Введение к работе
Іктуальпость темы. Клубеньковые бактерии (ризобии) - микроорганиз-1Ы, фиксирующие молекулярный азот атмосферы в симбиозе с бобовы-ш растениями. Интерес к ризобиям вызван как их сельскохозяйственной начимостью в связи с симбиотической азотфиксацией, так и тем, что обово-ризобиальный симбиоз - это одна из наиболее широко изучае-іьіх систем растительно-микробного взаимодействия. Изучение этого заимодействия может дать ответ на целый ряд вопросов, касающихся [роцессов, ответственных за формирование генетического разнообразия [риродных популяций микроорганизмов и эволюции клубеньковых бак-ерий.
Наиболее эффективным методом изучения природных популяций актерий является анализ их генетического разнообразия. При изучении лубеньковых бактерий результатом такого анализа может стать пони-іание процессов возникновения новых генотипов (мутации, генетические ерестройки, горизонтальный перенос генов) и процессов, определяющих удьбу генотипов в популяции (отбор и конкуренция, миграция штаммов, енетический дрейф). К настоящему времени большое число природных опуляций ризобий охарактеризовано с использованием изоферментного нализа. Проанализированы основные параметры популяционной струк-уры - гетерогенность популяции и неравновесие по сцеплению хромо-эмных генетических маркеров. Анализ факторов, определяющих гене-ический полиморфизм ризобий, показал, что растение-хозяин является лючевым фактором как для динамики ризобий в природных популяци-х (поддержание численности и стабильности ризобий), так и для увели-ения генетического разнообразия.
В настоящее время для характеристики ризобий широко исполь-утотся различные методы анализа ДНК. Преимущество этих методов эстоит в том, что они позволяют получать стабильные характеристики,
более тесно связанные с генотипом, позволяющие анализировать любые участки ризобиального генома и не зависящие от физиологического статуса микроорганизма. С помощью методов анализа ДНК могут быть проанализированы участки, содержащие симбиотические гены, изучение которых невозможно с использованием других методов. Анализ симбио-тических участков генома ризобий особенно важен для выявления роли растения-хозяина в процессах формирования генетической структуры природных популяций клубеньковых бактерий. Представляет большой интерес использовать методы анализа ДНК для изучения таких параметров, как гетерогенность популяций и неравновесие по сцеплению между генетическими маркерами. Однако работ, сочетающих использование методов анализа ДНК с эффективными методическими подходами к анализу популяционнои структуры и процессов ее определяющих, очень мало.
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлся молекуляр-но-генетический анализ популяции Sinorhizobium meliloti Европейско-Сибирского генцентра люцерны. В задачу исследований входило:
выделить природные штаммы клубеньковых бактерий люцерны на двух удаленных участках из-под растений-хозяев двух различных видов - дикорастущих люцерны и донника, входящих в группу перекрестной инокуляции люцерны;
определить видовую принадлежность штаммов с помощью рест-рикционного анализа гена 16S рРНК;
изучить генетическое разнообразие популяции с помощью RFLP-анализа 5 участков генома (leu, гесА - хромосома; nodDlABC, nodD2 — мегаплазмида-1; ехр — мегаплазмида-2), анализа плаз-мидного состава штаммов и геномного ISi?m2011-2 фингерприн-тинга; изучить влияние растения-хозяина и географического происхож-
дения штаммов на генетическое разнообразие популяции клубеньковых бактерий люцерны;
с использованием современных статистических методов оценить основные параметры генетической структуры популяции -гетерогенность и неравновесие по сцеплению между RFLP-типами. Гаучная иовизпа работы. В настоящей работе впервые:
изучена природная популяция клубеньковых бактерий S.meliloti, относящаяся к Европейско-Сибирскому генцентру люцерны. 56 природных штаммов S.meliloti охарактеризованы с использованием метода RFLP, анализа состава криптических плазмид и ISKm2011 -2-фингерпринтинга;
в геноме S.meliloti выявлен участок (фрагмент симбиотической плазмиды, содержащий гены nodDlABC), структура которого существенно различается у штаммов, выделенных из-под донника и люцерны;
с помощью метода RFLP определены основные параметры структуры изученной популяции: гетерогенность популяции по пяти различным участкам ризобиального генома (leu, гесА — хромосома; nodDlABC, nodD2 — мегаплазмида-1; ехр - мегаплазмида-2) и неравновесие по сцеплению между RFLP-типами; показано, что хромосомные гесА RFLP-типы и Sym-плазмидные nodDlABC и nodD2 RFLP-типы ассоциированы у штаммов данной популяции случайным образом, на основании чего сделан вывод о возможности переноса симбиотических плазмид между штаммами;
показано, что в данной популяции существуют две генетически обособленные группы штаммов, контрастно различающихся по ряду молекулярно-генетических признаков: leu RFLP-типу, наличию криптических плазмид, числу копий ISRm2011-2 элемента.
Практическая значимость.
Установлено, что 13Ктп2011-2-фингерпринтинг обладает большой разрешающей способностью. Данный метод позволяет наиболее точно идентифицировать штаммы S.meliloti и может быть использован для целей идентификации и мониторинга.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на 1-ом Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), 1st European nitrogen fixation conference (Szeged, Hungary 1994), 10th International congress on nitrogen fixation (St.Petersburg, 1995), 2nd European nitrogen fixation conference and NATO advanced research workshop (Poznan, Poland, 1996), 2-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертация включает введение, 4 главы, состоящих из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 85 страницах текста, иллюстрирована 14 рисунками, включает 15 таблиц. Список литературы состоит из 114 источников, из них 94 - зарубежных авторов.
Работа выполнена в лаборатории генетики и селекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.