Введение к работе
Актуальность темы. Облигатные метилотрофные бактерии используют цля роста в качестве источника энергии и углерода только одноугле-родные субстраты или соединения, содержащие более одного атома углерода, но не имеющие С-С связей. Достигнутые успехи в изучении 5иохимических путей окисления, ассимиляции С-1 соединений тесно связаны и с развитием биотехнологии. Использование легкодоступных эдноуглеродных соединений, в частности метанола; как субстрата в крупномасштабных процессах культивирования является наиболее рентабельным, экологически чистым и позволяет получать продукты различного назначения. Нет сомнений, что внедрение облигатных метилотрофов в микробиологическую практику открывает широкие перспективы для развития промышленности бактериального синтеза. Несмотря та достигнутые успехи в изучении биохимии облигатных метилотрофов, з генетическом отношении они остаются малоизученными объектами. Данные по клонированию и изучению генов метилотрофов получены, "лавным образом, на факультативных организмах, и в настоящее время усилия исследователей сосредоточены на изучении генов первичного экисления С1 - соединений. В этом направлении можно ожидать значительных успехов в ближайшем будущем. Что касается генов общего метаболизма, то представленные в литературе данные носят отрывочный сарактер и, в основном, описывают принципиальную возможность комп-іементации мутаций Е. сої і. Нет оснований ожидать существенных от-шчий в функционировании генетического аппарата метилотрофов и хо-юшо изученных в генетическом отношении гетеротрофных бактерий -;. сої і, Б. subtil is. Тем не менее остается открытым вопрос по )рганизации биосинтетических генов метилотрофных бактерий, нет іанньїх о молекулярных механизмах их регуляции, отсутствует инфор-іация по оперонным структурам. Желание ответить на некоторые из *тих вопросов определило наш интерес к пути биосинтеза треонина )блигатной метилотрофной бактерии М. flagellatum. Выбор данного биохимического пути для исследования сделан на основании ряда при-шн. Во-первых, к началу выполнения настоящей работы была накоплена шформация относительно биохимических превращений в пути биосинтеза этой аминокислоты на уровне работы ферментов и их регуляции. Ъ-вторых, эксперименты по переносу хромосомы в коньюгационных :крещиваниях показали, что, по крайней мере, три из пяти генов би-)синтеза треонина могут выражаться в клетках Е. coli. В-третьих,-в штературе накоплено достаточно информации по молекулярной органи-іации генов биосинтеза треонина у различных микроорганизмов, вклю-іая дрожжи. Эти данные, в сравнении с полученными, несомненно, бу-
- г -
дут представлять интерес и в эволюционном аспекте. Кроме того, ра бота по конструированию штамма-продуцента треонина на метаноле яв ляется актуальной и, безусловно, наряду с использованием методо селекции и мутагенеза, требует развития генноинженерной методоло гии.
Цель и задачи исследования. Основной целью данного исследовани являлось изучение организации и функционирования генов биосинтез треонина у облигатной метилотрофной бактерии М. flagellatum. Для осуществления поставленной цели решались следующие задачи:
клонирование индивидуальных генов биосинтеза треонина;
физическое картирование и локализация генов на клонированны фрагментах хромосомы;
изучение экспрессии генов в Е. сої і под собственными и гетероло гичными регуляторними элементами, идентификация продукто экспрессии;
определение нуклеотидных последовательностей структурных и при легающих областей генов hom, thrC, и thrB;
изучение работы промоторов индивидуальных генов в клетках Е. col и М. flagellatum;
гибридизация суммарных мРНК метилотрофа с клонированными фраг ментами ДНК для проверки оперонной организации генов;
анализ нуклеотидных и белковых последовательностей с известным последовательностями генов и белков, выполняющих схожие функции
локализация существенных доменов в первичных структурах фермен тов, конструирование новых измененных форм гена гомосериндегид рогеназы с целью снятия ретроингибирования конечным продуктом;
создание эффективной искусственной оперонной структуры с генам биосинтеза треонина;
конструирование удобных векторных систем для работы в Грамотри цательных бактериях.
Научная новизна и практическая значимость работы. В числе первы генов анаболических путей метаболизма облигатных метилотрофов кло нированы четыре гена биосинтеза треонина М. flagellatum - ask hom, thrC, thrB. В отличие от энтеробактерий показана оперонна организация только двух генов - hom и thrC. Локализован промотор ный участок оперона и изучена его работа в клетках Е. сої і и М. flagellatum. Определена полная нуклеотидная последовательност: структурных и прилегающих областей генов hom, thrC и thrB. Локали зованы активные центры ферментов и генноинженерными методами полу чены формы мутантного гена гомосериндегидрогеназы, кодирующеп
фермент, нечувствительный к ретроингибированию. Показана новая форма гена t/irB у облигатного метилотрофа, кодирующего принципиально иную гомосеринкиназу в сравнении с ферментами других изученных микроорганизмов. Предложена модель функционирования кофер-мент-евязывающего домена гомосериндегидрогеназы, обеспечивающая взаимодействие фермента с обоими НАД'Н2 и НАДФ*Н2 кофакторами. Сконструирована искусственная оперонная структура с тремя генами биосинтеза треонина, отвечающая требованиям эффективной экспрессионной системы для грамотрицательных бактерий. Создан ряд удобных векторных плазмид широкого круга хозяев различного назначения. На основе ряда особенностей функционирования генетического аппарата, данных по нуклеотидным последовательностям 5S и 16S рРНК л сравнения аминокислотных последовательностей известных гомосе-риндегидрогеназ, треонинсинтаз и гомосеринкинаэ выдвинуто предположение о формировании вида М. flagellatum на поздних этапах эволюции эубактерий. Полученная информация по организации и функционировании генов биосинтеза треонина М. flagellatum вместе с сознанными генетическими конструкциями представляют собой основу следующего этапа работы - конструирования штамма-продуцента треонина га метаноле.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, материалы и методы, результаты и их обсуждение А главы), выводы, приложение, список литературы (142 наименова-шя). Содержит 25 рисунков и 6 таблиц. Объем работы ... - стр.