Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Vibrio parahaemolyticus и Vibrio alginolyticus – возбудители заболеваний человека 13
1.2 Факторы патогенности видов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus 24
1.3 Формирование «пандемичных» клонов V. parahaemolyticus 31
1.4 Традиционные и современные методы идентификации и дифференциации V. parahaemolyticus и V. alginolyticus 34
Собственные исследования 38
Глава 2. Материалы и методы 38
2.1 Бактериальные штаммы 38
2.2 Питательные среды и культивирование 46
2.3 Определение фенотипических признаков 48
2.3.1 Биохимические тесты 48
2.3.2. Феномен Канагава 48
2.3.3 Определение уреазной активности 49
2.4 Серологическое типирование парагемолитических вибрионов 49
2.5 Метод фаготипирования галофильных вибрионов 50
2.6 Метод определения цитотоксической активности на культуре тканей 51
2.7 Методика постановки реакции гемолиза 52
2.8 ПЦР-анализ и праймеры 52
2.9 Полногеномное секвенирование 55
2.10 MALDIOF масс-спектрометрический анализ 55
2.11 Определение чувствительности/устойчивости к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом (ДДМ) 57
Глава 3. ПЦР и maldiof масс-спектрометрический анализ в идентификации и внутривидовой дифференциации v. parahaemolyticus и v. alginolyticus 59
3.1 Идентификация видов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus традиционными
биохимическими методами 59
3.2 Межвидовая дифференциация V. parahaemolyticus и V. alginolyticus с помощью ПЦР тестирования на присутствие видоспецифичных генов 61
3.3 Меж- и внутривидовая дифференциация V. parahaemolyticus и V. alginolyticus
методом MALDIOF масс-спектрометрического анализа 65
3.4 Сравнительная оценка эффективности биохимического тестирования, ПЦР-анализа и
метода масс-спектрометрии для дифференциации V. parahaemolyticus и V. alginolyticus 71
Глава 4. Внутривидовая дифференциация парагемолитических вибрионов по признакам, сопряженным с патогенностью 76
4.1 Тестирование парагемолитических вибрионов по признакам, связанным с проявлением патогенности 76
4.2 Характеристика уреазопозитивных парагемолитических вибрионов и продукция ими гемолизина TRH in vitro 79
4.3 Разработка комплексного метода оценки вирулентности парагемолитических вибрионов 87
4.4 Биологическая активность штаммов V. parahaemolyticus в отношении культур клеток позвоночных 92
Глава 5. Гено- и фенотипическая характеристика коллекционных галофильных вибрионов 95
5.1 Изучение штаммов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus, выделенныхв Приморском крае при вспышке в 2012 году и спорадических случаях в 2013-2012 годах 95
5.2 Анализ свойств штаммов V. parahaemolyticus, выделенных из балластных вод судов, прибывающих в Международные порты Ростовской области 100
5.3 Оценка антибиотикорезистентности штаммов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus
5.3.1 Изучение чувствительности/устойчивости клинических штаммов V. parahaemolyticus к представителям различных групп антибактериальных препаратов in vitro 106
5.3.2 Изучение чувствительности/устойчивости клинических штаммов V. alginolyticus, к представителям различных групп антибактериальных препаратов in vitro 110
5.3.3 Отношение к антибактериальным препаратам штаммов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus, выделенных из объектов окружающей среды (ООС) 113
5.5 Анализ свойств и тестирование коллекционных штаммов V. alginolyticus на присутствие генов, сопряженных с патогенностью 117
Заключение 120
Выводы 125
Список сокращений и условных обозначений 127
Список литературы 1
- Традиционные и современные методы идентификации и дифференциации V. parahaemolyticus и V. alginolyticus
- Определение уреазной активности
- Характеристика уреазопозитивных парагемолитических вибрионов и продукция ими гемолизина TRH in vitro
- Оценка антибиотикорезистентности штаммов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus
Введение к работе
Актуальность темы исследования. V. parahaemolyticus и V. alginolyticus –
филогенетически близкородственные виды галофильных вибрионов [Montieri S. et
al., 2010]. У них общие экологические ниши, одинаковые культуральные свойства и
сходные биохимические признаки. V. alginolyticus раньше обозначали как биотип 2
V. parahaemolyticus, а в 1974 году решением Международного комитета по
бактериологической систематике эти микроорганизмы вынесены в самостоятельный
вид V. alginolyticus [Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology, 2005; Hugh R. et al.,
1975]. Бактерии видов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus могут быть причиной
заболеваний у людей. Средой обитания V. parahaemolyticus и V. alginolyticus
является морская вода, а основным фактором передачи человеку служат
инфицированные ими гидробионты. Опасность заражения V. parahaemolyticus и V.
