Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Особенности биологии и экологии боррелий 11
1.1.1. Систематическое положение. Видовое разнообразие 11
1.1.2. Морфология, особенности биологии 11
1.1.3. Организация генома 15
1.1.4. Экологические особенности
1.2. Боррелии как возбудители иксодового клещевого боррелиоза 19
1.3. Географическое распространение B. burgdorferi s.l. 21
1.4. Методы установления видовой принадлежности B. burgdorferi s.l. 22
1.5. Изучение внутривидового разнообразия B. burgdorferi s.l.
1.5.1. Анализ последовательностей межгенных спейсеров 28
1.5.2. Анализ последовательностей генов поверхностных белков 29
1.5.3. Мультилокусное сиквенс-типирование на основе секвенирования
генов домашнего хозяйства 30
1.5.4. Мультилокусный спейсер-анализ 34
1.6. Изучение боррелий и их распространение на территории России 35
1.7. Особенности филогеографии и экологии B. miyamotoi 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 42
2.1. Материалы исследования 42
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение нуклеиновых кислот 44
2.2.2. Определение наличия ДНК боррелий в образцах 44
2.2.3. Определение видовой принадлежности боррелий 45
2.2.4. Определение видовой принадлежности клещей 47
2.2.5. Мультилокусное сиквенс-типирование боррелий комплекса В.
burgdorferi s.l 48
2.2.6. Секвенирование фрагментов кодирующих генов и 16S-23S IGS В.
miyamotoi 49
2.2.7. Мультилокусный спейсер-анализ В. miyamotoi 50
2.2.8. Филогенетический анализ 50
2.2.9. Статистическая обработка результатов 50
ГЛАВА 3. Анализ видового разнообразия и частот встречаемости видов боррелий в природных очагах разных регионов России 52
3.1. Частота встречаемости боррелий в клещах 52
3.2. Видовой состав и соотношение видов боррелий 54
3.3. Соотношение видов боррелий в зоне симпатрии клещей I. persulcatus и I. pavlovskyi 60
ГЛАВА 4. Молекулярно-генетическая характеристика популяций B. Burgdoreferi S.L. на основе МЛСТ 62
4.1. Сравнение результатов МЛСТ и анализа 5S-23S рРНК межгенного
спейсера 62
4.2. Филогеографическая структура B. afzelii 68
4.3. Филогеографическая структура B. bavariensis 71
4.4. Филогеографическая структура B. garinii 73
4.5. Особенности и ограничения метода МЛСТ 75
ГЛАВА 5. Молекулярно-генетическая характеристика популяций в. miyamotoi 77
5.1. Анализ последовательностей фрагментов кодирующих генов и 16S-23S
IGS В. miyamotoi 77
5.2. Разработка методики мультилокусного спейсер-анализа (МЛСА) 83
5.3. Применение методики МЛСА для анализа популяций B. miyamotoi 83
Заключение 92
Выводы 94
Список использованных сокращений 95
- Боррелии как возбудители иксодового клещевого боррелиоза
- Определение видовой принадлежности боррелий
- Соотношение видов боррелий в зоне симпатрии клещей I. persulcatus и I. pavlovskyi
- Филогеографическая структура B. garinii
Введение к работе
Актуальность проблемы
Боррелии комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato являются возбудителями
иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) – природно-очагового заболевания,
регистрируемого на территории 72 субъектов Российской Федерации с ежегодной
заболеваемостью от 6,4 до 9,9 тысяч случаев (Ястребов и др., 2012). Было
установлено, что повсеместное распространение и преимущественное
эпидемическое значение в России имеют виды B. garinii и B. afzelii, а также недавно обнаруженный вид B. miyamotoi. В 2009 году один из серотипов B. garinii был выделен в качестве отдельного вида B. bavariensis на основе данных мультилокусного сиквенс-типирования (МЛСТ) (Margos et al., 2009). Было показано, что метод МЛСТ обладает высокой информативностью и может быть применен как для изучения эволюции боррелий, так и для выявления филогенетических линий, отличающихся повышенной патогенностью для человека. Однако, на момент начала наших исследований в международную базу данных Borrelia MLST Database () были депонированы последовательности только трех изолятов из России. В связи с изменением классификации боррелий необходимо было проведение сравнительных исследований для уточнения таксономического статуса геногрупп внутри видов B. garinii и B. afzelii, а также их соотношения в разных регионах. Молекулярно-генетический анализ B. miyamotoi на территории России выявил отсутствие генетической изменчивости данного вида, что обусловило необходимость разработки новой системы генотипирования, основанной на вариабельных генетических маркерах.
