Введение к работе
Актуальность проблемы. В обеспечении культурних растений азотом большое значение имеет симбиотйческая азотфш:сапия,которая определяется скоординированшлл взаимодействием генотипов бобових растений и клубеньковых бактерий семейства Шііго-ь.іасєае. Несмотря на больше потенциальные возможности сим-биотяческой азотфяксации, заменить большую часть минеральных удобрений удастся лишь в том случае, если отот процесс будет существенно интенсифицирован. Практически единственнпм используемым в настоящее время способом интенсификация процесса сим-бйотической азотфиксации является внесение в почему препаратов, содержащих отселектированше штаммы клубеньковых бактерий.Известно, однако, что отзывчивость некоторых культур на инокуляцию бывает очень низкой, в частности, у такой широко возделываемой в нашей стране зернобобовой культуры, как горох (Ко-яемяков, Доросинсішй, 1981). Основными причинами такой ситуации являются наличие в почве высококонкурентноспособных, но малоэффективных рас клубеньковых бактерий и отсутствие селекции бобовых растений по симбиотическим признакам. Поэтому одним из перспективных направлений интенсификации процесса сим-биотической азотфиксации должно стать создание высокоэффективных комплементарных пар макро- и микросимбионта.
Вакнейшая роль растения-хозяина в процессе формирования и функционирования симбиотического аппарата на сегодняшний день не вызывает сомнений. Методами классического генетического анализа у бобовых растений обнаружено несколько десятков генов, контролирующих все зтапн фортлирования симбиоза. У гороха известно более 20 таких генов (Kneen et al.,I987; Vance at al., 1988), контролирующих, в основном, ранние стадии фор-«лированпя сиглбяоза. На более поздних стадиях развития симбиоза труднее вычленить роль растения-хозяина, настолько велико здесь взаимодействие двух симбионтов, поэтому и возможности классического гибридологического анализа при таких условиях , зуществеяяо ограничиваются. Эти трудности преодолеваются о использованием молекулярно-биохимических методов. Известно, ЧТО процесс формирования и функционирования сямбяотического аппа-эата сопровождается изменением экспрессии некоторых растительных и бактериальных генов ( Verma et al.,I984; Govers et al.,
1985). Необходимым начальным этапом изучения отях генов является идентификация продуктов их трансляции. Кроме чисто практического интереса - использование генов бобовых в селекционных программах - анализ молекулярно-генетических механизмов формирования симбиоза представляет несомненный теоретический ' интерес, связанянй с взаимоотношением про- и эукаритических организмов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явился молекулярно-гекетический анализ механизмов взаимодействия между ГОрОХСМ ( P. sativum L. ) и Й. .leeuminosarum bv.vlciae на двух основных этапах формирования сшлбиоза: стадии инфицирования и стадии сформировавшегося клубенька.
Конкретніш задачи работы состояли в следующем:
- изучение признака устойчивости к заражению европейскими
штаммами клубеньковых бактерий у трех линий афганского проио-
хоядеякя и характера наследования отого признака в потомстве
гибридов от скречивашч линий гороха афганского и европейско
го происхождения; получение константных линий гороха, устой
чивых к заражению европейскими штаммами бактерий и о фенотя-
пическими признаками окультуренных Горохов;
- - идентификации белков - продуктов растительных и бактериальных генов, участвующих, в формировании и функционировании симбиотического аппарата, и определение функциональной значимости этих белков с использованием двух модельных систем: I -лишаї гороха афганского и европейского происхождения и комплементарные им штаммы (А-І и 250а); 2 - линии гороха европейского происхождения и два европейских ризобиальных штамма, (эффективный штамм 250а и неэффективный 2486);
- определение гомологии некоторых-из этих белков у нес
кольких видов семейства бобовых с помощью шдмукохимических
методов,-
Научная новизна. В работе впервые сделан генетический анализ признака "устойчивость в клубенькообразоваяию" линий .гороха афганского происходдения при взаимодействии с ризоби- . альяш штаммом 250а. Показано, что изученные афганские линии гороха не обладают полной устойчивостью к заражению этим штаммом. Идентифицирован растительный белок, синтезируемый <*е novo в корнях гороха при заражении комплементарным штаммом клубеньковых бактерий, который может служить специфическим белковым 2
маркером успешного взаимодействия мекро- и шгаросимбионта на ранних стадиях Формирования симбиоза.
- В работе дан сравнительный анализ спектров водорастворимых цитоплазматических белков из корней я клубеньков гороха, образованных эффективным штатом 250а и неэффективным штаммом 2486, идентифицированы лодулиян - белки растительного происхождения, синтезируемые йе novo при взаимодействии с бактериями, и белки, синтез которых уменьшается или прекращается . в клубеньках (рутины). Показана универсальность одного из них для семейства бобовых. Показало иммунохимическое родсіво трех нодулинов, связанных с симбиотической азотфяксацией, у люпина и гороха.
