Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Детерминанты вирулентности бактерий рода Bordetella
1.1.1. Регуляция вирулентности бактерий рода Bordetella
1.1.2. Факторы вирулентности бактерий рода Bordetella
1.2. Вакцинопрофилактика коклюша и распространенность бактерий Bordetella pertussis с мутациями в генах основных факторов вирулентности
1.3. Иммунитет к бактериям Bordetella pertussis при заболевании и вакцинации
1.3.1. Гуморальный иммунный ответ к бактериям Bordetella pertussis
1.3.2. Клеточно-опосредованный иммунный ответ к бактериям Bordetella pertussis
1.4. Молекулярно-генетические подходы к созданию новых препаратов для профилактики коклюша
ГЛАВА 2. Собственные исследования
2.1. Материалы и методы
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Разработка методической базы для молекулярно-генетической модификации бактерий рода Bordetella
2.2.1.1. Отбор реципиентных бактерий рода Bordetella для конструирования рекомбинантных бактерий B.pertussis. Отработка условий конъюгации для передачи рекомбинантных плазмид в клетки бактерий рода Bordetella
2.2.1.2. Конструирование плазмид широкого круга хозяев, содержащих природный и мутантный оперон ptx
2.2.1.3. Конструирование рекомбинантных бактерий B.bronchiseptica и B.pertussis, содержащих нативный и мутантный оперон ptx в составе плазмид
2.2.1.4. Конструирование плазмид не способных реплицироваться в бактериях рода Bordetella и содержащих мутантный оперон ptx
2.2.1.5. Конструирование плазмид не способных реплицироваться в бактериях рода Bordetella и содержащих мутантный фрагмент гена dnt
2.2.2. Конструирование рекомбинантных аттенуированных бактерий B.pertussis, содержащих мутантную форму оперона ptx и нокаутнуюмутацию в гене dnt генома B.pertussis
2.2.2.1. Конструирование рекомбинантных аттенуированных бактерий B.pertussis, содержащих мутантную форму оперона ptx в геноме B.pertussis
2.2.2.2. Конструирование рекомбинантных аттенуированных бактерий B.pertussis, содержащих мутантную форму оперона ptxP1 и нокаутную мутацию в гене dnt бактерий B.pertussis 4М
2.2.2.3. Конструирование рекомбинантных аттенуированных бактерий B.pertussis, содержащих нокаутную мутацию в гене dnt и ptxP3 мутантного оперона ptx
2.2.3. Иммунобиологическая характеристика сконструированных бактерий B.pertussis
2.2.3.1. Изучение стабильности молекулярной структуры и характеристик рекомбинантных аттенуированных бактерий B.pertussis 4М и B.pertussis 4МKS после 15 пересевов на искусственной питательной среде и пяти пассажей в легких мышей
2.2.3.2. Защитные свойства рекомбинантных аттенуированных бактерий B.pertussis
2.2.3.3. Характеристика токсичности и безопасности кандидатной рекомбинантной живой коклюшной вакцины интраназального применения в экспериментах с лабораторными животными
2.2.4. Разработка нового теста определения защитной активности коклюшных вакцин
2.2.5. Разработка препарата кандидатной рекомбинантной цельноклеточной коклюшной вакцины на основе инактивированных аттенуированных бактерий B.pertussis 4М генотипа ptxP1
2.2.6. Возможности применения сконструированных рекомбинантных бактерий B.pertussis
Заключение
Выводы
Список литературы
- Вакцинопрофилактика коклюша и распространенность бактерий Bordetella pertussis с мутациями в генах основных факторов вирулентности
- Молекулярно-генетические подходы к созданию новых препаратов для профилактики коклюша
- Конструирование плазмид широкого круга хозяев, содержащих природный и мутантный оперон ptx
- Изучение стабильности молекулярной структуры и характеристик рекомбинантных аттенуированных бактерий B.pertussis 4М и B.pertussis 4МKS после 15 пересевов на искусственной питательной среде и пяти пассажей в легких мышей
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Коклюш, несмотря на успехи вакцинопрофилактики, продолжает оставаться серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Это высококонтагиозное инфекционное заболевание, вызываемое бактериями Bordetella pertussis, передается воздушно-капельным путем. Разработка и внедрение в практику здравоохранения во второй половине двадцатого века цельноклеточных коклюшных вакцин (ЦКВ) снизили заболеваемость до единичных случаев на 100 тысяч населения. Эффективность профилактики коклюша в рамках Расширенной Программы Иммунизации (РПИ) была убедительно подтверждена во многих странах, в том числе в СССР (М.С. Захарова, 1985). Выраженная социально-экономическая значимость профилактики коклюша не вызывает сомнений (Г.Г. Онищенко, 2013). Эпидемиологический эффект позволил отнести коклюш к категории управляемых инфекций и сформировать общепринятое мнение, что это заболевание находится под сдерживающим контролем прививок. В тоже время, наряду с положительным эффектом, массовая иммунизация ЦКВ выявила нежелательные побочные реакции и поствакцинальные осложнения, которые инициировали отмену вакцинации против коклюша и, как следствие, резкое увеличение тяжелых форм заболевания и смертности детей (WHO, 2009; Р.П. Чупринина, с соавт., 2006). Это послужило основанием для разработки бесклеточных коклюшных вакцин (БКВ), которые ВОЗ признала более безопасными (H. Sato, et al., 1984; W.C. Blackwelder, 1990; WHO, 1992). В большинстве экономически развитых стран ЦКВ заменили на БКВ (Y. Sato, et al., 1999; D.M. Skrowronski, et al., 2002; F.R. Mooi, et al., 1998; WHO, 2009; Р.П. Чупринина, 2009). Тем не менее, во всем мире частота заболеваемости коклюшем неуклонно растет и за 20 лет увеличилась почти в 10 раз (И.