2 Гиперпродукция белков в клетках E. coli и получение клеточных экстрактов 102
2.4.3 Очистка белков на Ni-NTA сефарозе 102
2.4.4 Очистка белков на стреп-тактин сефарозе 102
2.4.5 Преципитация белков сульфатом аммония 103
2.4.6 Гидрофобная хроматография 103
2.4.7 Ионообменная хроматография 103
2.4.8 Гель-фильтрация 104
2.4.9 Диализ белков 104
2.4.10 Определение концентрации белка 104
2.4.11 Электрофорез белков в денатурирующих условиях 104
2.4.12 Окрашивание белковых гелей кумасси синим 105
2.4.13 Окрашивание белковых гелей нитратом серебра 105
2.4.14 Осаждение белков с помощью трихлоруксусной кислоты 105
2.4.15 Иммуноблоттинг (Western Blot) 105
2.4.16 Dot Blot 106
2.4.17 Иммунодетекция 106
2.4.18 Анализ олигомеризации белков методом поперечных сшивок in vitro 107
2.5 Методы анализа взаимодействия макромолекул 107
2.5.1 Анализ взаимодействия белков методом ко-элюции (Pull Down) 107
2.5.2 Иммунопреципитация 108
2.5.3 Иммунопреципитация с антителами, ковалентно сшитыми с белок-А сефарозой 108
2.5.4 Анализ взаимодействия белков со стреп-тагом in vivo (SPINE) 109
2.5.5 Pull Down анализ взаимодействия фактора TnrA с ДНК 109
2.5.6 Метод задержки в геле 110
2.5.7 Исследование взаимодействия белков методом плазмонного поверхностного резонанса (ППР) 110
2.5.8 Исследование взаимодействия белков с ДНК методом плазмонного поверхностного резонанса (ППР) 111
2.6 Аналитические методы 111
2.6.1 Определение активности [З-галактозидазы 111
2.6.2 Определение активности глутаминсинтетазы 112
2.6.3 Окрашивание биопленок кристаллическим фиолетовым 113
2.6.4 Определение содержания ионов аммония 113
2.6.5 Изотермальная титрующая калориметрия 114
2.7 Математические методы 114
2.7.1 Био информатика 114
2.7.2 Статистика 115
Глава 3 Молекулярные механизмы регуляции активности фактора транскрипции ТпгА в клетках Б. subtilis 116
3.1 Анализ структуры фактора транскрипции ТпгА 116
3.1.1 Получение белков ТпгА с усеченной С-концевой последовательностью 116
3.1.2 Определение участков взаимодействия фактора ТпгА с GlnK и глутаминсинтетазой 120
3.1.3 Функциональная роль С-концевого домена фактора ТпгА в образовании димеров и взаимодействии белка с ДНК 121
3.2 Активность и внутриклеточная локализация фактора ТпгА в условиях различных доступности восстановленного азота 128
3.2.1 Влияние белков AmtB, GlnK и глутаминсинтетазы на активность фактора транскрипции ТпгА в клетках бацилл 128
3.2.2 Внутриклеточная локализация фактора ТпгА в различных условиях доступности восстановленного азота 134
3.3 Влияние эффекторных молекул на взаимодействие ТпгА с глутаминсинтетазой 137
3.3.1 Характеристика взаимодействия глутаминсинтетазы с лигандами 137
3.3.2 Влияние эффекторных молекул на взаимодействие ТпгА с глутаминсинтетазой 143
3.4 Влияние эффекторных молекул на взаимодействие ТпгА с РП-подобным белком GlnK 146
3.4.1 Характеристика связывания лигандов белком GlnK методом изотермальной титрующей калориметрии 146
3.4.2 Влияние эффекторных молекул на взаимодействие ТпгА с белком GlnK 148
3.5 Конкурентное взаимодействие GlnK и глутаминсинтетазы с ТпгА как механизм регуляции ДНК-связывающей активности фактора транскрипции 150
3.5.1 Оценка конкурентного взаимодействия GlnK и глутаминсинтетазы c фактором TnrA 150
3.5.2 Белок GlnK и глутаминсинтетаза конкурентно связывают фактор транскрипции TnrA в зависимости от концентраций эффекторных молекул и определяют его ДНК-связывающую активность 152
Глава 4 Фактор транскрипции TnrA подавляет активность глутаминсинтетазы в клетках B. subtilis 157
4.1 Влияние факторов транскрипции TnrA и GlnR на активность глутаминсинтетазы в условиях in vitro 157