Практическая ценность. В результате индивидуального анализа гибридных растений 1"2 от скресшвачия линий гороха афганского и европейского происхождения получены 5 константных линий, устойчивых к заражению штаммом 250а. Эти линии гороха -удобная модель для дальнейшего изучения ранних стадий форми-, рованяя бобово-ризобиального сшлбиоза. Полученные линии могут быть использованы в качестве доноров генов устойчивости к заражению европейскими штаммами клубеньковых бактерий в селекционных программах.
. Апробация работы. Результаты работы докладывались на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", 1986 г. г.Пущияо; на 7 съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров, Москва, 1987 г.; на УШ Всесоюзном Ь'аховском коллоквиуме по азотфяксащш, Кобулеттй, 1988 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и.объем диссертации.-Диссертационная работа сос^ тоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения в 5 главах полученных результатов ж их обсуждение, выводов и списка литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками и 9 .таблицами. Список литературы, включает Й29 наименований, из них 7 - на русском языке.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОЇН
Материалы и методы исследований
Растительный материал и постановка вегетационных опытов. Две линии гороха (Pisum sativwn L. )афганского происхоадения -31/6 и 28Д5 - получены во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии в лаборатории биотехнологии из образцов гороха Всесоюзного института растениеводства (ВИР) с коллекционными номерам К 6559 и К 6106 соответственно. Линия 2150 афганского происхоадения получена из коллекции семян С.Бликота (Швеция) в каче-отве носителя гена аут 2, контролирующего устойчивость к заражению европейскими штаммами клубеньковых бактерий (н0ц, 1975; Lie, 1976). Линия гороха европейского происхождения 32/ 12 выделена в нашем институте из сорта "Местный" (К 6335) путем отбора на повышенную эффективность симбиотической аэотфик-сации (Макашова и др., 1985). Две другие линии европейского происхоадения - 1714 и 1238 - получены из коллекции семяя гороха С.Блякста. .
В работе были также использованы и некоторые другие виды семейства бобовых. Семена этих растений получены из коллекции ИФа: бобы ( Vioia faba L. ), К 1617; люішн ( Lupinus lutens L. ), К 1943; нут ( Cicer arientinum L. ), К II8I; сераделла ( Oraithopus sativue Brot. ), К 38616; соя ( Glycine шах I» ), К 7208; фасоль ( Phaseolue vuXearis L. ), К 14279.
Для размножения растительного материала и для проведения скрещивания проросшие семена гороха высаживали в почву в сосуды объемом 5 л; для оценки гибридного материала по признаку клубеяькообраэовашш и для получения клубеньков проростки высаживали в стерильный песок по одному в каждый сосуд объемом 0,5 л с добавлением питательных элементов (ПрянишниковД962), дез азота. Инокуляцию проводили водной суспензией бактерией в расчете 10-10 клеток/растение. Для цитологического и биохимического изучения начальных стадий формирования симбиоза проростки высаживали в кюветы со стерильным 'вермикулитом с добавлением питательных.элементов, без азота. Опыты проводили' віусловиях теплицы или вегетационного домика (в течение летнего периода).
, Скрещивания между отдельными линиями гороха проводили на стадии бутонизации-цветения.
Нитрогеназную активность измеряли ацетиленовым методом
[Алисова, 1979). .
Дтаммы бактерий и их культивирование. Для инокуляции гороха использовали три итамма R .leguminosarum bv.viciae из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии: 250а - производственный штамм; 2486 - неэффективный штамм, образует на . корнях растений много мелких, белых клубеньков, не фиксирую-дих азот; A-I - штамм, способный преодолевать устойчивость к эбразованию клубеньков у линий гороха афганского происхождения, обладает высокой конкурентноспособностью по отношению к птамму 250а (Четкова, Тихонович, 1986). .
Для инокуляции люпина использовали штамм R .luplni 367а аз коллекции ВНИИ сельхозмикробиологии.