А. Алексеева, 2015). Ежегодно регистрируется около 1 млн. смертельных случаев, связанных с коклюшем - шестой инфекцией по частоте детской смертности (WHO, 2014; 2016). Наблюдается подъем заболеваемости коклюшем даже в странах с высоким уровнем охвата прививками декретированного населения (Т.С. Cелезнева, с со-авт., 2002; U. Heininger, et al., 2004; С.М. Харит, с соавт., 2009; О.В. Перелыгина, с со-авт., 2016). В Российской Федерации также отмечен рост заболеваемости коклюшем с локальными вспышками и формированием очагов разной интенсивности в школьных коллективах (А.С. Пименова, с соавт., 2017). Поствакцинальный иммунитет индуцированный современными ЦКВ и БКВ довольно быстро угасает, что и приводит к увеличению восприимчивых к возбудителю коклюша подростков и взрослых (И.В. Бабаченко, 2014; J.M. Warfel, et al., 2013). Атипичное течение коклюша затрудняет диагностику (Ю.В. Лобзин, 2011). Взрослые являются резервуаром бактерий B. pertussis для младенцев, а дети – для взрослых (F.R. Mooi, 2009). Наличие неконтролируемого источника коклюшной инфекции, особенно в семьях с новорожднными и в детских организованных коллективах, обосновывает необходимость введения максимально ранней иммунизации против коклюша (Т.С. Селезнева, с соавт., 2002; С.М. Харит, с соавт., 2009.; И.А. Алексеева, с соавт.,2012; И.В. Бабаченко, 2014). Однако в настоящее время вакцинацию против коклюша начинают не ранее 2-3-х месячного возраста. Иммунизация включает три внутримышечные инъекции с интервалом в 1,5 месяца и ревакцинацию в 18 месяцев.
Среди специалистов обсуждается вопрос о введении дополнительной ревакцинации детей 6-7-летнего возраста. Вместе с тем, остается открытым вопрос о профилактическом препарате.
При использовании для первичной иммунизации вакцин только с бесклеточным коклюшным компонентом выявлен рост заболеваемости коклюшем (WHO, 2014; Р.П. Чупринина, с соавт., 2014). Увеличивается доля циркулирующих бактерий B. pertussis с мутациями в генах ответственных за синтез протективных антигенов, кодирующих белки, входящие в состав БКВ (F.R. Mooi, 2009; О.Ю. Борисова, с соавт., 2016; S. Matto, 2005). Изменение иммунобиологических свойств возбудителя коклюша отражается и на эффективности ЦКВ (О.В. Перелыгина, с соавт., 2016). Исключительная вариабельность бактерий B. pertussis на фоне снижения коллективного иммунитета подтверждает актуальность создания новых препаратов для профилактики коклюша.
На протяжении последних 20-30 лет проводятся молекулярно-генетические исследования структурной организации генов вирулентности бактерий B. pertussis, их роли в патогенезе коклюша и регуляции экспрессии (A. Bork, et al., 2001; C.A. Cummings, et al., 2006; J. Konig, et al., 2002). Опубликованы полные последовательности геномов бактерий B. pertussis, B. parapertussis и B. bronchiseptica (J. Parkhill, et al., 2003).
Наиболее важными для начала настоящей работы явились результаты по изучению токсической активности коклюшного токсина (КТ) и картирование участков гена ptxS1, ответственных за проявление его ферментативной активности. Установлены мутации в опероне ptx, обеспечивающие подавление ферментативной активности КТ и сохранение исходной конформации его протективных эпитопов. Проведен рентгенострук-турный анализ КТ (P.E. et al., 1994). В конце 90-х годов показана возможность генетического обмена между бактериями B. pertussis и E. coli. Начаты исследования по конструированию гетерологичных продуцентов протективных антигенов B. pertussis. Показана возможность использования бактерий B. pertussis в качестве вектора для конструирования поливалентных живых вакцин (N. Mielcarek, et al., 1998).
Практическое использование БКВ позволило уточнить роль отдельных факторов вирулентности бактерий B. pertussis в формировании иммунной защиты и ведущую роль КТ (J. Brummelman, et al., 2015). Установлено, что для эрадикации возбудителя коклюша необходим не только гуморальный иммунный ответ, но и клеточный, опосредованный Т-хелперами Th1 и Th17 (S. Mattoo, et al., 2001; 2005). В прямых экспериментах на приматах подтвердили, что защита от вирулентных бактерий B. pertussis формируется после перенеснной коклюшной инфекции, а также, хотя, и в меньшей степени, от иммунизации ЦКВ, но не БКВ (J.M. Warfel, et al., 2013). Имеющиеся литературные данные и результаты собственных исследований позволили нам сформулировать цели и задачи настоящей работы.
С нашей точки зрения, перспективным представляется создание препарата на основе живых рекомбинантных аттенуированных бактерий B. pertussis для интраназально-го введения, имитирующего естественный путь проникновения возбудителя коклюша в организм человека. Снижение или полное устранение вирулентности (аттенуацию) бактерий B. pertussis с сохранением способности колонизировать респираторный тракт и индуцировать защитный иммунный ответ возможно осуществить посредством строго
детерминированных молекулярно-генетических манипуляций. На основе живых аттену-ированных бактерий B. pertussis предполагается разработать монопрепарат для профилактики коклюша у разных возрастных групп населения. Использование аттенуирован-ных бактерий B. pertussis возможно и в качестве основы для конструирования поливалентных вакцин, вводимых интраназальным путем. На основе рекомбинантных аттенуи-рованных бактерий B. pertussis предполагается конструировать безопасные штаммы-продуценты протективных антигенов – компонентов для БКВ, а также совершенствовать «вакцинные» штаммы для производства инактивированных ЦКВ.
