Введение к работе
Актуальность проблемы. Фототрофные пурпурные несерные бактерии, относящиеся к семейству RhodospiriUaceae - это гракотрипательные водные микроорганизмы, осушествляющие аноксигеяный тип фотосинтеза и способные к азотфиксации. Благодаря этим особенностям представители семейства RhodospiriUaceae.широко распространены в природных экосистемах и являются их важными компонентами.
Особый интерес к пурпурным несерным бактериям обусловлен, прежде всего, их широкими метаболическими возможностями. Представители RhodospiriUaceae способны к . пяти различным. типам роста: фотолитоавтотрефному росту за счет энергии солнечного света с использованием Н2 в качестве донора электронов и С02 в качестве акцептора электронов и источника углерода; фотогетеротрофному росту в анаэробных условиях с использованием различных органических соединений в качестве донора электронов; анаэробному (ферментативному) росту в темноте с использованием различных Сахаров в качестве доноров электронов и единственного источника энергии; аэробному хемогетеротрофному росту в темноте; аэробному хемолитоавтотрофному росту в темноте с использованием 1 в качестве источника энергии, 02 в качестве акцептора электронов и СОг в качестве источника углерода - (Madigan--and- Gest," 1979). Поэтому неудивительно, что представители пурпурных несерных бактерий используются в качестве модельных объектов для изучения ряда фундаментальных биологических процессов: фотосинтеза, биогенеза мембран, фиксации углекислого газа и молекулярного азота. Широкие метаболические возможности пурпурных несерных бактерий позволяют исследовать взаимодействие этих процессов на уровне их- генетического контроля, тогда как в других биологических системах эти процессы разобщены.
Исследование механизмов генетической регуляции азотфиксации у пурпурных несеркых бактерий, способных осуществлять этот процесс за счет энергии солнечного света, представляет не тольхо теоретический, но и практический интерес Фотосинтезирующие пурпурные несеряые бактерии являются перспективными объектами биотехнологии и могут бкгь использованы для решения практических задач очистки сточных вод от тохеичных соединений, в качестве продуцентов биотоплива () и биологически активных соединений, а также источника белково-витамикной биомассы для животноводства. Например, показано, что по содержанию убихикота Qjo, вепользуемого в
медицине, пурпурные несерные бактерии в 200 раз превосходят дрожжи, являющиеся промышленным продуцентом этого соединения (Гоготов, 1988).
К началу ваших исследований (1980 г.) наиболее быстрыми темпами развивалась генетика азотфиксации у Klebsiella pneumoniae, представителя семейства Enterobacteriaceae. Выбор K.pneumoniae в качестве модельного объекта был обусловлен ее генетической близостью к E.coli, что дало возможность исследовать K.pneumoniae с помощью всего арсенала методов генетики бактерий и молекулярной генетики. Среди пурпурных бактерий основными объектами для изучения генетического контроля процесса азотфиксации и его регуляции стали Rhodobacter capsulatus и Rhodobacter sphaeroides, у которых были получены мутанты, дефектные по метаболизму азота (Зиновьева и др., 1980; Shestakov et ah, 1979; Wall et al., 1975, 1976; Willison and Vignats, 1982). Однако в геиепіческом плане эти бактерии были плохо изучены. Процесс генетичесхой рекомбинации у фототрофных бактерией впервые был описан у R.capsulatus. У этой бактерии обнаружили уникальную систему переноса генетической информации, так называемую капсдукцию, осуществляемую фагоподобными частицами GTA (gene transfer agent; Mans, 1974). Однако небольшой размер фрагментов трансдуцирующей ДНК ограничивал использование GTA для анализа неспепленпых генов. Кроме того, GTA-капсдукция осуществляется только в пределах определенных штаммов одного вида - R.capsulatus. Разработка систем конъюгацнонного переноса хромосомных генов R.sphaeroides и R.capsulatus, основанная на использовании плазмид IncP-группы (Mans, 1981; Sistrom, 1977; Pembertoa and Boven, 1981), послужила толчком для дальнейшего развития генетики фотосинтезирующих пурпурных бактерий. Эти работы явились для нас предпосылкой создания систем клонирования генов в клетках пурпурных бактерий и изучения генетичесхого контроля азотного метаболизма. В качестве объела исследования использовали штамм R.sphaeroides 2R, выделенный сотрудниками кафедры микробиологии МГУ под руководством .Е.Н.Кондратьевой и оказавшийся удобной моделью для молекулярно-генетичесхого изучения азотфиксации на кафедре генетики и селекции МГУ под руководством СВЛІестахова.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении механизмов генетической регуляции азотного метаболизма у R.sphaeroides.
В задачи исследования входило:
1. Исследование плазмид различных штаммов R.sphaeroides с целью возможного использования их для создания векторов клонирования.
-
Разработка систем переноса векторных плазмид в клетки пурпурных бактерий.
-
Создание различных типов векторных плазмид для клонирования генов в клетках R.sphaeroides.
-
Исследование в клетках R.sphaeroides экспрессии генов K.pneumoniae, контролирующих процесс азотфиксации.
5. Клонирование и молекулярный анализ гена glnA R.sphaeroides,
кодирующего глутаминсинтетазу <ГС); выяснение роли гена glnA в регуляции
синтеза и активности яитрогеназы (НГ) и метаболизма ионов аммония.
6. Молекулярно^генетический и физиолого-биохимнческий анализ мутантов
пурпурных бактерий с плейотрошшми нарушениями азотного метаболизма.