Степень разработанности темы исследования
Идентификация первых российских изолятов B. burgdorferi s.l. была проведена с использованием моноклональных антител (Крючечников и др., 1987). В дальнейшем для дифференциальной диагностики видов боррелий широко использовался метод ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов продуктов ПЦР) 5S-23S рРНК межгенного спейсера. Этот подход
позволил выделить внутри B. garinii три геногруппы: 20047, NT29 и СhY13p. Было установлено, что в клещах Ixodes persulcatus чаще встречается геногруппа B. garinii NT29, а в I. pavlovskyi и I. ricinus – геногруппа 20047. На основе данного маркера был также проведен детальный филогенетический анализ B. garinii и B. afzelii (Коренберг и др., 2006; Nefedova et al., 2010). В 2008 г. появились первые данные об обнаружении B. miyamotoi на территории России (Fomenko et al., 2008). Для изолятов B. miyamotoi, выделенных из одного вида клещей, был показан крайне низкий уровень генетической изменчивости или её отсутствие (Bunikis et al., 2004; Fomenko et al., 2011; Geller et al., 2012; Cosson et al., 2014; Crowder et al., 2014; Takano et al., 2014). В частности, изоляты B. miyamotoi азиатского типа, выделенные на территории России, обладали идентичными последовательностями по таким генетическим маркерам, как гены 16S рРНК, fla, p66 и glpQ (Fomenko et al., 2010; Fomenko et al., 2011; Platonov et al., 2011).
Цель исследования
– с помощью новых молекулярно-генетических подходов охарактеризовать
видовой состав и филогеографическую структуру видов боррелий,
циркулирующих на территории России.
Задачи исследования
1. Установить зараженность боррелиями клещей I. persulcatus, I. pavlovskyi и
Dermacentor sp., собранных с растительности и от населения в разных регионах
России.
2. Разработать систему определения видовой принадлежности боррелий на
основе видоспецифичной ПЦР в реальном времени и установить соотношение B.
afzelii, B. bavariensis, B. garinii и B. miyamotoi в клещах, собранных в разных
регионах.
3. Установить филогеографическую структуру боррелий B. afzelii, B.
bavariensis и B. garinii на основе МЛСТ.
4. Разработать систему мультилокусного спейсер-анализа для выявления
генетической изменчивости B. miyamotoi и применить её для образцов B.
miyamotoi азиатского типа, выделенных на территории России.
Научная новизна работы
В настоящей работе впервые была разработана система дифференцировки видов боррелий, циркулирующих в природных очагах на территории России, на основе ПЦР в реальном времени с флуоресцентными зондами TaqMan, что дает возможность оценить не только видовой состав, но количественное содержание каждого вида в образце. Впервые данная система была применена для анализа большой выборки клещей из разных регионов страны, что позволило показать ассоциацию B. garinii с клещами I. pavlovskyi в Томской области.
Впервые было проведено исследование популяций боррелий B. afzelii, B. bavariensis и B. garinii, циркулирующих в природных очагах России, с помощью метода мультилокусного сиквенс-типирования (105 изолятов и образцов ДНК); выявлен 51 сиквенс-тип, не представленный в базе данных Borrelia MLST Database (ST431-446 и ST593-627). Показано, что российские изоляты B. afzelii формируют обособленную группу, филогенетически близкую изолятам из Китая и Японии.
Впервые была разработана система мультилокусного спейсер-анализа, которая может быть применена для исследования всех типов B. miyamotoi. Впервые высказана гипотеза о крайне низком генетическом разнообразии азиатского типа и его клональном распространении по территории Евразии, а также показано, что в популяциях клещей I. persulcatus и I. pavlovskyi циркулирует один и тот же генетический вариант B. miyamotoi.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные в настоящей работе данные позволяют охарактеризовать генетическую структуру видов боррелий, встречающихся на территории России, с точки зрения новых подходов к изучению генетического разнообразия микроорганизмов, главную роль среди которых играет мультилокусное сиквенс-типирование. Разработанная система видовой дифференцировки позволяет эффективно определить видовую принадлежность боррелий и может быть использована другими исследователями, в том числе для исследования клинических образцов. Применение метода МЛСТ позволило пополнить
международную базу данными о российских изолятах и провести сравнительный
анализ с изолятами из других стран по стандартизованной схеме. Разработанная
система мультилокусного спейсер-анализа B. miyamotoi может использоваться
зарубежными исследователями для выявления генетической изменчивости
данного вида в других странах. Полученные в настоящей работе
последовательности были депонированы в общедоступные базы данных NCBI
GenBank (435 последовательностей) и Borrelia MLST Database
(последовательности восьми генов 105 изолятов и образцов ДНК).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Недавно предложенный вид B. bavariensis соответствует геногруппе NT29 B. garinii и встречается в клещах I. persulcatus чаще или с той же частотой, что и B. garinii (объединяет геногруппы 20047 и ChY13p). Напротив, в клещах I. pavlovskyi преобладает B. garinii.