В представленной работе проведены исследования по разработке методической базы для молекулярно-генетической модификации бактерий рода Bordetella и конструированию аттенуированных бактерий B. pertussis обладающих заданными иммунобиологическими характеристиками.
Цель исследования: конструирование и иммунобиологическая характеристика аттенуированных бактерий B. pertussis для создания рекомбинантных препаратов для профилактики коклюша.
Задачи исследования:
-
Разработать методическую базу молекулярно-генетической модификации бактерий рода Bordetella.
-
Сконструировать аттенуированные бактерии B. pertussis, продуцирующие им-муногенную нетоксичную форму коклюшного токсина и не синтезирующие дермо-некротический токсин.
3. Изучить иммунобиологические характеристики, стабильность генетической
структуры, защитные свойства и безопасность аттенуированных бактерий B. pertussis в
экспериментах на лабораторных животных.
-
Разработать новый метод для оценки защитных свойств живых аттенуирован-ных бактерий B. pertussis по выживаемости мышей при интраназальном заражении.
-
Провести доклинические исследования кандидатного профилактического препарата на основе живых аттенуированных бактерий B. pertussis для интраназального применения.
-
Создать штаммы-продуценты коклюшного токсина и его токсоида на основе ре-комбинантных бактерий рода Bordetella.
Научная новизна работы
В России исследований по молекулярно-генетической модификации вирулентных бактерий рода Bordetella до настоящего времени не проводилось. Нами впервые сформулирована задача конструирования аттенуированных бактерий B. pertussis и создания препарата для интраназальной иммунизации против коклюша на основе живых микробных клеток с возможностью их модификации по мере накопления циркулирующих
штаммов с мутациями в генах протективных антигенов, позволяющих возбудителю «ускользать» от поствакцинального иммунитета.
Разработана методическая база молекулярно-генетической модификации бактерий рода Bordetella: впервые в России отработаны методы скрещивания и передачи генетической информации от бактерий E. coli в бактерии рода Bordetella. На основе различных векторов сконструированы плазмиды, содержащие нокаутную мутацию в гене дермо-некротического токсина (dnt) и двойную мутацию в опероне ptx, инактивирующую ферментативную активность КТ. Один вариант плазмид, не способных реплицироваться в бактериях рода Bordetella, предназначен для аллельного обмена и внесения соответствующих мутаций в хромосому вирулентных бактерий рода Bordetella. Второй, сконструированный на базе плазмид широкого круга хозяев, содержащий мутантный вариант оперона ptx, - для конструирования штаммов-суперпродуцентов токсоида КТ.
Впервые на основе «вакцинных» штаммов, применяемых в Россиии для производства ЦКВ, сконструированы аттенуированные бактерии B. pertussis «довакцинного» генотипа ptxР1 оперона ptx: изогенные - B. pertussis 4М (реципиент B. pertussis 475 серо-вара 1.2.3) и неизогенные - B. pertussis 232 (реципиент 231 серовара 1.0.3), B. pertussis 135 (реципиент B. pertussis 134 серовара 1.2.0). Аттенуированные бактерии B. pertussis содержат нокаутную мутацию в гене дермонекротического токсина (dnt) и две точечные мутации в опероне ptx. Рекомбинантные бактерии B. pertussis продуцируют иммуноген-ную нетоксичную форму коклюшного токсина и не синтезируют дермонекротический токсин.
Впервые на основе аттенуированных бактерий B. pertussis 4М генотипа ptxР1 сконструированы изогенные бактерии B. pertussis 4МKS, содержащие «поствакцинный» генотип ptxР3 оперона ptx с повышенной продукцией токсоида коклюшного токсина.
Впервые на основе живых аттенуированных бактерий B. pertussis 4МKS генотипа ptxР3 разработан монопрепарат кандидатной рекомбинантной живой коклюшной вакцины для интраназального применения с целью профилактики коклюша у разных возрастных групп населения.
Впервые разработан метод оценки защитной активности живых аттенуированных бактерий B. pertussis по выживаемости мышей при интраназальном заражении рекомби-нантными бактериями Рtx+ B. bronchiseptica 8220-17, продуцирующими нативный коклюшный токсин.
Сконструированы продуценты КТ и его токсоида: аттенуированные бактерии B. pertussis и гетерологичные B. bronchiseptica для производства диагностических тест-систем и специфических иммуноглобулинов для лечения тяжлых форм коклюша.
Теоретическая и практическая значимость работы
Сформулирована задача конструирования аттенуированных бактерий B. pertussis для создания монопрепарата для интраназальной иммунизации на основе живых микробных клеток возбудителя коклюша с возможностью их модификации по мере накопления циркулирующих штаммов с мутациями в генах, кодирующих протективные антигены, позволяющими возбудителю «ускользать» от поствакцинального иммунитета.
Впервые показана способность генетически модифицированных аттенуированных бактерий B. pertussis колонизировать дыхательные пути низших обезьян Старого света, не вызывая развития патологического процесса, и формировать защитный иммунитет, способствующий эрадикации возбудителя коклюша.
Разработана методическая база молекулярно-генетической модификации бактерий рода Bordetella.
Отработаны методы скрещивания и передачи генетической информации от бактерий E. coli в бактерии рода Bordetella. На основе различных векторов сконструированы плазмиды, содержащие нокаутную мутацию в гене дермонекротического токсина (dnt) и двойную мутацию в опероне ptx, инактивирующую ферментативную активность КТ.
Показана возможность генетической модификации «вакцинных» штаммов B. pertussis, применяемых в России для производства ЦКВ.
Впервые сконструированы аттенуированные бактерии B. pertussis, содержащие нокаутную мутацию в гене дермонекротического токсина (dnt) и две точечные мутации в опероне ptx, продуцирующие иммуногенную нетоксичную форму коклюшного токсина и не синтезирующие дермонекротический токсин. Изогенные мутанты «довакцинного» генотипа ptxР1 оперона ptx - B. pertussis 4М (реципиент B. pertussis 475 серовара 1.2.3) и неизогенные - B. pertussis 232 (реципиент 231 серовар 1.0.3), B. pertussis 134 (реципиент серовар 1.2.0).