4.2 Физиологическое значение подавления in vivo активности глутаминсинтетазы путем связывания с фактором TnrA 161
Глава 5 Протеолитическое расщепление фактора TnrA как альтернативный путь контроля его активности 163
5.1 Фактор TnrA подвергается протеолизу в ответ на полное удаление источника азота 163
5.2 Исследование взаимодействия фактора транскрипции TnrA с белками-партнерами в условиях удаления источника азота 166
5.3 Протеолиз белков TnrA с делециями С-конца белка 173
5.4 Идентификация протеиназы осуществляющей протеолиз фактора транскрипции TnrA в клетках B. subtilis 174
5.4.1 Сбор и анализ экспериментальных данных распознавания полипептидных мишеней белками-регуляторами ClpC и ClpX 174
5.4.2 Идентификация сайта распознавания белков субстратов АТФазами ClpC и ClpX 175
5.4.3 Получение штамма B. subtilis, дефектного по внутриклеточной протеиназе HtrA 178
5.4.4 Протеолиз фактора транскрипции TnrA в клетках B. subtilis , мутантных по внутриклеточным протеазам HtrA, LonA, ClpP 178
5.4.5 Очистка протеолитической активности, осуществляющей протеолиз фактора TnrA 179
Глава 6 Функциональная роль белка GlnK в клетках B. subtilis 184
6.1 Оценка участия консервативных аминокислот в связывани лигандов белком GlnK 184
6.2 Взаимодействие белков GlnK и GlnK93 с фактором TnrA in vitro и in vivo 189
6.3 Влияние точечной мутации G93A в АТФ-связывающем сайте белка GlnK на его локализацию в клетке 192
6.4 Влияние точечной мутации G93A в АТФ-связывающем сайте на регуляторные функции белка GlnK 193
6.5 Регуляторный белок GlnK необходим для ассимиляции глутамина клетками B. subtilis 196
Глава 7 Система регуляции азотного обмена бацилл как мишень антибактериальных препаратов 199
7.1 Скрининг производных 2(5Н)-фуранона, подавляющих образование биопленки клетками B. subtilis 199
7.2 Определение клеточных мишеней для фуранонов 202
7.2.1 Влияние фуранонов на систему регуляции чувства кворума бацилл (ComP-ComA) 202
7.2.2 Влияние фуранонов на систему регуляции азотного метаболизма 203
7.2.3 Влияние фуранонов на систему регуляции образования биопленки 205
7.3 Оценка влияния фуранонов на эффективность антибиотиков в отношении клеток в составе биопленки 206
Глава 8 Биохимическая характеристика PII подобного белка PotN в клетках Lactobacillus brevis subsp gravesensis 209
8.1 Характеристика генного окружения гена potN и анализ аминокислотной последовательности белка PotN 209
8.2 Очистка белка PotN и оценка олигомеризации 212
8.3 Оценка взаимодействия белка PotN с различными лигандами 215
8.4 Рентгеноструктурный анализ белка PotN 218
8.5 Идентификация белков-партнеров для взаимодействия с белком PotN в клетках L. brevis 220
8.6 Характеристика взаимодействия белка PotN с белками-партнерами в бактериальной двугибридной системе и in vitro 226
8.7 Характеристика влияния белка PotN на ДНК-связывающую активность фактора транскрипции GlnR in vitro 230
Глава 9 Обсуждение результатов 233
Заключение 253
Благодарности 256
Список использованных источников 257
Приложение 1 283
Приложение 2 299
- АВС-транспортер AmtB
- Получение белков ТпгА с усеченной С-концевой последовательностью
- Оценка участия консервативных аминокислот в связывани лигандов белком GlnK
- Характеристика взаимодействия белка PotN с белками-партнерами в бактериальной двугибридной системе и in vitro
АВС-транспортер AmtB
Белки семейства Amt/Rh присутствуют в геномах почти всех секвенированных организмов [Ludewig et al., 2007]. При этом белки Amt свойственны клеткам архей, бактерий, простейших, растений, грибов и беспозвоночных, тогда как гомологи белков Rh редко встречаются у бактерий и простейших, и представлены в основном у бесповоночных и позвоночных животных [Peng, Huang, 2006].