-
Все российские сиквенс-типы B. afzelii были выявлены впервые, большая часть из них формирует обособленную группу, филогенетически близкую изолятам из Китая и Японии.
-
Филогеографическая структура B. bavariensis и B. garinii характеризуется высоким генетическим разнообразием и неоднородным географическим распределением сиквенс-типов.
4. Азиатский тип B. miyamotoi отличается крайне низкой генетической
изменчивостью как на уровне кодирующих генов, так и на уровне некодирующих
межгенных спейсеров, что может свидетельствовать о быстром клональном
распространении B. miyamotoi по территории Евразии.
Апробация работы и публикации
Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных конференциях: 14-15 апреля 2010 г., г. Екатеринбург: 65-ая Всероссийская научно-практическая конференция молодых учёных и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения»; 1-2 ноября 2011г., г. Омск: Всероссийская конференция с международным участием «Современные аспекты природной
очаговости болезней»; 11-12 апреля 2012 г., г. Екатеринбург: 67-ая Всероссийская
научно-практическая конференция молодых учёных и студентов с
международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения»; 26-29 июня 2012 г., г. Иркутск: международная научная конференция «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами»; 1-5 октября 2012 г., г. Екатеринбург: II Всероссийская с международным участием школа-конференция молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации»; 15-19 апреля 2013 г., г. Екатеринбург: Всероссийская конференция молодых учёных «Экология: теория и практика»; 5-7 июня 2013 г., г. Санкт-Петербург: международная конференция «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций»; 8-10 октября 2013 г., г. Москва: российская конференция с международным участием «Актуальные проблемы клещевого энцефалита»; 11-13 ноября 2014 г., г. Омск: научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные аспекты природной очаговости болезней».
По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в зарубежных журналах, входящих в международную систему научного цитирования Web of Science и рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем диссертации
Боррелии как возбудители иксодового клещевого боррелиоза
Геном видов рода Borrelia состоит из одной линейной хромосомы с ковалентно замкнутыми концами, длиной около 900 тысяч п.н., и многочисленных плазмид – как кольцевых, так и линейных, размером от 5 до 220 т.п.н. (общий размер около 600 т.п.н.) [41, 42, 93, 142]. В настоящее время полногеномные последовательности получены для семи видов боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. и одиннадцати видов группы КВЛ. Хромосома типового штамма B. burgdorferi B31 (номер доступа GenBank NC_001318) содержит 860 генов (797 из которых кодируют белки) и 26 псевдогенов. Хромосомы, которые несут большую часть генов домашнего хозяйства, относительно постоянны по составу и расположению генов внутри рода, тогда как генетическая информация, содержащаяся в плазмидах, более вариабельна. Геном B. burgdorferi B31 включает 12 линейных и 9 кольцевых плазмид, однако, их количество варьирует в зависимости от вида и может уменьшаться в процессе культивирования [142]. Функции большинства плазмидных генов до сих пор не изучены, однако известно, что некоторые из них обусловливают синтез различных липопротеинов, поринов, декорин-связывающих белков и т. д.
Организация генов рРНК боррелий заслуживает особого внимания. Так, боррелии комплекса B. burgdorferi s.l. обладают одной копией 16S рРНК и двумя копиями каждого из генов 23S рРНК и 5S рРНК, все гены расположены внутри участка хромосомы длиной около 10 т.п.н. [161]. Гены 23S рРНК (rrlA и rrlB) и 5S рРНК (rrfA и rrfB) тандемно повторяются в порядке 23S-5S-23S-5S и не связаны с геном 16S рРНК (rrs), расположенным на расстоянии около 2 т.п.н. Отдельные копии 23S-5S повторов разделены спейсером (5S-23S рРНК intergenic spacer, IGS) длиной около 180 п.н. Внутри 23S-5S повтора последовательности 23S и 5S рРНК разделены спейсером длиной 22 п.н. В геноме боррелий группы КВЛ имеется только одна копия каждого гена рРНК [161].