Впервые на основе бактерий B. pertussis «довакцинного» генотипа ptxР1 сконструированы изогенные аттенуированные бактерии B. pertussis, содержащие «поствакцинный» генотип ptxР3, соответствующий генотипу бактерий, циркулирующих в настоящее время в популяции населения.
Впервые на основе живых аттенуированных бактерий B. pertussis 4МKS генотипа ptxР3 разработан препарат кандидатной рекомбинантной живой коклюшной вакцины интраназального применения для профилактики коклюша разных возрастных групп населения, что отвечает задачам здравоохранения РФ для управляемых инфекций.
Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, вошли в патенты Российской Федерации, что подтверждает практическую значимость проведенного исследования.
Доклинические исследования профилактического препарата кандидатной живой коклюшной вакцины интраназального применения на основе аттенуированных бактерий B. pertussis продемонстрировали его высокую эффективность и безопасность на лабораторных животных, в том числе и на приматах. Получено разрешение Минздрава Российской Федерации на проведение первого этапа клинических исследований.
Методология и методы исследования
Методология исследования была спланирована в соответствии с современными принципами научного анализа молекулярной биологии бактерий рода Bordetella и поставленной целью. Планирование и проведение исследований для реализации сформулированных задач осуществляли с помощью современных молекулярно-генетических, микробиологических, биологических, серологических, статистических методов с учетом
рекомендаций и требований ВОЗ по вопросам поиска способов повышения эффективности и безопасности препаратов для профилактики коклюша. Основой исследования стал современный подход к модификации возбудителя коклюша: конструирование аттенуи-рованных бактерий возбудителя коклюша и разработка рекомбинантных профилактических препаратов. При выполнении работы использовали отечественные и международные научные базы данных, материалы российских и зарубежных научных журналов и конференций. Использованные методы исследования и статистическая обработка полученных в экспериментах данных позволили достоверно и объективно оценить полученные результаты.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработанная нами универсальная методическая база для молекулярно-
генетической модификации бактерий рода Bordetella позволила создать кандидатный
профилактический препарат на основе сконструированных аттенуированных бактерий B.
pertussis с нокаутной мутацией в гене дермонекротического токсина (dnt) и точечными
мутациями в опероне ptx.
-
Рекомбинантные аттенуированные бактерии B. pertussis стабильно сохраняют генетическую структуру модифицированных участков и иммунобиологические характеристики при пассажах на питательных средах и в организме лабораторных животных.
-
Интраназальное введение живых аттенуированных бактерий B. pertussis безопасно для лабораторных животных и защищает мышей от внутримозгового заражения вирулентными бактериями B. pertussis.
-
Интраназальное введение живых аттенуированных бактерий B. pertussis безопасно для обезьян вида макака резус, способствует выработке специфических противо-колюшных антител и защищает от интраназального заражения вирулентными бактериями B. pertussis.
-
Разработан способ оценки защитной активности живых аттенуированных бактерий B. pertussis по выживаемости мышей при интраназальном заражении сконструированными рекомбинантными бактериями Рtx+ B. bronchiseptica 8220-17, продуцирующими нативный коклюшный токсин.
6. Доклинические исследования показали, что препарат кандидатной рекомби-
нантной живой коклюшной вакцины защищает мышей от гибели при заражении виру
лентными бактериями рода Bordetella и безопасен для новорожденных животных.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации и результаты проведенного исследования соответствуют паспорту научной специальности 03.02.03 – микробиология.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на:
Ежегодной конференции «Генная и клеточная инженерия» Государственной научно-технической программы России «Новейшие методы биоинженерии», Пущино, 1994;
XIV Всероссийском научном Форуме c международным участием им. Академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, 2010;
XV Всероссийском научном Форуме c международным участием им. Академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, 2015;
XVI Всероссийском научном Форуме c международным участием им. Академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт- Петербург, 2017.
VII Всероссийской с международным участием школе-конференции по клинической иммунологии «Иммунология для врачей», Пушкинские Горы, 2016;
Всероссийском ежегодном конгрессе «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика», Санкт-Петербург, 2015;
IX съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Сочи-Дагомыс, 2014;
Второй международной научной конференции «Фундаментальные и
прикладные аспекты медицинской приматологии», Сочи-Адлер, 2010;
Третьей международной научной конференции «Фундаментальные и
прикладные аспекты медицинской приматологии», Сочи-Адлер, 2016.
Апробация диссертационной работы состоялась 30 мая 2017 на научной конфе
ренции отдела медицинской микробиологии и отдела генетики и молекулярной биоло
гии бактерий ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравa России (Протокол № 7).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 38 научных работ, в том числе 20 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получены 3 патента РФ и 2 авторских свидетельства.
Структура и объем диссертации
Вакцинопрофилактика коклюша и распространенность бактерий Bordetella pertussis с мутациями в генах основных факторов вирулентности
В клетках микроорганизмов рода Bordetella синтез всех главных факторов вирулентности регулируется единственным генетическим локусом, обнаруженным 1983 (39а) и известным сейчас под названием bvg (bordetella virulence gene). Локус bvg Bordetella содержит два гена, bvgA и bvgS, которые кодируют протеины, принадлежащие к классу белков-приемников, регулирующих ответы на сигнал внешней среды (BvgA) и к классу белков-проводников, или сенсоров, передающих сигнал из внешней среды внутрь клетки (BvgS). Трансмембранный сенсорный белок гистидинкиназа (BvgS) под воздействием внешнего сигнала автофосфорилируется и передает фосфат на гистидин белка BvgA (39а). Фосфорилированный белок А активирует (или репрессирует) транскрипцию генов bvg и других bvg-активируемых (или репрессируемых) генов (vag и vrg), связываясь со специфическими участками их промоторов. Один из vrg (virulence repressed genes) генов кодирует репрессор транскрипции BvgR.