alginolyticus существует везде, где население использует в питании продукты моря и
контактирует с морской водой. Употребление человеком в пищу морепродуктов,
контаминированных патогенными парагемолитическими и алгинолитическими
вибрионами, ведет к возникновению острого кишечного заболевания. Штаммы V.
alginolyticus также вызывают у человека раневые инфекции и отиты. Эти
микроорганизмы являются одним из наиболее важных патогенов в аквакультуре, причиняя огромный вред моллюскам и ракообразным [Определитель бактерий Берджи, 1997; Reilly G. et al., 2011].
Глобальное распространение заболевания, регистрируемое с 1996 года,
связывают с появлением группы клоновых штаммов V. parahaemolyticus,
названных в зарубежной литературе «пандемичными», которые принадлежат к определенным серогруппам, обусловливают более тяжелые случаи заболевания, склонные к эпидемическому распространению [Gonzales-Escalona N. et al., 2006]. В этой связи особую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение механизма патогенности и позволяющие проследить этапы формирования современных клонов возбудителя.
Бактериологическая диагностика заболеваний, вызываемых галофильными
вибрионами, разработана в Ростовском-на-Дону противочумном институте и
представлена в методических документах МУК 4.2.1793-03 «Лабораторная
диагностика заболеваний, вызываемых парагемолитическими и другими
патогенными для человека вибрионами» и МУК 4.2.2046-06 «Методы выявления и
определения парагемолитических вибрионов в рыбе, нерыбных объектах промысла,
продуктах, вырабатываемых из них, воде поверхностных водоемов и других
объектах». Однако идентификация и дифференциация некоторых видов вибрионов,
в частности V. parahaemolyticus и V. alginolyticus, иногда затруднена в связи с
вариабельностью биохимических признаков [Thompson F. L. et al., 2004] и
ограниченностью числа дифференциальных тестов, регламентированных
инструкциями. Поэтому для получения достоверных результатов диагностики необходимы дополнительные методы дифференциации и идентификации этих двух видов бактерий. В связи с этим весьма перспективны молекулярно-биологические методы, позволяющие определить в геноме бактерий участки молекулы ДНК, специфичные для каждого вида микроорганизма. В настоящее время в качестве
специфичных маркеров V. parahaemolyticus предложены гены tlh (термолабильного
гемолизина), gyrB (гиразы) [Venkateswaran K. et al., 1998], toxR (регуляторного
белка), Vpfla (жгутикового антигена). А Di Pinto c соавторами [Di Pinto A. et al.,
2005] использовали для дифференциации V. parahaemolyticus и V. alginolyticus
различия в нуклеотидных последовательностях генов металлопротеазы
(коллагеназы), соответственно – vppC и vapC. Однако все предложенные видоспецифичные праймеры были апробированы разными авторами на небольшом числе штаммов и с неоднозначными результатами. Поэтому необходимо оценить специфичность и эффективность использованных известных праймеров на большой коллекции вибрионов. Особую важность для дифференциации и идентификации видов рода Vibrio представляет метод масс-спектрометрии MALDI-TOF MS. В настоящее время в России и за рубежом активно развиваются подходы к идентификации микроорганизмов с использованием этого метода. Время-пролетная масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией – физический метод измерения массы ионов исследуемого вещества и их относительных количеств в смесях, использующий разделение ионов разных масс в вакууме под действием электрических и магнитных полей. Возможность получения специфических для конкретного вида микроорганизма масс-спектров белков дает основание для использования данного метода для быстрой идентификации микроорганизмов [Dieckmann R. et al., 2010; Emami K. et al., 2012]. В связи с этим представляется весьма перспективным использование данного метода и для исследований, проводимых в ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора по идентификации галофильных патогенных для человека вибрионов в пробах из объектов окружающей среды, в том числе из балластных вод судов, прибывающих в международные порты Ростовской области из-за рубежа. Кроме того, метод полезен и для внутривидовой дифференциации бактерий. Поэтому представлялось целесообразным оценить возможность использования его для сравнительной характеристики вибрионов внутри вида с целью типирования коллекционных штаммов.