Боррелии – единственные спирохеты, для поддержания и передачи которых необходимы членистоногие переносчики (в большинстве случаев ими являются разные виды клещей). Необходимость размножения как в холоднокровных (клещ), так и в теплокровных (птицы, млекопитающие) хозяевах привела к появлению ряда экологических особенностей, отсутствующих у других спирохет.
Инфицированные боррелиями клещи в процессе питания через слюну заражают животных, а неинфицированные клещи получают возбудителей от животных, в крови которых циркулируют боррелии [9, 43]. Возбудители, клещи переносчики и популяции позвоночных животных, поддерживающие их существование, образуют трехчленные паразитарные системы, характеризующиеся разветвленными связями между всеми составляющими [16, 17]. Прокормителями иксодовых клещей в природных очагах могут выступать не менее 300 видов позвоночных, из них около 100 видов мелких млекопитающих (мыши, полевки крысы, белки, зайцы, ежи и др.) и более 170 видов птиц (преобладают птицы, гнездящиеся на земле) [26, 76, 177]. Несмотря на значительное число видов теплокровных хозяев, только некоторые из них способны эффективно поддерживать размножение и жизнедеятельность боррелий, а также обеспечивать их передачу клещу в процессе его питания.
Восприимчивость хозяев к боррелиям во многом определяется наличием в их крови специфических белков – компонентов системы комплемента, обладающих бактерицидной активностью. Так как активация системы комплемента неспецифична и происходит в кишечнике клеща (куда попадает кровь в процессе питания), спирохеты могут подвергнуться лизису еще до попадания в организм хозяина. Таким образом, взаимодействие с системой комплемента позвоночного хозяина может оказывать большое влияние на циркуляцию боррелий в природных очагах, определяя круг потенциальных хозяев [177]. Например, было показано, что B. afzelii и B. garinii 4 серотипа (сейчас B. bavariensis) чувствительны к сыворотке птиц, в то время как B. garinii других серотипов к ней устойчива, но погибает под действием сыворотки грызунов [103] (Рисунок 2). Однако, данные ассоциации с переносчиками, хотя и были показаны экспериментально, не могут рассматриваться как абсолютные, поскольку в ряде публикаций была показана возможность нахождения видов боррелий в «нетипичных» хозяевах [11, 13, 75].
Вероятно, большую роль в распространении боррелий играют перелетные птицы, так как они не только являются резервуарными хозяевами для таких видов как B. burgdorferi, B. garinii, B. valaisiana, но и распространяют инфицированных клещей на большие расстояния. Было показано, что в организме некоторых видов птиц латентная инфекция может активироваться при ослаблении иммунной системы, что может объяснять распространение спирохет в том случае, если время перелета птиц превышает время питания клещей [62, 87].
Боррелии комплекса B. burgdorferi s.l. используют в качестве переносчиков твердых клещей рода Ixodes, при этом основную роль играют четыре вида клещей комплекса I. ricinus: I. ricinus L. (Европа), I. persulcatus Schulze (Азия), I. scapularis Say (Атлантическое побережье США) и I. pacificus Cooley & Kohls (Тихоокеанское побережье США) [143, 167]. Было показано, что I. pavlovskyi Pomerantsev (распространен на Алтае и Дальнем Востоке) также является компетентным переносчиком боррелий и может иметь значение для поддержания популяции боррелий на своем ареале [5, 100].
Определение видовой принадлежности боррелий
Работа была проведена на базе лаборатории молекулярной генетики Института естественных наук Уральского федерального университета (г. Екатеринбург) при сотрудничестве с ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии по Свердловской области» (Лаборатория контроля биологических факторов). В качестве материала для исследования использовались: 1) голодные взрослые особи клещей, собранные на флаг с растительности в 2010-2014 гг. (более 2800 образцов, собраны на территории Архангельской и Кировской областей, Пермского края, Республики Коми, Свердловской, Курганской, Тюменской, Омской, Новосибирской и Томской областей, Алтайского и Приморского краев, единично – в других регионах); 2) пулы клещей (от 1 до 20 клещей в образце), собранные с растительности на территории Свердловской области в 2010-2014 гг. (2195 образцов); 3) клещи, предоставленные пострадавшими от укуса людьми в 2010-2014 гг. (Свердловская область, 882 образца); 4) 39 изолятов боррелий, полученных путем посева гомогенизированных клещей в жидкую среду BSK-H в 2011-2013 гг. Клещей родов Ixodes и Dermacentor идентифицировали по морфологическим признакам, вид клещей рода Ixodes определяли с помощью видоспецифичной ПЦР (раздел 2.2.4).