Большинство генов бордетелл, связанных с патогенезом, являются позитивно регулируемыми (vag) и их экспрессия определяет вирулентное (Bvg+ , I фаза) состояние бактерий, характерное для развития инфекции. Ряд экспериментов с различными мутантами продемонстрировали, что Bvg+ фаза необходима и достаточна для колонизации респираторного тракта бактериями B.pertussis и B.bronchiseptica. Авирулентная фаза (Bvg- , IV фаза) B.bronchiseptica возможно реализуется при выживании бактерий в условиях дефицита источников питания, например, при нахождении бактерий во внешней среде. Она может играть важную роль в аэрозольном переносе бактерий и персистенции в клетках хозяина. Выделяют также промежуточные фазы Bvgi. Клетки Bvgi экспрессируют только некоторые vag- гены, характерные для этого состояния бактерий. В промежуточной фазе находятся бактерии, содержащие мутацию в гене bvgS, или бактерии, культивируемые в присутствии промежуточных концентраций модулирующих факторов. Эти факторы, на которые бактерии рода Bordetella отвечают изменением фазового состояния in vivo, до сих пор не выяснены. Известно, напрммер, что BvgAS система инактивируется in vitro снижением температуры культивирования до 25С0, при добавлении в среду культивирования милимолярных количеств MgSO4 или никотиновой кислоты. Недавними исследованиями изучено участие промежуточной фазы в формировании биопленок B.bronchiseptica (39б, 39в) и распространения бактерий в процессе инфицирования респираторного тракта.
Локус bvg состоит из трех генов – bvgA, bvgS и bvgR. Гены bvgA, bvgS и bvgR представлены во всех трех секвенированных геномах микроорганизмов рода Bordetella. Аминокислотные последовательности bvgA белков B.pertussis, B.parapertussis и B.bronchiseptica идентичны. Аминокислотные последовательности BvgR белков B.pertussis и B. parapertussis отличаются заменой T244A, а B.pertussis и B.bronchiseptica заменой V223A. Наименьшая степень идентичности аминокислотных последовательностей обнаружена у сенсорных белков bvgS. Больше всего отличий между белками bvgS зафиксировано у возбудителей коклюша и бронхосептикоза (65 из 1238 а/к или 5%). Наименьшие отличия обнаружены в паре B.parapertussis и B.bronchiseptica (7 из 1238 а/к или 0,4%). Выявленные отличия не затрагивают аминокислот (H729-D1023-H1172), участвующих в передаче фосфата на bvgA (39а).
Помимо BvgАS «классические» Bordetella содержат внутриклеточную регуляторную Ris–систему. Cистема управляется локусом risAS, кодирующим регулятор RisА и киназу RisS (39г). Функционирование системы RisАS и е взаимодействие с системой BvgАS описаны недостаточно, однако есть основания полагать, что она принимает участие в зо обеспечении внутриклеточного выживания бактерий рода Bordetella в эукариотических клетках (39а). 1.1.2. Факторы вирулентности бактерий рода Bordetella Коклюшный токсин (КТ) - сложный пятикомпонентный токсин, состоит из А-протомера, обладающего АДФ-рибозилирующей активностью и В-олигомера, который связывается с рецепторами эукариотической клетки и способствует прохождению А-субъединицы в цитозоль. Cубъединицы S2 (21,920 кДа), S3 21,860 кДа), S4 (12,000 кДа) и S5 (11,770 кДа) в молярном соотношении 1:1:2:1 формируют В-олигомер и вместе с А-протомером (S1 субъединица - 26,220 кДа) образуют молекулу нативного КТ . Установлено, что S3 субъединица необходима для высвобождения молекул КТ из периплазмы B.pertussis (40).
Гены, кодирующие КТ, присутствуют в геномах практически всех микроорганизмов рода Bordetella, но КТ синтезируется только в клетках B.pertussis. Исключение составляют некоторые природные штаммы утратившие гены КТ, так называемого комплекса IV B.bronchiseptica, выделенные от людей (32). Коклюшный токсин, который иногда называют пертусиногеном или лимфоцитозстимулирующим фактором, считается основным фактором вирулентности возбудителя коклюша, ответственным за проявление лейкоцитоза, спленомегалии, чувствительности к гистамину, гипогликемии (40,41). КТ, обладает адъювантной активностью, стимулирующей реакции Т-лимфоцитов на гомологичный и гетерологичный антигены (40а, 40б).
Молекулярно-генетические подходы к созданию новых препаратов для профилактики коклюша
Ещ одним важным современным направлением создания новых вакцинных препаратов является разработка ДНК-вакцин. Первой работой, положившей начало развитию генетической вакцинации, была публикация Wolff и с соавт.(179), в которой сообщалось об эффективной экспрессии генетического материала в клетках in vivo после внутримышечной инъекции плазмидной ДНК (180, 54). Все известные ДНК – вакцины против возбудителя коклюша используют последовательность мутантного гена ptxS1 или его фрагменты. Например, в работе Kamachi K, Arakawa Y. (181). Для вакцинации мышей использовали плазмиды, несущие фрамент гена ptxS1, кодирующий полипептид размером 189 а.к., содержащий описанные ранее мутации C180-R9K,C180-R9K/E129G. Определение цитотоксического эффекта от gene gun введения вакцин и ингибирования ЛСА КТ позволило авторам сделать заключение о перспективности использования этих плазмид для конструирования ДНК-вакцины (182). Chen A.Y., с соавт. (183) изучали иммуногенность аналогичной ДНК-вакцины при внутримышечной и интраназальной иммунизации. Внутримышечная иммунизация приводила в формированию высокого уровня ИФН и интерлейкина IL-2 в отсутствии IgG. Иммуногенность ДНК-вакцины при интраназальном заражении определяли в сравнении с коммерческой БКВ. Авторы пришли к заключению, что аэрозольная вакцинация мышей БКВ более эффективна, чем вакцинация ДНК-вакциной (182).