Исторически, первой описанной функцией этих мембранных белков был высокоаффинный транспорт ионов аммония (NH4+). Клеточные мембраны проницаемы для газообразного аммиака (NH3), но не для ионов аммония NH4+ [Andrade, Einsle, 2007]. В среде со значениями рН менее 5 равновесие ионы аммония-аммиак смещено в сторону образования ионов, поэтому в этих условиях поступление аммонийного азота в клетку возможно только за счет их активного транспорта белком AmtB [Marini et al., 1997; Soupene et al., 1998]. Другая транспортная функций белков Amt заключается в возврате в клетку NH3, утрачиваемого за счет его диффузии из клетки в среду через мембрану. Эта функция особенно важна в тех случаях, когда бактерии затрачивают значительное количество энергии на восстановление окисленного азота из нитратов и нитритов [Kleiner, 1985; Yakunin, Hallenbeck, 2002].
Полученные кристаллы белков AmtB Escherichia coli и Amt1 A. fulgidus и последующие исследования их стурктуры позволили выявить гомотримерную структуру белков с гидрофобным каналом в каждой субъединице [Khademi et al., 2004; Zheng et al., 2004; Andrade et al., 2005]. В периплазматической части белка имеется сайт связвания с NH4+ , однако два остатка фенилаланина препятствуют прохождению иона через канал, что позволяет предположить наличие конформационных изменений для успешного транспорта иона внутрь клетки [Andrade, Einsle, 2007; Javelle et al., 2008]. Внутри поры имеются два консервативных остатка гистидина, которые выполняют функцию связывания протонов или иона аммония. Механизм транспорта NH4+ белками семейства Amt/Rh до сих пор широко обсуждается в литературе. Предположительно, у бактерий NH4+ подвергается депротонированию перед попаданием в гидрофобный канал белка AmtB и затем заново протонируется в цитоплазме [Javelle et al., 2008; reviewed in Andrade and Einsle, 2007; Ludewig et al., 2007]. Некоторые исследования, например посвященные белкам AmtB из E. coli and Corynebacterium glutamicum, показали, что происходит транспорт протона через мембрану сопряженный с субстратом [Fong et al., 2007; Walter et al., 2008].
Недавно для белков AmtB была предложена еще и сенсорная функция. AmtB белки, как правило, кодируются оперонами glnKamtB или amtBglnK, при этом AmtB белки в клетке, как правило, взаимодействуют с PII-подобным белком GlnK, что позволяет предположить потенциальную регуляторную роль AmtB [Javelle, Merrick, 2005]. PII белки в клетках бактерий и архей образуют большое семейство центральных регуляторов ассимиляции и фиксации азота. Были предложены 2 варианта участия AmtB в регуляции азотного метаболизма. Согласно первой теории, физиологическая роль AmtB заключается в активном транспорте ионов аммония в клетку. Благодаря этому происходит повышение его содержания в клетке, и, как следствие, активное его включение в метаболизм путем связывания с глутаминовой кислотой. Это приводит к формированию метабьолического сигнала «высокий уровень аммония». Во втором случае AmtB рассматриваются как бифункциональные белки, которые непосредственно генерируют сигнал о степени доступности азота для клетки и осуществляют его трансдукцию на биохимический и генетический аппарат клетки [Tremblay, Hallenbeck, 2009].
PII подобные белки – небольшие тримерные белки, которые регулируют центральный метаболизм клетки в ответ на вунтриклеточный достаток источника углерода, азота и энергии [Forchhammer, 2008]. В геномах бактерий кодируются один или несколько PII белков, при этом ген белка GlnB обычно экспрессируется конститутивно, экспрессия GlnK регулируется в зависимости от доступности азота. Поэтому еще одной функцией бактериальных AmtB белков является инактивация избыточного количества белков PII в ответ на внезапное повышение концентрации ионов аммония в среде (Рисунок 4).