Степень разработанности. Проблема межвидовой и внутривидовой
дифференциации близкородственных видов патогенных для человека вибрионов
является предметом изучения на протяжении нескольких десятилетий.
Необходимость совершенствования методических подходов к идентификации и внутривидовой дифференциации видов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus и использование результатов данных исследований в практике не вызывает сомнений.
Парагемолитические вибрионы в России впервые были выделены А. Е. Либинзон с соавторами из воды Черного моря и от больных в г. Новороссийске в 1973 году [Либинзон А. Е. с соавт., 1977, 1984, 1994]. Эти штаммы положили начало коллекции парагемолитических вибрионов, которая в дальнейшем благодаря энтузиазму А. Е. Либинзон и других исследователей пополнилась культурами, выделенными от больных при спорадических случаях, крупных вспышках ПТИ в 1984-1986 годах на побережье Черного и Азовского морей, а также из морской воды и от гидробионтов.
Различными группами ученых были проведены исследования по изучению
фенотипических и молекулярно-генетических свойств парагемолитических
вибрионов, ассоциированных с патогенностью [Карбышев Г. Л. , 1988; Данилкина Е. Б., 1995; Гальцева Г. В., 1995; Смоликова Л. М. с соавт., 2001, 2003; Хоменко Т. В., Мурначев Г. П., 2004; Голенищева Е. Н. с соавт., 2009; Монахова Е. В. с соавт., 2012; Подойницына О. А., 2013; Хунхеева Ж. Ю., Миронова Л. В., Афанасьев М. В. с соавт., 2014; Kita-Tsukamoto K. et al., 1993; Robert-Pillot A. et al., 2002; Di Pinto A. et al., 2005; Xie Z. Y. et al., 2005]. Однако работ, посвященных проблеме межвидовой дифференциации видов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus обобщающих материал за большой период времени не было. Практически не освещались в литературе и результаты исследований, направленных на изучение факторов патогенности алгинолитических вибрионов.
В последнее десятилетие в связи с методологическими прорывами в клинической микробиологии открылись новые возможности для более углубленного анализа молекулярно-биологических свойств галофильных патогенных для человека вибрионов. Кроме того ряд вопросов имеющих научное и практическое значение остаются не решенными. В этой связи исследования направленные на изучение молекулярно-биологических свойств V. parahaemolyticus и V. alginolyticus и совершенствование их межвидовой и внутривидовой дифференциации с использованием современных методов исследования (MALDI-TOF MS, ПЦР-анализ) являются актуальными и представляют как научную, так и практическую значимость. Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящего исследования.
Цель работы. Совершенствование методических подходов к идентификации и внутривидовой дифференциации видов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus на основании анализа их биологических и молекулярных свойств.
Основные задачи исследования:
-
Оценка эффективности использования видоспецифических праймеров для ПЦР-детекции V. parahaemolyticus и V. alginolyticus. Отбор наиболее специфичных праймеров и подбор условий амплификации для дуплексной ПЦР.
-
Анализ результативности MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа для идентификации близкородственных видов рода Vibrio – V. parahaemolyticus и V. alginolyticus. Определение масс-спектров, представляющих собой надежные маркеры для выявления внутривидового разнообразия V. parahaemolyticus.
-
Сравнительная оценка эффективности биохимического тестирования, ПЦР-анализа и метода масс-спектрометрии для дифференциации V. parahaemolyticus и V. alginolyticus.
4. Анализ фено- и генотипических свойств, ассоциированных с
патогенностью, коллекционных штаммов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus.
Разработка комплексного метода оценки вирулентности парагемолитических
вибрионов.