Для культивирования боррелий в качестве посадочного материала использовались клещи, собранные на флаг в разных регионах России в весенне-летние периоды 2011-2013 гг. (Таблица 5).
Подготовку клещей и инокуляцию клещевого гомогената в среду для культивирования проводили в стерильных условиях в ламинарном боксе. Клещей подвергали гомогенизации стерильными пестиками в 200 мкл физиологического раствора, после чего 100 мкл гомогената вносилось в разлитую по стерильным 5 мл пробиркам среду BSK-H (Sigma, Aldrich Chemical Co.). Культивирование проводилось в термостате при температуре 34С. Контроль за ростом культуры боррелий осуществлялся визуально по изменению окраски среды с розоватой на желтую.
Архангельская обл., Котлас Архангельская обл., Котлас Екатеринбург, оз. Шарташ Екатеринбург, оз. Шарташ Екатеринбург, оз. Шарташ Екатеринбург, оз. Шарташ Североуральск Киров Киров
Пермский край, Кунгур Пермский край, Кунгур Пермский край, Кунгур Пермский край, Кунгур Пермский край, Кунгур Пермский край, Кунгур Пермский край, Кунгур Пермский край, Кунгур Пермский край, Чердынь Пермский край, Чердынь Пермский край, Чердынь Пермский край, Чердынь Пермский край, Чердынь Пермский край, Кудымкар Томск, с. Богашево Томск, с. Богашево Томск, с. Богашево Томск, с. Богашево Томск, с. Богашево Томск, с. Богашево Томск, с. Богашево Кемеровская обл., ст. Тайга
Клещей индивидуально замораживали в жидком азоте и гомогенизировали одноразовыми пестиками в 200 мкл физиологического раствора. Суммарную фракцию нуклеиновых кислот выделяли из 100 мкл суспензии гомогенизированных клещей либо 100 мкл жидкой культуры боррелий преципитационным методом с помощью коммерческого набора реагентов «Рибо-преп» (ООО «Интерлабсервис», Москва) или сорбционным методом при помощи набора «Рибо-сорб» (ООО «Интерлабсервис»), согласно прилагаемой инструкции. В 2013-2014 гг. выделение нуклеиновых кислот осуществлялось набором «Магно-сорб» (ООО «Интерлабсервис») на автоматической роботизированной станции для экстракции нуклеиновых кислот и дозирования жидкостей XIRIL (Швейцария).
Для увеличения чувствительности реакции ПЦР предварительно была проведена реакция обратной транскрипции. Синтез комплементарной ДНК (кДНК) проводили с использованием набора «Реверта-L» (ООО «Интерлабсервис»), согласно инструкции. Полученная кДНК была использована в качестве матрицы для проведения ПЦР-РВ на амплификаторе ABI 7500 (Applied Biosystems, USA) согласно методике [130]. В качестве внутреннего контроля выделения НК и амплификации использовался ген 16S рРНК клещей рода Ixodes. Детекция нуклеиновых кислот боррелий проводилась одновременно с детекцией кДНК вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Последовательности праймеров и зондов, а также мишени ПЦР-РВ приведены в Таблице 6. Таблица 6 – Праймеры и зонды для детекции боррелий, ВКЭ, а также клеща в качестве внутреннего контроля выделения и амплификации
Дифференцировка четырех видов боррелий в позитивных образцах осуществлялась в два этапа (Рисунок 10). На первом из них определяли наличие B. garinii s.l. (B. garinii + B. bavariensis), B. afzelii (мишень - ген uvrA) и B. miyamotoi (ген glpQ) с помощью набора праймеров №1 (Таблица 7, Рисунок 10). На втором этапе B. garinii s.l. - позитивные образцы были дифференцированы на B. garinii и B. bavariensis с помощью набора праймеров №2 (мишень - ген nifS). Последовательности праймеров приведены в Таблице 7. Дизайн праймеров осуществлялся с помощью программ Vector NTI 10.3.0 (Invitrogen) и Primer Express 3.0 (Applied Biosystems) на основе выравнивания последовательностей выбранных генов, полученных нами ранее (в том числе в ходе мультилокусного типирования) и имеющихся в базах данных GenBank и Borrelia MLST Database. Специфичность праймеров и зондов была проверена на ДНК протипированных согласно методике МЛСТ [115] изолятов B. afzelii, B. bavariensis и B. garinii, а также образцах ДНК B. miyamotoi. У ряда образцов определение вида было подтверждено последующим секвенированием последовательностей 5S-23S рРНК межгенного спейсера согласно методике [137]. У нетипируемых образцов были выборочно определены последовательности фрагментов генов uvrA и nifS, содержащих участки связывания праймеров и зондов.