Так, путем смены локализации белка PII осуществляется регуляция активности глутаминсинтетазы и нитрогеназы [Andrade, Einsle, 2007; Leigh, Dodsworth, 2007; Forchhammer, 2008]. Ряд исследований бактериях E. coli [Durand & Merrick, 2006], Azospirillum brasilense [Huergo et al., 2007], Rhodospirillum rubrum [Wolfe et al., 2007; Teixeira et al., 2008] показал, что в ответ на изменение пула метаболитов-эффекторов GlnK (2-кетоглуатровой кислоты, АТФ и АДФ) происходит процесс ассоциации или диссоциации PII-белка от AmtB. Высокое содержания ионов аммония в клеткеспособствует интенсивному синтезу глутамина, на что затрачивается клеточный пул 2-кетоглутаровой кислоты и АТФ. В результате происходит снижение концентрации АТФ в клетке, PII белок переходит в АДФ-связанное состояние с высоким сродством к AmtB и и связывает этот АВС-транспортер.
Электронная микроскопия и рентгено-структурная кристаллография позволили установить структуру комплекса AmtB–GlnK в E. coli [Gruswitz et al., 2007; Yildiz et al., 2007]. В этом комплексе, Tпетли тримера GlnK входят в гидрофобные поры AmtB тем самым блокируя транспорт NH4+. Данный комплекс образуется только с немодифицированным GlnK: уридилтрансфераза (UTase/ UR) GlnD в ответ на повышение внуриклеточного уровня глутамина должна удалить остаток УМФ, ковалентно связанного с остатком тирозина 51, расположенного на кончике Т-петли [Arcondeguy et al., 2001; Forchhammer, 2008]. При азотном голодании (снижении доступного NH4+) происходит повышение содержания АТФ и 2-кетоглутаровой кислоты, эти эффекторы связываются с GlnK и тем самым стимулируют диссоциацию комплекса AmtB–GlnK, возможно, путем изменения конформации Т-петли [Yildiz et al., 2007]. На основании этих данных была высказана гипотеза, что основной функцией взаимодействия AmtB–GlnK является регуляция транспорта аммония в клетку [Javelle, Merrick, 2005].
AmtB могут участвовать в регуляции азотного метаболизма и косвенно. Эти белки осуществляют доставку аммония в клетку, где другие регуляторные белки воспринимают и осуществляют трансдукцию сигнала степени доступности азота для клетки. В этом случае ключевая роль принадлежит глутаминсинтетазе [Javelle et al., 2004; Murray, 2015; Forchhammer et al., 2016]. С повышением концентрации доступного аммония начинается интенсивный синтез глутамина, в результате чего происходит повышение его внутриклеточного содержания, влекущее деуридилирование PII-белков GlnB и GlnK. Немодифицированный белок GlnK связывается с AmtB и тем самым закрывает канал AmtB, транспорт ионов аммония в клетку прекращается. Деуридилированный GlnB приобретает способность образовывать комплекс с гистидин-киназой NtrB и активировать ее фосфатазную активность [Leigh, Dodsworth, 2007]. В результате этих регуляторных событий дефосфорилируется NtrC и экспрессия NtrC-зависимых генов подавляется. Кроме того, деуридилированный GlnB связывается с аденилтрансферазой GlnE, которая в свою очередь присоединяет остаток УМФ к глутаминсинтетазе и подавляет ее активность [Ninfa, Atkinson, 2000].
Получение белков ТпгА с усеченной С-концевой последовательностью
С помощью алгоритма Phyre2 на основе гомологии с известными третичными структурами белков семейства MerR нам удалось смоделировать третичную структуру 90% последовательности белка TnrA, что составляет 99 аминокислот из 110 (Рисунок 34 А) [Федорова с соавт., 2013]. Как и характерно для большинства MerR-белков, в области N-концевого домена идентифицируется консервативный мотив петля-поворот-петля (helixurn-helix), который участвует в связывании ДНК и состоит из двух -спиралей, соединенных поворотом полипептидной цепи. Путем множественного выравнивания аминокислотных последовательностей белков TnrA бацилл была установлена высокая консервативность N-концевой области, между тирозином 8 и изолейцином 75 (Рисунок 34 Б). Также в структуре белка присутствуют консервативные аминокислоты, которые предположительно участвуют во взаимодействии с ДНК (Рисунок 34 Б).