5. Полногеномное секвенирование уреазопозитивных штаммов V.
parahaemolyticus, биоинформационный анализ нуклеотидных последовательностей
областей trh-nik-ure.
6. Сравнительное исследование цитотоксического действия
парагемолитических вибрионов с различным набором генов факторов патогенности
на культуре клеток позвоночных, оценка возможности использования модели
культуры тканей для выявления экспрессии гена термостабильного прямого гемолизина (TDH).
7. Изучение чувствительности/устойчивости к антибактериальным
препаратам штаммов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus.
Научная новизна и теоретическая значимость:
Показано, что классические бактериологические методы в связи с вариабельностью признаков и большим фенотипическим сходством вибрионов видов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus не являются достаточными для их эффективной дифференциации и идентификации, а могут быть использованы только для выделения возбудителя в чистой культуре из исследуемого материала. Поэтому для надежной и эффективной диагностики необходимо использовать традионные методы в сочетании с современными молекулярными (MALDI-TOF-MS и ПЦР).
Совокупность методов классической бактериологии, MALDI-TOF-MS анализа и ПЦР позволила выявить широкий спектр галофильных вибрионов из балластных вод судов, прибывающих в международные порты Ростовской области. Метод MALDI-TOF-MS оказался наиболее эффективным и достоверным способом видовой идентификации представителей рода Vibrio.
На большой коллекции штаммов галофильных вибрионов оценена
специфичность праймеров для детекции генов tlh, gyrB, toxR, Vpfla, vppC и vapC,
используемых для межвидовой дифференциации штаммов V. parahaemolyticus и V.
alginolyticus. В результате показана высокая специфичность праймеров vppC и vapC,
и именно их детекцию следует использовать в дальнейшей работе по
дифференциальной диагностике этих вибрионов.
Оптимизирован преаналитический этап MALDI–TOF–MS и проведена
межвидовая и внутривидовая дифференциация коллекции штаммов V.
parahaemolyticus и V. alginolyticus с использованием метода MALDI-TOF масс-
спектрометрии. Определены молекулярные маркеры (масс-пики) для
внутривидового типирования V. parahaemolyticus. Молекулярными маркерами tdh+
штаммов V. parahaemolyticus служат 2 масс-пика, соответствующие белкам с m/z
5517 и 11029, trh+ штаммов – масс-пики с m/z 9896 и 6546, а высоковирулентных
штаммов V. parahaemolyticus серогруппы О3:К6 – масс-пики с m/z 4785, 4800, 9570.
Охарактеризованы штаммы V. parahaemolyticus и V. alginolyticus, выделенные от больных, вибриононосителей и из объектов окружающей среды (ООС) в период с 1973 по 2014 годы по широкому набору фено- и генотипических признаков.
Разработанный нами комплексный метод оценки вирулентности
парагемолитических вибрионов позволяет определять гемолитическую активность в тесте Канагава, уреазную на среде Кристенсена и ПЦР-детекцию генов tdh и trh.
Охарактеризована коллекция уреазопозитивных штаммов V. parahaemolyticus, представленная tdh-trh+ и tdh+trh+ группами вибрионов. Показано, что TRH in vitro продуцируют отдельные представители только первой группы.
Проведено полногеномное cеквенирование двух уреазопозитивных штаммов V. parahaemolyticus 16763 и 16976. Биоинформационный анализ нуклеотидных последовательностей областей trh-nik-ure показал, что гены trh обоих штаммов относятся к аллелю trh2, чем и обусловлена низкая гемолитическая активность по отношению к эритроцитам кур.
Разработанная нами модель для определения in vitro экспрессии гена термостабильного прямого гемолизина с использованием культуры тканей L-929 позволяет наиболее эффективно проследить зависимость между наличием генов trh и tdh и цитотоксической активностью штаммов V. parahaemolyticus.
Анализ антибиотикорезистентности на основе антибиотикограмм
коллекционных штаммов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus, выделенных от
людей и из объектов окружающей среды с 1973 по 2014 годы свидетельствует о
нарастании числа штаммов с множественной устойчивостью к антибактериальным
препаратам и о расширении у них спектра антибиотикоустойчивости. При этом
показано, что полирезистентность штаммов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus, выделенных из объектов окружающей среды выше, чем клинических.