Соотношение видов боррелий в зоне симпатрии клещей I. persulcatus и I. pavlovskyi
Необходимость определения видового состава боррелий в клещах, резервуарных хозяевах и клиническом материале обусловлена тремя причинами: 1) анализ видового состава боррелий в разных источниках может прояснить экологические особенности отдельных видов, 2) определение видового состава в укусившем человека клеще или клиническом материале может повлиять на прогнозы заболевания и стратегию лечения, 3) идентификация одиночных видов боррелий необходима для проведения дальнейшего генетического анализа (секвенирование фрагментов генов либо полных геномов). В настоящей работе была разработана система ПЦР-РВ-дифференцировки встречающихся на территории России четырех видов боррелий, включающая в себя наборы праймеров и флуоресцентно меченых олигонуклеотидных зондов, а также схему и условия проведения реакций ПЦР. Особенно актуальна дифференциальная детекция видов B. garinii и B. bavariensis по причине их генетической близости. Кривые амплификации, полученные в ходе скрининга образцов клещей с помощью ПЦР-РВ, показаны на Рисунке 11.
С помощью данной системы было дифференцировано около 90% позитивных образцов. Видовую принадлежность части образцов (в среднем 10%) определить не удалось. Выборочное секвенирование фрагментов генов, включающих участки связывания праймеров и зондов, не показало наличия мутаций, за исключением одного случая (была найдена одна нуклеотидная замена в праймере B_uvrA_R, поэтому в последовательность праймера был включен вырожденный нуклеотид). Хотя наличие нетипируемых образцов можно объяснить генетическим полиморфизмом и, как следствие, неполной специфичностью используемых праймеров или зондов, однако наиболее вероятной причиной является более низкая чувствительность праймеров для дифференцировки, чем для детекции (праймеры на ген 16S рРНК). Данная ситуация требует дальнейшего исследования и совершенствования системы дифференцировки с целью максимального возможного выявления всех видов.
Показатели зараженности клещей I. persulcatus отдельными видами боррелий представлены в Таблице 12. В среднем по всем регионам, встречаемость B. miyamotoi оказалась наименьшей – 5,4% (4,5-6,4%) относительно общего числа исследованных клещей, что в целом соответствует величинам, определенным ранее [70, 135]. Единственным регионом, в котором B. miyamotoi доминировала над другими видами и её встречаемость превышала 10%, оказалась Курганская область, где данный показатель составил 21% (13,6-30,0%) относительно общего числа клещей и 75,9% (56,5-89,7%) относительно числа позитивных образцов. Высокая зараженность клещей B. miyamotoi в Курганской области была отмечена и ранее [135], однако, объяснения этому до сих пор не было найдено.
Низкая встречаемость B. miyamotoi (по сравнению с боррелиями комплекса B. burgdorferi s.l.) в клещах I. persulcatus может быть связана с недавним появлением и распространением этого вида вследствие адаптации к твердым клещам (основные переносчики боррелий группы КВЛ – мягкие аргасовые клещи). В пользу этого предположения свидетельствует и низкий уровень генетического разнообразия B. miyamotoi [135]. В отличие от боррелий комплекса B. burgdorferi s.l., для B. miyamotoi была показана исключительная роль клеща-переносчика – генетические различия наблюдаются между изолятами B. miyamotoi, выделенными из клещей разных видов, в то время как различий внутри группы изолятов из одного переносчика практически не наблюдается [80, 135].
Среди видов B. burgdorferi s.l. наиболее часто встречалась B. afzelii (от 27 до 66% относительно числа позитивных образцов). Особое внимание обращает на себя соотношение B. bavariensis и B. garinii, ранее рассматриваемых в качестве одного вида, а также территориальные особенности их распределения (Рисунок 12). Было отмечено, что микст-инфекции этих двух видов встречаются крайне редко (в среднем в 2% случаев) (Таблица 12). В европейской части России, Тюменской и Курганской областях, Приморском крае B. bavariensis встречалась достоверно чаще, чем B. garinii, тогда как частоты встречаемости этих видов на Урале и в Новосибирской области достоверно не отличались (Рисунок 12).