С помощью алгоритма CFSSP [Kumar, 2013] была предсказана вторичная структура фактора TnrA (Рисунок 35 А). У большинства белков семейства MerR домен сигнальной трансдукции расположен на C-конце белка в 5-ой -спирали (Рисунок 34 А, 35 А). В пятой спирали фактора TnrA ранее были идентифицированы аминокислотные остатки, участвующие в связывании с глутаминсинтетазой и замена которых полностью нарушает взаимодействие этих белков [Wray, Fisher, 2007] (Рисунок 35 А). Подобно всем MerR белкам, фактор TnrA должен проявлять ДНК-связывающую активность в димерной форме, однако сайт димеризации белка в настоящее время остается неизвестным [Wray, Fisher, 2007]. С помощью сервера PRISM [Keskin et al., 2009] мы провели идентификацию вероятных участков белка, необходимых для его димеризации. В результате проведенного анализа были предсказаны аминокислотные остатки, потенциально участвующие в димеризации белка: Asp61, Asn64, Asp68, Gly69, Asp78, Lys82, Asp89, Lys95, Gly99 и Asn102. Однако [Wray, Fisher, 2007] было показано, что замена остатков Asp89, Lys95, Gly99 и Asn102 не влияет на димеризацию TnrA, следовательно, они не участвуют в этом процессе.
Для верификации участия С-концевого домена белка TnrA в димеризации белка, а также выявления сайтов взаимодействия с белком GlnK и глутаминсинтетазой, были сконструированы плазмиды для экспрессии в клетках E.coli мутантных белков TnrA укороченных на 6, 20, 35 и 43 аминокислот с С-концевой области. Для этого в вектор pET15b были клонированы укороченные гены tnrA с получением плазмид pET15nrА6, pET15nrA20, pET15nrA35 и pET15nrA43 (Рисунок 30) [Kayumov et al., 2011, Федорова с соавт, 2013]. Для всех этих белков были построены модели третичной структуры (Рисунок 35 Б). Подобные делеции 7, 20 и 35 аминокислот были проведены ранее in vivo [Shin et al 2000]. Для экспрессии полноценного белка использовали плазмиду pET15bnrA [Heinrich et al., 2006]. При делеции 6 аминокислот белок теряет фенилаланин Phe105, необходимость которого для взаимодействия с глутаминсинтетазой была показана ранее [Wray et al., 2007]. Удаление 20 аминокислотных остатков приводит к отсутствию всех аминокислотных остатков, формирующих сайт связывания с глутаминсинтетазой, а также отсутствует большая часть 5-ой -спирали, участвующей в димеризации большинства MerR факторов транскрипции [Hobman, 2007]. При укорочении белка TnrA на 35 аминокислотных остатков полностью отсутствуют 5-я -спираль и часть 4-ой -спирали. Также в белке отсутствуют 6 аминокислот (Asp78, Lys82, Asp89, Lys95, Gly99 и Asn102), для которых предсказано участие в формировании димерной структуры белка. При удалении 43 аминокислотных остатков в белке полностью отсутствуют 5-я и 4-оя -спирали (Рисунок 35 Б), а также удаляются 8 из 10 аминокислот, предположительно участвующих в димеризации белка [Федорова с соавт., 2013].
Плазмидами pET15bnrA, pET15bnrA6, pET15bnrA20, pET15bnrA35 и pET15bnrA43 с полноразмерным и укороченными генами tnrA трансформировали штамм E. coli BL21 и проводили очистку белков из рекомбинантных штаммов. В результате очистки с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA сефарозе были получены препараты белков TnrA wt-His6, TnrA6-His6, TnrA20-His6, TnrA35-His6 и TnrA43-His6, белки были очищены в среднем в 15 раз до электрофоретической гомогенности (См. Приложение 1) [Kayumov et al., 2011].
Для удаления всех 10 аминокислотных остатков, потенциально необходимых для формирования димерной структуры белка, был клонирован ген tnrA, с делецией 50 триплетов с 3 -области с получением плазмиды pET15nrA50. Однако экспрессии белка получить не удалось, возможно, из-за высокой нестабильности белка, или распознавания полипептида протеолитической системой клетки как субстрата для протолиза.