Практическая значимость:
Разработаны, одобрены решением Ученого Совета ФКУЗ Ростовский-на-Дону
противочумный институт Роспотребнадзора (протокол № 6 от 2.07.2015 г.) и
утверждены директором института методические рекомендации «ПЦР-
идентификация патогенных для человека галофильных вибрионов».
Разработаны, одобрены решением Ученого Совета ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (протокол № 11 от 2.11.2010 г.) и утверждены директором института методические рекомендации по комплексной оценке вирулентности парагемолитических вибрионов.
Нуклеотидные последовательности trh-nik-ure-кластеров двух штаммов V. parahaemolyticus депонированы в базах GenBank под номерами KU244683 и KU244684.
Сформирован, одобрен Ученым Советом ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (протокол №13 от 10.12.2014 г.) и утвержден директором института 6-ой выпуск каталога патогенных для человека вибрионов, в который вошли сведения о месте, источнике, дате выделения, серогруппе, наличии генов tdh, trh и ureC.
Создана и зарегистрирована база данных «Фено- и генотипическая характеристика штаммов алгинолитических вибрионов» (свидетельство о государственной регистрации № 2014621362 от 24.09.2014 г.).
Депонирован авторский штамм V. parahaemolyticus КМ-228 (293) в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, который может быть использован в качестве штамма-продуцента TDH-подобного гемолизина (TRH).
Депонирован авторский штамм V. parahaemolyticus КМ-215 (Р-16199) в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, который может быть использован в качестве тест-штамма при комплексной оценке вирулентности парагемолитических вибрионов.
Депонированные штаммы V. parahaemolyticus КМ-228 и КМ-215
используются в лабораторной практике ФГКУЗ Противочумная станция Республики Крым Роспотребнадзора (акты внедрения от 27.12.2015 г.) и ФКУЗ
Причерноморская противочумная станция Роспотребнадзора (акты внедрения от 26.01.2016 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Для достоверной видовой идентификации V. parahaemolyticus и V. alginolyticus необходимо использовать протеометрические и молекулярно-генетические методы, что позволит повысить качество лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых патогенными для человека галофильными вибрионами. Из числа предложенных маркеров для видовой идентификации V. parahaemolyticus и V. alginolyticus установлена строгая специфичность по отношению к соответствующим видам генов металлопотеиназ (коллагеназ) – VppC и VapC и обоснована их диагностическая значимость. Метод MALDI-TOF-MS является наиболее эффективным способом видовой идентификации V. parahaemolyticus и V. alginolyticus в ходе мониторинга ООС.
-
Усовершенствованные преаналитические этапы MALDI-TOF масс-спектрометрического метода позволяют эффективно осуществлять межвидовую и внутривидовую дифференциацию представителей V. parahaemolyticus и V. alginolyticus. Выявленные молекулярные маркеры (масс-пики) дают возможность проводить внутривидовое типирование V. parahaemolyticus по таким эпидемически важным параметрам, как наличие факторов патогенности и принадлежности к высоковирулентному клону О3:К6.
3. Формула патогенных штаммов V. parahaemolyticus включает
гемолитическую активность в тесте Канагава (КР), уреазную активность и
потенциальную способность вибрионов к продукции гемолизинов (наличие генов
tdh и trh). Определены три варианта вирулентных парагемолитических вибрионов: 1.
tdh+ trh- КР+(-) Ure- ; 2. tdh- trh+ КР- Ure+ ; 3. tdh+ trh+ КР-(+) Ure+.
4. Штаммы V. parahaemolyticus, вызвавшие вспышку ПТИ в Хасанском районе
Приморского края в 2012 году относятся к серогруппе О3:К6, содержат в геноме
семь островов патогенности. Штаммы V. parahaemolyticus и V. alginolyticus,
выделенные при спорадических случаях заболевания в 2013-2014 гг.
характеризуются отсутствием основных факторов патогенности (генов tdh и trh) и
маркерных генов семи VPaI, за исключением VPaI-2. Полученные результаты
обосновывают необходимость мониторинга заболеваемости и внешней среды в
Дальневосточном регионе РФ с обязательной ПЦР-детекцией у выделенных
штаммов вибрионов генов патогенности.