Суммирую представленные в обзоре результаты можно сказать что, история создания коклюшных вакцин включает в себя все известные направления современной вакцинологии. Первые вакцины, состоящие из ослабленных живых бактерий, не получили широкого применения из-за высокой вирулентности. Вторым, наиболее успешным и длительным этапом применения коклюшных вакцин, было применение цельноклеточных вакцин (ЦКВ), состоящих из инактивированных клеток B.pertussis, вводимых подкожно. Массовое использование ЦКВ способствовало значительному снижению заболеваемости и смертности от коклюша во всм мире, но выявило наличие побочных эффектов. В качестве безопасной альтернативы ЦКВ были разработаны и выпущены в производство бесклеточные коклюшные вакцины, состоящие из очищенных антигенов возбудителя коклюша. На протяжении последних 10-20 лет такие вакцины широко использовались в ряде экономически развитых стран и имеют меньшую, чем ЦКВ реактогенность. Однако последние исследования показали отсутствие клеточного иммунитета после вакцинации БКВ в отличие от иммунизации ЦКВ и постинфекционного иммунитета, что может способствовать увеличению персистенции и количества стртых форм заболевания. Попытки создания субъединичных, в том числе и содержащих гибридные антигены, синтетических и ДНК вакцин не вышли за пределы лабораторных исследований. Исследования по разработке живых вакцин для профилактики коклюша успешно развиваются в нашей стране и в Европе. Рекомбинантная ЖКВ прошла стадию доклинических исследований в России и планируется первая стадия клинических испытаний. Первый этап клинических испытаний ЖКВ проходит во Франции. Основой успехов и перспективы создания ЖКВ являются результаты, достигнутые в понимании механизмов вирулентности и патогенности бактерий рода Bordetella, механизмов формирования иммунного ответа при коклюше и разработки методов генетического анализа и модификации бактерий рода Bordetella. Представленные результаты позволяют сформулировать основные направления создания инновационных коклюшных вакцин. С нашей точки зрения, главным направлением следует считать разработку рекомбинантных живых вакцин для интраназального применения на основе сконструированных аттенированных бактерий B.pertussis, а также сконструированных на той же платформе поливалентных живых вакцин, продуцирующих гетерологичные антигены - дифтерийный и столбнячный анатоксины или их фрагменты. В качестве промежуточного или самостоятельного варианта можно рассматривать разработку новых рекомбинантных ЦКВ, содержащих целые клетки аттенуированных бактерий B.pertussis. Кроме того, отсутствие ДНТ и токсической активности КТ у аттенуированных бактерий B.pertussis приведт к уменьшению концентрации и времени инкубации суспензии бактерий с формальдегидом или другим химическим агентом, необходимых для инактивации этих токсинов в процессе производства коклюшного компонента АКДС вакцины из вирулентных бактерий B.pertussis, или совсем исключит использование формальдегида. Перечисленные факторы снижают уровень биологической опасности и повышают рентабельность вакцинного производства, снижают риск реверсии специфической токсичности вакцины и делают препарат менее реактогенным и более безопасным.
Результаты анализа литературы, представленные в обзоре, позволили нам сделать заключение, что для достижения необходимого уровня аттенуации бактерий B.pertussis следует провести направленный мутагенез последовательности гена ptxS1, ответственную за ферментативную активность КТ, и получить нокаутную мутацию гена dnt. Учитывая возможное участие ТЦТ в формировании врожднного противобактерийного иммунитета и отсутствие экспериментальных доказательств роли ТЦТ в патогенезе коклюша, мы посчитали дополнительную модификацию аттенуированных бактерий B.pertussis нецелесообразной. Наиболее перспективными для модификации КТ представляются точечные мутации в гене ptx S1, обеспечивающие замену аминокислот Arg9 (CGC) на Lys9 (AAG) и Glu129(GAA) на Gly129 (GGA).
Для инактивации ДНТ могут быть использованы любые нокаутные мутации, однако, учитывая возможное его участие в колонизации коклюшного микроба, целесообразно сохранить экспрессию N-концевой рецептор-связывающей последовательности гена dnt, а нокаутную мутацию ввести в С-концевую последовательность, ответственную за синтез ферментативной области белка.
Конструирование плазмид широкого круга хозяев, содержащих природный и мутантный оперон ptx
Для планируемых генетических экспериментов, предусматривающих расчистку и отбор отдельных колоний, выбраны концентрации антибиотиков равные: для канамицина 50 мкг/мл, для хларамфеникола 75 мкг/мл, для гентамицина 20 мкг/мл, для налидиксовой кислоты 100 мкг/мл, для стрептомицина 300 мкг/мл и для рифампицина 100 мкг/мл. Ампициллин и тетрациклин не могут быть использованы в генетических экспериментах на среде КУА.
Скрещивание бактерий E.coliS17/pRK404K и B.pertussis 476 проводили на тврдой питательной среде КУА по модифицированной нами методике. Суточную культуру бактерий реципиентов B.pertussis наносили плотным штрихом на чашки КУА с добавлением MgS04 (0,1ммл) и перпендикулярно к штриху двумя-тремя штрихами культуру донора E.coli в минимальном количестве (из одной – двух колоний). Скрещивание проводили при температуре 35С0 в течение 5-7 часов. Бактерии с чашки после скрещивания смывали 0,85% раствором хлорида натрия pH 7,0 – 7,2 и высевали в двух десятикратных разведениях на чашки с селективной средой КУА Km + Nal. Посевы инкубировали в течение 5-7 суток при температуре 35С0. Выросшие колонии трхкратно расчищали на селективной среде КУА c Km и Nal использовали для дальнейшего анализа. Использованная методика позволила получить от нескольких десятков до нескольких сотен трансконъюгантов.