Оценка участия консервативных аминокислот в связывани лигандов белком GlnK
В условиях азотного голодания фактор TnrA ассоциирован с мембранным комплексом AmtB-GlnK [Forchhammer, 2008, 2016]. Белок GlnK относится к семейству регуляторных белков PII, которые в клетках бактерий контролируют активность белков ассимиляции азота в ответ на метаболические сигналы азотного и углеродного метаболизма, которыми служат внутриклеточные концентрации АТФ, АДФ и 2-оксоглутарата [Ninfa, 2005]. В отличие от других белков PII, белок GlnK B. subtilis способен взаимодействовать только АТФ, [Forchhammer, 2016]. Вероятно, именно внутриклеточный уровень АТФ, как индикатор энергетического статуса клетки, является триггерным сигналом для контроля активности GlnK в клетках бацилл. Несмотря на возможную роль белка GlnK в регуляции активности фактора TnrA, его основная роль в клетках бацилл остается неизвестной [Heinrich 2006, Kayumov 2011], так как в клетке, дефектные по данному белку, не имели фенотипических различий с клетками исходного штамма, и не наблюдалось физиологических эффектов мутации [Detsch and Stulke, 2003].
Во многих клетках белки GlnK регулируют активность транспорта аммония в клетку путем перекрывания канала белка AmtB в ответ на изменение соотношения АТФ и АДФ в клетке [Trеmblay, Hallenbeck, 2009]. Бациллярный белок GlnK также способен связываться с белком AmtB, с которым они составляют АВС-транспортер аммония в клетку, гены белков входят в оперон nrgAB. Поэтому при делеции гена amtB клетки оказываются неспособны поглощать аммоний при его низкой концентрации в среде, однако делеция гена glnK не приводит к нарушениям транспорта аммония и роста клеток, хотя активность фактора TnrA в этом штамме снижена, вероятно, за счет конститутивного взаимодействия с глутаминсинтетазой [Detsch, Stulke, 2003, Fedorova et al., 2013].
Чтобы оценить роль АТФ в регуляции активности белка GlnK и трансдукции сигнала данным регулятором, было необходимо получить штамм, продуцирующий белок GlnK, неспособный взаимодействовать с АТФ. Проведенный сравнительный анализ аминокислотной последовательности белков GlnK из разных организмов выявил достаточно высокую степень гомологии белков данной группы в бактериях, филогенетически далеко отстоящих друг от друга (Рисунок 81).
Несмотря на низкую гомологию бациллярного белка GlnK с другими PII белками (30-50% идентичности аминокислотной последовательности), в нем присутствуют все ключевые аминокислоты, участвующие в образовании координационных связей с нуклеотидами – Глутамин39, Лизин40, Лизин58, Аргинин101 и Аргинин103. Во всех белках группы идентифицируется АТФ связывающий мотив GDGK. Согласно данным [Jiang et al., 1993], замена глицина в позиции 89 на аланин в PII белке GlnK E. coli приводит к нарушению архитектуры сайта связывания нуклеотидов, и белок оказывается неспособным взаимодействовать с АТФ и АДФ. Кроме того, белок теряет сродство к белку AmtB и не связывается с мембраной AmtB-зависимым образом. В белке GlnK из B. subtilis эта аминокислота соответствует глицину в позиции 93. На основе высокой консервативности АТФ-связывающего мотива было сделано предположение, что замена глицина в позиции 93 на аланин (мутация G93A) в белке GlnK из B. subtilis должна привести к потере его АТФ-связывающей способности и выполнению регуляторных функций в клетках. Интересно, что консервативный остаток Лизина58, необходимый для связывания с 2-кетоглутаровой килотой в PII-белках других бактерий, у бациллярного белка заменен на аргинин (Рисунок 81). Это может быть причиной отсутствия взаимодействия белка с 2-кетоглутаровой кислотой, о чем свидетельствуют результаты изотермальной титрующей калориметрии (Рисунок 58).
Чтобы оценить in vitro роль GDGK мотива в связывании АТФ белком GlnK, была сконструирована плазмида для гиперпродукции белка GlnK с заменой триплета GGC в позиции 279-282 на триплет GCA, что приводит к замене глицина в позиции 93 на аланин. Общая схема проведения мутагенеза представлена на рисунке 25. Полученные плазмиды проверяли на наличие мутации в ожидаемом сайте путем секвенирования. В результате нами была получена плазмида pDG148-GlnK93, несущая ген glnK с заменой триплета GGC279GCA, приводящей к замене остатка глицина в позиции 93 на аланин (Рисунок 82). Как упоминалось выше, в белке GlnK из B. subtilis одна из ключевых аминокислот – лизин в консервативной позиции 58, участвующий в связывании кетоглуторовой кислоты PII-белками, в белке бацилл заменен на аргинин (Рисунок 81). Чтобы проверить, является ли данная замена причиной отсутствия взаимодействия данного белка с 2-кетоглутаровой кислотой (Рисунок 58Г), аналогичным методом была сконструирована плазмида для гиперпродукции белка GlnK с заменой триплета CGT в позиции 184-186 на триплет AAG, что приводит к замене аргинина в позиции 62 на лизин.
