Введение к работе
Акт2альность_проблеш. Азотфиксирующий симбиоз между бобовими растениями и почвенными бактериями родов Ehlzobium, Bradyrhizoblum и Azorhlzoblvm является процессом, позволяющим растению-хозяину утилизировать азот атмосферы, переводя его в доступные для растения восстановленные формы; в свою очередь, бактериальный партнер получает доступ к продуктам растительного фотосинтеза. С генетической точки зрения становление и функционирование 'симбиоза - сложный многоступенчатый процесс, в основе которого лежит координированное взаимодействие геномов обоих симбионтов. Один из аспектов исследований - идентификация и анализ генов растения- хозяина (syra-генов и генов нодулинов), дифференциально экспрессиругацихся в процессе развития «шбиоти-ческих взаимоотношений. (Ые, 1971; Verraa, Miao, 1992) и одшш из наиболее интенсивно изучаемых генов нодулинов, экспрессиру-ющихся на ранних стадиях симбиогенеза является ген EN0D12, идентифицированный впервые у гороха и представленный в его геноме двумя копиями - EN0D12A и EN0D12B (Scheres et al., 1990; Govers et al., 1991). О функции EN0D12 имеется множество косвенных данных (например, инициация его транскрипции под действием биологически активных детерминант), однако до настоящего момента не было информации о межвидовой и внутривидовой вариабельности этого гена, а также о возможностях изучения EN0D12 методами классической генетики. Поэтому с 1991г в лаборатории биотехнолопш ВНИИСХМ такие эксперименты были начаты. Данная работа выполнялась при финансировании программами "Интер-биоазот - 2000", "Приоритетные направления генетики" и "Биотехнология", а также грантами R6KO00 (ISF) и №Y0 (Нидерланды). Ц_Н_5а1й!_52' Целью настоящей работы явился молекулярно-генетический анализ EN0D12, представленного 'копиями EN0D12A и EN0D12B,
Конкретные задачи исследования состояли в следующем: - идентификация с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) у различных видов- бобовых последовательностей, гомологичных EN0D12 гороха, и анализ полиморфизма выявленных генов на уровне первичной структуры.
изучение межсортового полиморфизма EN0D12A и EN0D12B у различных генотипов гороха, в особенности у линий, обладающих контрастными симбиотическими свойствами (линии европейского, афганского и иранского происхождения).
анализ различных линий гороха афганского происхождения с помощью недетерминированной ПЦР (RAPD) (Williams et al.i 1990) для выявления их генетического полиморфизма на молекулярном уровне и изучение вариабельности EN0D12A и EN0D12B у этих линий.
изучение наследования EN0D12A и EN0D12B в потомстве а также совместный анализ наследования этих генов с симбиотической мутацией sym2 для выявления их возможной идентичности.
анализ сцепления ШЛИ 2 с морфологическими маркерами гороха.
Начная_новизна. В работе проведен молекулярно-генетический анализ одного из растительных генов, экспрессирующихся на ранних стадиях симбиоза. В результате показано наличие группы EN0D12 у различных бобовых и определена первичная структура гена EN0D12B у бобов (УIda faba L.). При анализе этого гена у гороха был обнаружен полиморфизм его промоторной области в различных линиях, часть из которых несет другие sym-мутации (линии афганского и иранского происхождения).
С помощью метода RAPD исследована выборка линий гороха афганского происхождения и обнаружен маркер, характерный для гороха афганского, но не европейского происхоадения.
Применен метод, позволяющий анализировать наследование генов нодулинов совместно с sym-иутациями.
Определено сцепление генов EN0D12A и EN0D12B с маркером b третьей группы сцепления гороха.
0Е53к3_зи22У29.!Еь. Обнаруженный полиморфизм гена EN0D12 позволяет предполагать функциональную связь между этиы геном и теми мутациями, наличие которых определяет -высокую специфичность генотипа растения-хозяина по отношению к генотипу микросимбионта. Такие модели, обладающие контрастными сиыбио-тическими свойствами, имеют большое практическое значение, поскольку позволяют создавать пары макро-микросимбионт, в которых генетические факторы растения контролируют -избирательность - инокуляции только отобранными штаммами,, независимо от
конкуренции со стороны спонтанной микрофлоры.
Апробация_работы. Результаты работы докладывались на 9-ом Международном Конгрессе по азотфиксации (Канкун, Мексика, 1993), II Российском симпозиума "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, Россия, 1993), I Европейской конференции по азотфиксации (Сегед, Венгрия, 1994), I съезде ВОГИС (Саратов, Россия, 1994).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.
Стр5гкт2рз_и_объеу_работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов и обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, 20 рисунков. Список литературы включает 271 наименование.