7. Клонирование, идентификация и изучение генов, участвующих в
регуляции метаболизма азота у R.sphaeroides.
-
Исследование экспрессии генов, контролирующих процесс азотфиксации у пурпурных несерных бактерий, в клетках различных штаммов R.sphaeroides.
-
Построение схемы генетической регуляции азотфиксации у R.sphaeroides.
Научная новизна. Разработано новое направление генетики фотосинтезирующих пурпурных бактерий, основанное на использовании методологии генной инженерии. Созданные новые системы переноса, клонирования и анализа генов позволяют решать широкий крут задач молекулярной генетики этой группы бактерий.
Выделена и охарактеризована новая плазмида IncQ-группы - R89S, репликация которой зависит от ДНК-полимеразы I и осуществляется в отсутствии синтеза белка de novo. Показано, что плазмида R89S является удобной основой для создания интегративньгх векторов клонирования, позволяющих вводить генетическую информацию в хромосому или эндогенные плазмиды фотосинтезирующих пурпурных бактерий.
Клонирован и секвенирован ген glnA R.sphaeroides; показано, что он входит ,в состав оперояа glnBA, транскрипция которого glnBA осуществляется с NtrC-зазнсимого прсмотора, расположенного в лидерной области гена ntrB. Определена молекулярная природа мутации gInA83, инактивируюпдей продукт гена glnA и нарушающей регуляцию синтеза и активности НГ ионами аммония.
Обнаружены v новые гены ntrE, fitrD и ntrX R.sphaeroides, которые принимают участие в регуляции азотного метаболизма и не имеют гомологии с известными генами, контролирующими этот процесс у бактерий. Установлено, что эти гены расположены в одном кластере с оперояом glnBA. Ген ntrX принадлежит к неизвестной ранее двухкомплектной системе регуляции
адаптивного ответа бактерий, которая наряду с системой NtrB/NtrC принимает участие в контроле азотного метаболизма у R.sphaeroides.
Клонированы неизвестные ранее гены adgA (nadE) R.sphaeroides и R.capsulatus,- мутации в которых оказывают плейотропный эффект на азотный метаболизм. Показано, что ген adgA непосредственно не вовлечен в регуляцию азотного метаболизма, но мутации в этом гене могут оказывать непрямой метаболический эффект на способность к азотфиксации.
Клонированы ретуляторные гены ntrB и ntrC R.sphaeroides и установлена молекулярная природа плейотропной мутации ntrC12, нарушающей регуляцию азотного метаболизма. Показано, что в клетках R.sphaeroides гены ntrB и ntrC участвуют в регуляции не только азотфиксации, но и других систем азотного метаболизма. Впервые установлено, что основным фактором, обуславливающим сходный комплекс изменений в азотном метаболизме у мутантов по генам glnA, ntrB и ntrC с дерепрессированной НГ в присутствии высоких концентраций аммония, является низкий уровень активности ГС в их клетках. На основании молекулярно-генехического изучения генов ntrB и ntrC, а также анализа * экспрессии регуляторних nif-генов R.sphaeroides и R.capsulatiis предложена схема генетической регуляции азотфиксации у R.sphaeroides в зависимости от азотного статуса клеток.
" Впервые выявлена роль гена ійгС у фототрофных бактерий в контроле углеродного метаболизма я установлено, что регуляция азотного к углеродного/энергетического метаболизма сопряжены на генетическом уровне.
Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе новые данные о генетическом - контроле метаболизма азота у R.sphaeroides способствуют более глубокому пониманию механизмов регуляции процессов азотфиксации и азотного метаболизма. Полученные результаты свидетельствуют о взаимосвязи на генетическом уровне азотного метаболизма и углеродного метаболизма, что по-новому освещает проблему координации этих фундаментальных биологических процессов у фототрофных бактерий.
Клонированные гены пурпурных бактерий могут быть использованы в качестве зондов для выявления гомологичных генов у других микроорганизмов. Описанные в работе системы клонирования и переноса генов могут найти широкое применение в генно-инженерных исследованиях на других видах микроорганизмов, особенно тех, для которых методы генетической трансформации не разработаны или неэффективны.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Ш, VI и IX Всесоюзных совещаниях по программе "Плазмнда" (Пущино, 1980, 1981, 1984), IV, V съездах ВОГИС им. Н.И.Вавилова (Кишинев, 1981; Москва, 1987), IV, VII и VIII Международных симпозиумах по фототрофным прокариотам (Бомбан, Франция, 1982; Амерст, США, 199l"v Урбино, Италия, 1994), III и V Международных симпозиумах по азотфиксации у небобовых (Хельсинки, Финляндия, 1984; Флоренция, Италия, 1990), Всесоюзной конференция "Новые направления биотехнологии" (Пушино, 1984), VI и VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987, 1990), VII, IX и X Международных конгрессах по азотфиксации (Кельн, ФРГ, 1988; Канкун, Мексика, 1992; Санкт-Петербург, 1995), IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), Международной конференции "Проблемы и перспективы современной биотехнологии" (Братислава, ЧССР, 1989), VIII Восточно-европейском симпозиуме по биологической азотфиксации (Саратов, 1992), 9 Баховском коллоквиуме по азотфиксации Москва, 1995).
Структура и объем диссертации. Диссертация; состоит из введения, описания материалов и методов исследования, пяти глав экспериментальной части с изложением результатов работы и их обсуждения, (заключения) основных выводов и списка цитированной литературы. Материалы диссертации изложены из 335 стр. машинописного текста, включают 51 рисунок и 36 таблиц. Список литературы включает 274 наименования.