В настоящее время ЦКВ в России состоят из инактивированных вирулентных бактерий B.pertussis нескольких «вакцинных» штаммов различных сероваров, которые должны обеспечивать требуемый уровень защитной активности препаратов ЦКВ. Таким требованиям удовлетворяют, например, «вакцинные» штаммы B.pertussis134, B.pertussis 231, B.pertussis 475, используемые в настоящее время для производства ЦКВ в России. Эти штаммы были выделены на территории СССР от больных людей в разные годы (с 1942 по 1968 г.г.), главным образом в довакцинный период. Действующие в Российской Федерации МУК 4.2.2317-08 по «Отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий» определяют только некоторые фенотипические характеристики и не содержат требований к генотипу бактерий B.pertussis, претерпевающих заметные изменения на фоне массовой вакцинации. На базе хорошо изученных «вакцинных» штаммов возможно конструирование аттенуированных бактерий B.pertussis для создания рекомбинантных препаратов. Характеристика спонтанных мутантов бактерий B.pertussis134, B.pertussis 231, B.pertussis 475 использованных для конструирования аттенуированных бактерий приведена в таблице 2.1.1 (Материалы и методы).
При формулировании стратегии создания рекомбинантных коклюшных вакцин необходимо учитывать накопившуюся за последние годы информацию об изменчивости циркулирующих бактерий возбудителя коклюша, скорее всего, в результате длительного применения вакцин, приготовленных из ранее циркулирующих бактерий. В настоящее время мы не имеем общепризнанных результатов исследований доказывающих необходимость приготовления вакцин из бактерий новых «поствакцинных» генотипов, но такие сведения накапливаются и со временем такие рекомендации могут быть приняты. Разработанная нами технология предполагает возможность быстрого изменения генотипа аттенуированных бактерий в соответствии с доминирующим генотипом циркулирующих в популяции бактерий.
Конструирование плазмид, содержащих природный оперон ptx имело две цели. Первая состояла в проверке адекватности экспрессии клонированного оперон ptx в составе рекомбинантной плазмиды путем изучения свойств КТ, продуцируемого клетками, и возможности использования клонированного ptx для конструирования аттенуированных бактерий B.pertussis. Вторая – создание рекомбинантных бактерий рода Bordetella, продуцирующих нативный КТ, и изучение возможности их использования в качестве продуцентов КТ или его мутантной формы. Таким продуцентом, прежде всего, могут быть быстрорастущие рекомбинантные бактерии B.bronchiceptica. Параллельно изучена зависимость уровня продукции КТ от «силы» промотора и копийности оперона. Плазмиды, содержащие природный оперон ptx
Для решения первой задачи нами использованы векторные плазмиды RSK , PECT4, и pRK 404, имеющие репликоны плазмид RSF1010 и RP4, способные реплицироваться в бактериях рода Bordetella (табл. 2. 1.1). Число копий плазмиды RSF1010 в клетках E.coli, как правило значительно выше, чем плазмиды RP4. Можно было ожидать, что такое соотношение сохраниться в бактериях B.bronchiseptica. Для изучения зависимости уровня продукции КТ от «силы» используемого промотора и числа копий оперона сконструированы плазмиды, представленные в таблицах 2.1.1 и 2.2.2.
Источником оперона (EcoRI фрагмента) под контролем собственного и lac – промоторов служили плазмиды pRH119 и pRH 121, cooтветственно. Переклонирование фрагментов EcoRI в EcoRI сайт векторных плазмид осуществляли по стандартной схеме.
Изучение стабильности молекулярной структуры и характеристик рекомбинантных аттенуированных бактерий B.pertussis 4М и B.pertussis 4МKS после 15 пересевов на искусственной питательной среде и пяти пассажей в легких мышей
Для конструирования аттенуированных бактерий В.pertussis содержащих мутантный ген ptxS1 и нокаутную мутацию в гене dnt был использован метод аллельного обмена между природной копией гена в составе хромосомы B.pertussis реципиента и мутантной копией в составе плазмиды.
Процедуру мутагенеза проводили последовательно. Вначале получали мутанты по перону ptx, а затем по dnt. B.pertussis, содержащих мутантную форму оперона ptx в геноме B.pertussis На первом этапе исследования в качестве реципиента выбраны бактерии RifR B.pertussis 135 и 232. Для их конструирования использована плазмида pKS1. Рекомбинантная плазмида, сконструированная на основе суицидного вектора pKnock, передана в бактерии B.pertussis 135 и 232 с помощью скрещивания с бактериями E.coli S17/ pKS1. Устойчивость к канамицину, кодируемая последовательностью гена kan, расположенной внутри клонированного фрагмента хромосомы B.pertussis, может наследоваться бактериями реципиента при прямом аллельном обмене между нативным фрагментом в составе хромосомы и мутантным в составе рекомбинантной плазмиды, либо в результате интеграции плазмиды pKS1 в хромосому реципиента, сопровождающейся появлением двух копий целевого фрагмента, одна из которых содержит мутантную, а вторая, нативную последовательности (коинтеграт). Согласно общим представлениям о генетической рекомбинации, следует ожидать, что события интеграции будут регистрироваться значительно чаще, чем события прямого аллельного обмена или разрешения коинтегратов. Действительно, подавляющее большинство трансконъюгантов, из более чем 500 отобранных на среде КУА с канамицином и рифампицином, сохраняли маркер устойчивости к тетрациклину, что указывало на наличие коинтегратов между плазмидой и хромосомой. Только 3 и 2 отдельные колонии трансконьюгантов B.pertussis 135 и 232 после трехкратной расчистки на среде КУА с канамицином и рифампицином и рассевом до отдельных колоний и анализом методом реплик имели фенотип RifR КmR не содержали плазмидного маркера устойчивости к тетрациклину (tet) и плазмидной ДНК. ПЦР ДНК хромосомы, выделенной из бактерий 4-х трансконъюгантов (по два трансконъюганта В.pertussis 232 и 135) выявила фрагменты расчетного размера. Результаты рестрикции специфического продукта ПЦР с праймерами (S2f и S1-S) ферментом EcoRV подтвердили наличие в них запланированной мутации. Для дальнейшей работы были выбраны два клона B.pertussis 135-35 и B.pertussis 232–5 (далее B.pertussis -35 и B.pertussis –5). Последовательности продукта ПЦР ДНК хромосомы B.pertussis 5 и B.pertussis -35 полностью соответствовали ожидаемой и содержали обе запланированные мутации.