Полученная плазмида pDG148-GlnK62 несет ген glnK с заменой остатка аргинина в позиции 62 на лизин (Рисунок 83).
Были получены белки GlnK62 и GlnK93 со степенью очистки 23 в количестве 15 мг и со степенью очистки 35 в количестве 12 мг, соответственно (Приложение 1). Белки были очищены до электрофоретической гомогенности, что было подтверждено путем электрофорезом в денатурирующих условиях в 15% полиакриламидном геле.
Далее исследовали характер взаимодействия полученных белков с различными лигандами. Чтобы охарактеризовать эффект мутации G93А в белке GlnK, исследовали взаимодействие очищенного рекомбинантного белка GlnK93 с нуклеотидами с помощью изотермальной титрующей калориметрии. Белок GlnK93 титровали растворами 2 мМ АТФ, 2 мМ АДФ, 2 мМ АМФ, 2 мМ ГТФ. При титровании белка GlnK93 ни одним из лигандов не наблюдалось термодинамических эффектов, в отличие от нативного белка GlnK (Рисунок 84). Следовательно, белок GlnK93 не способен связывать АТФ, и, по всей видимости, должен утратить свою регуляторную функцию в случае экспрессии в клетках бактерий.
При титровании белка GlnK62 раствором 2 мМ 2-кетоглутаровой кислоты в присутствии и отсутствии 2 мМ АТФ и 2 мМ ионов Mg2+ также не наблюдалось термодинамических эффектов (Рисунок 85). Это свидетельствует о том, что замена лизина на аргинин в белке GlnK бацилл не является причиной отсутствия взаимодействия с 2-кетоглутаровой кислотой. По всей видимости, данный регуляторным сигналом для белка GlnK в клетках бацилл является только уровень внутриклеточного АТФ, другими словами, белок является сенсором энергетического статуса клетки, в отличие от других PII-подобных белков.
Характеристика взаимодействия белка PotN с белками-партнерами в бактериальной двугибридной системе и in vitro
В результате наших исследований с помощью иммунопреципитации и ко-элюции было показано, что белок PotN в клетках лактобацилл взаимодействует с фактором транскрипции GlnR. Однако данные эксперименты не выявили взаимодействия PotN с белками PotA и PotD, которые расположены в одном опероне с PotN и с которыми он теоретически может связываться. Чтобы проверить возможность связывания PotN с белками PotA, PotD и GlnR, взаимодействие белков исследовали с помощью бактериальной двугибридной системы (Euromedex). Данный подход основан на восстановлении целостности Т25 и Т18 фрагментов аденилат-циклазы [CyaA] в случае образования стабильного комплекса между двумя исследуемыми белками, сшитыми с данными фрагментами фермента. При восстановлении целостности аденилат-циклазы происходит конститутивный синтез цАМФ, который в комплексе с БАК (белок, активирующий катаболизм] существенно повышает экспрессию лактозного оперона. Уровень экспрессии определяется по активности -галактозидазу. При этом величина активности -галактозидазы коррелирует с силой взаимодействия между исследуемыми белками.
Для проведения анализа гены белков GlnR, PotA и PotD были клонированы в вектор pKT25 с получением N- и С-концевых белковых фьюжн конструкций с Т25 фрагментом аденилат циклазы. Гены potN, potN91 клонировали в плазмиду pUT18 с получением С-концевых фьюжн-конструкций с Т18 фрагментом аденилат циклазы. Полученными плазмидами трансформировали штамм E. coli BTH101, дефектный по гену с собственной аденилат-циклазы. В качестве отрицательного контроля использовали плазмиды pKT25-pUT18, качестве положительного контроля – плазмиды pKT25zip-pUT18zip, несущие фрагменты лейцин-связывающего белка. Полученные рекомбинантные двухплазмидные штаммы выращивали в присутствии 0.2 мМ ИПТГ для снятия репрессии лактозного оператора и замеряли уровень активности -галактозидазы в клетках полученных штаммов.