Одним из преимуществ ПЦР-РВ является возможность одновременной детекции нескольких мишеней. Было показано, что содержание в клеще нескольких видов боррелий (микст-инфекция) является часто встречающимся явлением (в среднем 18,2% (15,7-20,8%) от числа зараженных боррелиями клещей I. persulcatus микст-инфицированы). Анализ частот встречаемости ассоциаций боррелий в клещах может дать ключ к пониманию экологических особенностей отдельных видов и характера их взаимоотношений в организме переносчика. В ходе исследования было показано, что микст-инфекции B. bavariensis и B. garinii встречаются крайне редко – в среднем 2,2% (1,4-3,4%), а микст-инфекции B. bavariensis и B. afzelii, напротив, достоверно чаще – 8,6% (6,8-10,6%) (p 0,05), что может быть объяснено особенностями экологии этих видов. Известно, что B. bavariensis (как и B. afzelii) использует в качестве основного резервуарного хозяина мелких млекопитающих, тогда как B. garinii – птиц [103, 116].
Наши результаты согласуются с исследованиями, проведенными ранее и показавшими, что B. garinii подгрупп NT29 (сейчас B. bavariensis) и 20047 (B. garinii s.s.) практически не встречаются одновременно в клещах, при этом в образцах мелких млекопитающих и клещей ДНК B. afzelii выявляется только в сочетании с ДНК B. garinii подгруппы NT29 [27]. Одной из важнейших задач настоящей работы стала оценка информативности системы видовой дифференцировки для обнаружения одиночных видов боррелий для последующего типирования изолятов с помощью методики МЛСТ [115]. Для этого 118 образцов, в которых метод ПЦР-РВ выявил наличие только одного вида боррелий, были типированы методом МЛСТ. Последующее секвенирование показало, что 2 образца содержали смесь видов (1 – B. afzelii+B. bavariensis, 1 – B. bavariensis+B. garinii), один из которых не детектировался предложенной системой ПЦР-РВ. В 22 образцах содержались смеси двух внутривидовых генетических вариантов.
Филогеографическая структура B. garinii
Изоляты B. bavariensis выделяются преимущественно на территории России и Азиатских стран. В Западной Европе B. bavariensis (ранее серотип 4 или группа NT29) встречается в клещах крайне редко [84, 96] и представлена всего двумя сиквенс-типами (ST84 и ST85), место изоляции одного из которых и дало название виду. В настоящей работе изоляты B. bavariensis были выделены на территории всех изученных регионов страны, причем анализ сиквенс-типов не выявил каких-либо географически обособленных групп внутри вида (Рисунок 15). Так, на Рисунке 15 видно, что они входят в разные филогенетические группы внутри B. bavariensis вне зависимости от географического происхождения. Самыми многочисленными сиквенс-типами стали ST128 (включает 19 изолятов, 9 из которых были выделены нами на территории Республики Коми, Архангельской области и Западной Сибири, остальные 10 – в Китае, Монголии и Японии) и ST328 (11 изолятов, 8 из которых были выделены нами на территории европейской части России, Урале и Западной Сибири, остальные 3 – в Монголии и Китае). Хотя для B. bavariensis, подобно B. afzelii, была показана ассоциация с мелкими млекопитающими, географической приуроченности сиквенс-типов и четкой структуры для этого вида установить не удалось. Анализ сиквенс-типов B. bavariensis, выделенных на территории европейской и азиатской части страны, а также в Китае, Японии и Монголии, показал значительное генетическое разнообразие и неоднородное географическое распределение, т.к. один и тот же сиквенс-тип встречался на отдаленных территориях. Таким образом, можно предположить, что хотя B. bavariensis и B. afzelii обладают сходным кругом хозяев, в основе их распространения лежат разные механизмы. Особый интерес представляют причины, которые привели к распространению некоторых сиквенс-типов (например, ST128 и ST328) на отдаленных территориях.
Для построения использованы сиквенс-типы из международной базы данных и полученные в настоящем исследовании. Деревья построены методом Neighbor-joining. Цветом и значками обозначены сиквенс-типы, выделенные на территории разных регионов России, а также азиатские и европейские сиквенс-типы. Сиквенс-типы, обсуждаемые в тексте, выделены жирным шрифтом
Аналогичная ситуация с отсутствием выраженной филогеографической структуры наблюдается и для B. garinii. Однако, для этого вида можно выявить четыре филогенетические линии: I – ChY13p (ST154, включает три изолята, два из которых были выделены нами в Екатеринбурге); II – азиатская линия (Китай, Япония, один ST с Урала); III – преимущественно азиатская линия (Китай, Япония, Сибирь, Урал) с небольшим количеством сиквенс-типов из европейских стран (сюда входит референсный штамм 20047); IV – преимущественно европейская линия, включающая в себя, однако, изоляты из Японии, Западной Сибири и Урала (Рисунок 16). Таким образом, популяции B. garinii также характеризовались неоднородностью географического распределения сиквенс-типов между разными территориями, что может отражать экологическую ассоциацию вида с птицами, обладающими высокой подвижностью. Это предположение было высказано и другими исследователями [118, 183].