Полученный результат указывал на возможность использования вектора pKnock для решения поставленной задачи. Однако, очевидно, что невозможность селекции событий прямого аллельного обмена значительно усложняет отбор искомых рекомбинантов при наличии селективного маркера и делает его не возможным при отборе событий потери селективного маркера. Предполагалось, что использование суицидного вектора pJQ позволит устранить оба недостатка вектора pKnock.
Рекомбинантная плазмида, содержащая мутантный оперон ptx в составе вектора pJQ, передана в бактерии StrRNalR B.pertussis 475 в скрещивании с E.coli Sm10/ pSK2. Доминантность признака StrS в составе плазмиды pJQ позволяет осуществить отбор трансконъюгантов, содержащих в хромосоме B.pertussis только копию целевой мутантной последовательности, и исключить трансконъганты, содержащие коинтеграт хромосомы с плазмидой. Искомые трансконъганты должны иметь фенотип StrRGmSKmR. Трансконьюганты отбирали на селективной среде КУА, содержащей налидиксовую кислоту и канамицин. Расчищали два раза согласно стандартным методикам на чашках КУА с добавлением налидиксовой кислоты и канамицина, затем высевали на чашки КУА со стрептомицином или стрептомицином + канамицином. Выросшие колонии двукратно расчищали на чашках со стрептомицином + канамицином и проверяли по маркерам устойчивости к Str, Nal, Km и Gm. Клоны StrRNalRKmRGmS использовали для дальнейшего анализа. Генетический анализ трансконъгантов показал, что все клоны StrRNalRKmR, выросшие на среде с добавлением стрептомицина чувствительны к Gm. По-видимому, 110 StrRNalRKmRGmS трансконъюганты являются искомыми рекомбинантными бактериями B.pertussis, в хромосоме которых на месте дикого аллеля ptx находится его мутантная копия, меченная геном устойчивости к канамицину. В проведнных скрещиваниях на селективной среде КУА с добавлением налидиксовой кислоты и канамицина через 5-7 суток удавалось получить от нескольких десятков до нескольких сотен колоний. Интересно отметить, что на селективной среде КУА + стрептомицин + канамицин вырастали единичные колонии или колонии не регистрировали совсем. Выросшие единичные колонии после расчистки имели искомый фенотип StrRNalRKmRGmS. Эти результаты показывают, что частота прямого аллельного обмена в использованном скрещивании более чем в 100 раз ниже частоты образования коинтегратов, что совпадает со значениями, полученными нами при использовании плазмид на основе вектора pKnock. Следовательно, наличие системы StrS селекции искомых событий рекомбинационного обмена позволяет значительно повысить наджность метода аллельного обмена для конструирования искомых мутаций в хромосоме бактерий B.pertussis. Для оценки частоты разрешения коинтегратов проведена паралельная раститровка культуры бактерий, выросших на среде КУА + налидиксовая кислота + канамицин, на среды КУА + налидиксовая кислота + канамицин и КУА + стрептомицин + канамицин. Количество колоний, выросших на среде со стрептомицином было в несколько сотен раз ниже, чем на среде с налидиксовой кислотой. 96 колоний с чашки налидиксовая кислота + канамицин имели фенотип StrRNalRKmRGmR, а с чашки стрептомицин + канамицин - StrRNalRKmRGmS. Полученные результаты указывают, что частота спонтанного разрешения коинтегратов составляет 10-2 -10-3 на клетку. Низкие частоты разрешения коинтегратов и событий прямого аллельного обмена, подтверждают важность использованной системы селекции, тем более необходимой для исключения маркера устойчивости к канамицину из хромосомы, о чм будет сообщено при последующем изложении.
Десять независимых StrRNalRKmRGmS трансконъюгантов были подвергнуты дальнейшему анализу с целью установления структуры модифицированных участков генома B.pertussis. На рисунке 2.2.7 представлена конечная структура полученного KmR рекомбинанта (схема коинтеграта не представлена).
Структуру хромосомы в области модификации гена ptxS1 определяли в результате рестрикции продуктов амплификции образцов ДНК, выделенной из бактерий, с праймеров KTF3-КTR3. Для рестрикции использовали ферменты Асс1 и EcoRV. На рисунке 2.2.8 представлены результаты рестрикции продуктов амплификации тестируемых ДНК: ДНК B.pertussis 4 и ДНК B.pertussis 475. На рисунке видно, что рестрикция EcoRV ампликонов всех тестируемых ДНК и ДНК B.pertussis 4, отличается от рестрикции ампликона B.pertussis 475. Видно, что все тестируемые ампликоны содержат сайт EcoRV. Эта картина соответствует рестрикции ампликона плазмиды pSK1, содержащей требуемые мутации в гене ptxS1. Для подтверждения полученного результата проведено определение последовательности трх из 10 проанализированных ампликонов. Секвенирование подтвердило наличие описанных ранее мутаций по аминокислотам Arg9 (CGC), Glu129(AAG).