Проведенный анализ показал, что в штаммах, экспрессирующих рекомбинантные белки PotN-Т18 и GlnR-Т25, PotN-Т18 и PotА-Т25, активность -галактозидазы была на уровне положительного контроля (Рисунок 118). Эти данные позволяют заключить, что белок PotN способен взаимодействовать с белками GlnR и PotA, в то время стабильного комплекса с PotD не образуется. Примечательно, что высокая активность -галактозидазы наблюдалась в том случае, когда Т25 фрагмент находился на N-конце белков GlnR и PotA, подтверждая, что свободный С-конец белков необходим для взаимодействия с белком PotN. В случае белка PotN91 активность -галактозидазы была идентифицирована во всех штаммах независимо от места локализации фрагмента Т25, что может являться следствием либо неспецифического взаимодействия, либо образования очень стабильного белкового комплекса.
Таким образом, с помощью бактериальной двугибридной системы было пдтверждено взаимодействие белков PotN-GlnR, а также показана возможность взаимодействия белков PotN-PotА. Поэтому для исследования взаимодействия белка PotA с белком PotN в условиях in vitro, ген белка PotA Lactobacillus brevis gravesensis был клонирован в экспрессионный вектор pET15b для гиперпродукции рекомбинантного белка в клетках кишечной палочки.
Однако полноценный белок PotA экспрессировался в нерастворимом состоянии. Моделирование глобулы белка PotA также выявило наличие двух доменов (Рисунок 119 А). При этом С-концевой домен данных белков является АТФ-связывающим, N-концевой домен связан с АВС-транспортером. Поэтому были отдельно клонированы N-концевой и С-концевой домены данного белка (Рисунок 33). N-концевой домен также экспрессировался в нерастворимом состоянии, и не удалось подобрать условий для его получения в растворимом виде. С-концевой домен белка PotA (PotAC) был получен в электрофоретически гомогенном состоянии (Приложение 1).
Как и у других транскрипционных регуляторов семейства MerR, у белка GlnR ДНК-связывающим является N-концевой домен с мотивом петля-поворот-петля (Рисунок 119 Б), а регуляторным – С-концевой, что было подтверждено экспериментами в бактериальной двугибридной системе. Поэтому можно ождиать, что гексагистидиновая последовательность на N-конце белка не должна нарушать взаимодействие GlnR с белками-партнерами.
Наличие чистых рекомбинантных белков PotN, PotN91, GlnR, PotAC с различными аффинными последовательностями позволило исследовать их взаимодействие методом ко-элюции на аффинных сорбентах Ni-NTA и Strepactin сефарозе. Белки смешивали в пропорциях 1:2, где 1 часть составлял белок с аффинной меткой, и инкубировали пробы в течение 1 час в отсутствии и в присутствии АТФ или АДФ в концентрациях 2 мМ, т.к. было показано их влияние на белок PotN (Рисунок 110). Элюаты анализировали при помощи электрофореза в денатурирующих условиях (Рисунок 120).
Проведенный анализ показал, что PotN слабо связывает белки GlnR и PotAC в условиях in vitro, при этом внесение АДФ подавляет это связывание. Напротив, присутствие АТФ в растворе стабилизировало белковые комплексы. Подтверждением влияния нуклеотидов на взаимодействие белков явилось отсутствие эффекта АДФ и АТФ на ко-элюцию GlnR и PotAC с мутантным белком PotN91, неспособным взаимодействовать с АТФ и АДФ (Рисунок 111).
Данный факт позволяет предположить, что замена Gly91Ala приводит к изменению конформации белка PotN, делая ее более подходящей для связывания с белками-партнерами. Вероятно, связывание с АТФ также приводит к переходу PotN в подобную конформацию, которая обладает большим сродством к белкам-партнерам.
Следовательно, в клетке белок PotN меняет свое сродство к белкам-партнерам в зависимости от внутриклеточной концентрации нуклеотидов. Выявленное методом ITC конкурентное связывание АТФ и АДФ с белком PotN позволяет заключить, что в условиях энергетического голодания клетки, когда соотношение АТФ:АДФ в клетке смещается в сторону преобладания АДФ, должна происходить диссоциация комплексов PotN-PotA, PotN-GlnR. Наоборот, в условиях положительного энергетического баланса белок PotN должен связывать белки-мишени.