Бактерии R .leguminosarum в зависимости от задачи исследования выращивали либо в пробирках на скошенном бобовом агаре в темноте при 28С в течение 3-х суток, либо в жидкой сре-це Тї ( Beringer,I974) в колбах на качалке при 140 об/мин. в течение суток. Для бактерий R .lupini использовали маняитно-щрожжевую среду (Федоров и др., 1983). Бактерии культивировали в темноте при 28С в течение 5 суток. Ірйготовление белковых проб для электрофореза. Клубеньки и ... юрки гомогенизировали растиранием в фарфоровой, ступке с жидким азотом до состояния пудрн. Гомогенат центрифугировали при [5000 g в течение 20 мин. В полученный супернатант, содержаний водорастворимые цитоплазматические белки, добавляли буфер, равный по объецу супернатанту, следующего состава: 0,125 Ш Грис HCI рН 6,8, 2% ДСН (додецилсульфат натрия), 5% /-мерка-иоэтанол (буфер для белковых проб). Кипятили 1-2 глин, на водяной бане.
Бактероид-содержащие клетки из клубеньков выделяли с по
мощью ферментативной обработки клубеньков с последующим цент
рифугированием изолированных клеток в градиенте плотности -
з'ерколла (Uheda.Syono, 1987). Гомогенизировали клетки и цент
рифугировали при 15000 g 20 мин. Супернатант отбирали и до
бавляли буфер для проб. .!..'.
Выделение бактероидов проводили методом центрифугирования з градиенте плотности перколла ( Reibach, 1981). Бактероида .. разрушали кипячением на водяной бане в течение 5 мин. в буфере следующего состава: 50 М Трис HCI, рН 6,8, 5^.,в-меркапто-этанол, 2% ДСН, а затем центрифугировали при 15000 g 20 мин, Злектройорез и иммуяоблотинг белков.Электрофорез в денатури-
руицих условиях проводили в присутствии ДСН в блоках 12-15
ШШіаКрИЛаШДіїОГО ГЄЛЯ (ШАГ) ПО меГОДу ЛЭММЛИ ( Laemmli, 1970)
"Иативный" электрофорез проводили в блоке 7,5$ ПААГ без ДСН. При двумерном электрофорезе в качестве первого направления служил "иативный" электро<Тлрез. Дорожку геля первого направления в течение 30 мин. "уравновешивали" следующим буфером: 50 мМ Трис НСІ, рН 6,-,2,5 fi-меркаптоэтанол; 2% ДСН - и укладывали на старт концентрирующего геля. Гели окрашивали 0,25$ ку-масси. Молекулярные массы белков после ДСН-электрофореза определяли с использованием стандартной, смеси белков ("Фармация", ЛКБ) о молекулярными массами: 94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 кДа. Ееліш с.геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану (ШСБ, 0,45 мкм) электрофоретически (аппарат " Трансфер", ЖБ) в 0,25 М иа-фосфатном буфере, рН 6,5. Нитроцеллюлозу блокировали 3% обез.шреяннм сухим молоком, приготовленным на IBS -буфере (20 iU Трис, 500 Ш НаС1 , рН 7,5). Обработку первыми антителами проводили в течение ночи. Б качестве вторых антител использовали антитела против иммуноглобулинов кролика, кокъюгированные с нероксидазой, либо белок А, меченый I. Комплексы антиген-антитело визуализировали либо ферментативным "окрашиванием о-дианизидином (25 мкг/мл) в присутствии .. 0,02 HgOg, либо авторадиографией. В качестве первых антител использовали: антитела против клубенъкошспецифичннх белков, леггемоглобииа, Н. 18 люпина желтого (Lupinus luteua L. ),предо ставленные д-ром Ц.Мондкаком и д-ром А.Легоцким (Сельскохозяйственный университет, Познань, ШІР); антитела против тотальных водорастворимых цигоплазматических белков, вццеленшк наш из эффективных клубеньков гороха; сыворотка против этих, белков получена в кооперативе "Шшроанализ" (Москва). Для получения іиіубєнькоБоспещішичннх антител высаживали из зтой сыворотки ишуноглобулшювую фракцию 35% ( МН^)^0^, рН 8,0 ( Harboe, ingiid,I972) и очищали ее методом иміуноауфшой хро-матограгоіш на СНВг-активированной ее^арозе 4В ("Фармация"), иммобилизованной корневыми белками.
Цитологические методы. Изучение начальних стадий ин&кцирова- ' лия проводили с помощью светового микроскопа с предварительным окрашиванием корней в растворе 0,01/2 метиленового синего в течение 15 ми к. ( VasBe.TrucUet, IS84).
Изучение структуры клубеньков гороха, образованных оффек-6
тивным и неэффективным штаммами клубеньковых бактерий проводили с помощью электронного микроскопа. Клубеньки фиксировали в 2,5$ глютаровом альдегиде, 1%. 0В0^, I!? галовой кислоте. Срезы готовили на Ультратоме 3 (ЖБ), контрастировали уранялацета-том и цитратом свинца и просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе Н-300 ("Хитачи").
Статистическую обработку данных по гибридологическому анализу проводили методомХг (Глотов и др., 1983).