5. В период с 1973 по 2014 годы наблюдается нарастание числа штаммов
парагемолитических вибрионов и алгинолитических вибрионов с множественной
устойчивостью к антибактериальным препаратам и расширение у них спектра
антибиотикоустойчивости. Штаммы V. parahaemolyticus и V. alginolyticys,
выделенные из объектов окружающей среды, обладают большей
полирезистентностью по сравнению с клиническими.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на
заседаниях проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы»
Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране
территории РФ (Ростов-на-Дону, 2009-2015 гг.), в материалах 18-й и 19-й
Российских гастроэнтерологических недель (Москва, 2012, 2013 г.), в Первой
Всероссийской научно-практической конференции «Гетерогенность популяций бактерий и вирусов и ее отражение в эпидемиологии и клинике инфекционных болезней» (Владивосток, 2013 г.), на научных конференциях молодых ученых ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (2013-2015 гг.), на VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014 г.), на третьем Санкт-Петербургском международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека: фундаментальные, клинические и экологические аспекты современной микробиологии» (Санкт-Петербург, 2014 г.) и на VII Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2015 г.).
Материалы работы были представлены в виде устного доклада на VI
Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов
Роспотребнадзора «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической
медицины» (Ставрополь, 2014 г.) и VII Всероссийской научно-практической
конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Современные проблемы эпидемиологии и гигиены» (Санкт-Петербург, 2015 г.). Фрагмент диссертации также доложен на Всероссийской научно-практической конференции «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения», посвященной 95-летию ФБУН ННИИЭМ им. академика И. Н. Блохиной Роспотребнадзора (Нижний Новгород, 2014 г.), где в конкурсе устных докладов молодых ученых в рамках конференции был оценен дипломом 1 степени.
Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 29 научных работ, из них 5 статей в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени.
Исследования выполнены в рамках плановых научных тем «Фено- и генотипическая характеристика парагемолитических вибрионов по признакам, связанным с проявлением вирулентности» (2008-2011 гг., № госрегистрации 01200800416), «Формирование коллекции патогенных для человека вибрионов» (2011-2015 гг., № госрегистрации 01201002623) и «Мониторинг судовых балластных вод международного морского транспорта в бассейне Азовского моря (2011-2015 гг., № госрегистрации 01201002620).
План диссертации. Одобрен Ученым советом и утвержден директором ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (протокол № 1 от 27.12.2014 г.).
Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные
в диссертации, получены лично автором в соавторстве с Чемисовой О. С.,
Смоликовой Л. М., Монаховой Е. В., Подойницыной О. А. На защиту вынесены только те положения и результаты, в которых роль соискателя была определяющей.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований (в том числе одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов, иллюстрирована 32 таблицами и 17 рисунками. Библиография содержит ссылки на 189 публикаций (46 отечественных и 143 зарубежных).
Традиционные и современные методы идентификации и дифференциации V. parahaemolyticus и V. alginolyticus
По частоте встречаемости и по тяжести вызываемых вибрионами заболеваний наиболее значимыми после возбудителя холеры являются галофильные микроорганизмы V. parahaemolyticus и V. alginolyticus. V. parahaemolyticus впервые был обнаружен в 1950 году Fujino T. et al. из научно-исследовательского института микробных болезней (Япония) во время вспышки пищевой токсикоинфекции, связанной с употреблением морской слабосоленой рыбы. Fujino T. [1951] отнес выделенную бактерию к роду Pasteurella и назвал ее Pasteurella parahaemolytica. В дальнейшем, благодаря прогрессу в области таксономии, различные научные показатели были скорректированы и определение рода и вида было пересмотрено. И в 1963 году возбудитель был переименован Sakazaki R. с соавторами в V. parahaemolyticus [Shinoda S., 2011]. Типовым штаммом является V. parahaemolyticus АТСС 17802, который был выделен в 1950 году из кишечного содержимого, полученного при вскрытии 64-летней женщины, умершей от пищевого отравления в городе Осака после употребления слабосоленых сардин [Hugh R. et al., 1975].