Самыми многочисленными сиквенс-типами стали: ST372 (всего 7 изолятов, 6 из них были выделены нами на территории Свердловской области, 1 – из Японии), ST431 (7 изолятов, 6 были выделены на территории Свердловской области, один – Томской области), ST364 (6 изолятов, 5 были выделены на территории Свердловской области, один – из Японии). Интересно то, что большинство уральских изолятов филогенетически оказалось ближе азиатским группам, тогда как изоляты из Западной Сибири входили в одну группу с европейскими (Рисунок 16). При этом последовательность одного изолята из Екатеринбурга (Ekb950-2014) принадлежала сиквенс-типу ST244, выявленному на территории Англии. В некоторых группах IV линии сиквенс-типы из России не встречались (Рисунок 16). Рисунок 16 – Филогенетическое древо, построенное на основе конкатенированных последовательностей фрагментов генов домашнего хозяйства B. garinii. Для построения использованы сиквенс-типы из международной базы данных и полученные в настоящем исследовании. Деревья построены методом Neighbor-joining. Цветом и значками обозначены сиквенс-типы, выделенные на территории разных регионов России, а также азиатские и европейские сиквенс-типы. Сиквенс-типы, обсуждаемые в тексте, выделены
жирным шрифтом. Овалами выделены филогенетические линии (обсуждение в тексте). К сожалению, в рамках данной работы не удалось провести исследование МЛСТ изолятов B. garinii, выделенных на территории европейской части России и Дальнего Востока. В настоящем исследовании на данной территории были обнаружены преимущественно B. bavariensis, а немногие штаммы B. garinii обладали недостаточной для типирования концентрацией ДНК. Крайне интересным представляется исследование группы ChY13p, первоначально выделенной в Китае, а затем обнаруженной на территории России с низкой частотой встречаемости [127]. Нуклеотидные последовательности двух выявленных в настоящей работе изолятов этой группы (из Екатеринбурга) были полностью идентичны последовательнсоти изолята из Китая (ST154). Изучение группы ChY13p представляет большой интерес, поскольку ранее она рассматривалась в качестве переходного звена между B. garinii и B. afzelii [106].
. Особенности и ограничения метода МЛСТ Несмотря на высокую информативность метода МЛСТ, необходимо обратить внимание на некоторые ограничения в его использовании. Во-первых, для типирования образцов ДНК боррелий из клещей необходимо отбирать образцы с максимально возможной концентрацией ДНК (раздел 2.2.5) и проводить гнездную ПЦР вместо однораундовой (что необязательно при типировании изолятов боррелий). Во-вторых, данная методика неприменима для исследования смесей изолятов – как меж-, так и внутривидовых. Если выявление смесей нескольких видов возможно при предварительной видовой дифференцировке и исключении смешанных образцов, то смеси двух генетических вариантов одного вида можно выявить только при секвенировании. За время проведения настоящего исследования, даже при условии предварительной дифференцировки видов, было исключено из анализа 24 микст-изолята (20,3% от числа генотипированных изолятов), в том числе 2 (1,7%) – межвидовых и 22 (18,6%) – внутривидовых смесей. Проблемы зараженности одного клеща разными видами и внутривидовыми генетическими вариантами и возможности амплификации полного набора мишеней для проведения МЛСТ была отмечена и другими исследователями [158, 189]. В связи с этим в настоящей работе предлагается следующая схема амплификации фрагментов генома образцов ДНК боррелий, выделенных из клещей. На первом этапе проводится амплификация фрагментов двух генов nifS и clpA как наиболее вариабельных (Таблица 3) для проверки концентрации ДНК и возможности получения продуктов ПЦР для конкретного образца. Для выявления микст-инфекций на этом этапе, а соответственно, наименьшего расхода реактивов и времени, рекомендуется провести секвенирование данных двух генов. На втором этапе, при условии получения ПЦР-продукта и «чистых» последовательностей nifS и clpA, проводится амплификация и секвенирование генов clpX, pepX, pyrG, recG, rplB, uvrA. При этом для исследования изолятов можно использовать однораундовую ПЦР с внутренними праймерами, а для образцов ДНК боррелий из клещей – гнездную или полугнездную ПЦР согласно стандартной методике.