V. alginolyticus раньше являлся биотипом 2 V. parahaemolyticus и только в 1974 году был определен в обособленный вид. Типовой штамм – V. alginolyticus АТСС 17749 (штамм XII-53 выделен Nakamura T.), изолированный из испорченной ставриды, послужившей причиной пищевого отравления 7 августа 1959 года [Hugh R. et al., 1975].
V. parahaemolyticus и V. alginolyticus по результатам ДНК-ДНК-гибридизации, ДНК-РНК-гибридизации, теста на иммунологическую связь с супероксиддисмутазой являются филогенетически близкородственными видами [Montieri S. et al., 2010]. Они обладают сходными биохимическими и культуральными признаками (таблица 3).
Таблица 3 – Биохимические свойства видов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus [Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology, 2005] Характеристика, % положительных результатов № п/п Признаки вида V. parahaemolyticus вида V. alginolyticus 1. Подвижность 100 100 2. Оксид аза 100 100 3. Нитратредуктаза 100 100 4. Продукция: -индола; 100 80 5. - H2S; 0 0 6. - ацетилметилкарбинола в реакции Фогес-Проскауэра 0 80 7. Наличие:- лизиндекарбоксилазы; 100 100 8. - аргининдигидролазы; 0 0 9. - орнитиндекарбоксилазы 100 40 10. Образование газа из глюкозы 0 0 11. Ферментация: -глюкозы; 100 100 12. -лактозы; 0 0 13. -арабинозы; 80 0 14. -маннозы; 100 100 15. -сахарозы; 0 100 16. -целлобиозы; 0 100 Прололжение таблицы 17. -маннита; 80 100 18. -инозита; 0 0 19. -салицина; 0 0 20. -галактозы; 60 20 21. - глюкозы в среде Хью-Лейфсона O/F (к/к) 100 100 22. Рост в пептонной воде: - без соли; 0 0 23. - 3% NaCl; 100 100 24. - 7% NaCl; 100 100 25. - 10% NaCl; 0 100 26. Уреазная активность на среде Кристенсена 15 0 Главными биохимическими отличиями V. alginolyticus от V. parahaemolyticus являются способность к ферментации сахарозы, образование ацетилметилкарбинола и рост в 1% пептонной воде с 10 % NaCl. Антигенная структура видов Vibrio определяется в соответствии с основными классами бактериальных антигенов: соматического О-антигена, капсульного (К) и антигена жгутика (Н), которые, соответственно, связаны с бактериальным полисахаридом, внеклеточным слоем капсулы и жгутиком [Janda J. M., 1998]. Штаммы V. parahaemolyticus дифференцируются серологически на основе О- и К- антигенов. В настоящее время признаны 13 О-антигенов и 71 К-антиген [Hisatsune K. et al., 1993; Janda J. M., 1998; Honda T. et al., 2008]. Анализ состава липополисахаридного компонента серогрупп V. parahaemolyticus свидетельствует о том, что боковая цепь состоит менее чем из 10 моносахаридов. Все серогруппы продуцируют липополисахарид R-типа. Общими для всех 13 серогрупп являются глюкоза, L-глицеро-D манно-гептоза и D-глюкуроновая кислота. Связанные с серогруппами сахара: фукоза, арабиноза, D-глицеро-D-манно-гептоза, D-глюкозамин, D-галактозамин, 3-амино-3,6 дидезоксиглюкоза, 3-амино-3,6-дидезоксигалактоза, 2-кето-3-дезокси-D-трео-гексоновая кислота и 2-кето-3-дезоксиоктоновая кислота [Iguchi T. et al., 1995]. Флагеллины полярных жгутиков видов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus имеют общую антигенную детерминанту. Схемы для серологического типирования были разработаны Национальным институтом здравоохранения в Токио (Япония) для нескольких из наиболее часто выделяемых видов Vibrio, в том числе V. parahaemolyticus и V. alginolyticus [Baumann P. et al., 1984].
Естественным местом обитания галофильных морских вибрионов является вода и связанные с ней микроорганизмы, животные и растения. К факторам внешней среды, регулирующим концентрацию и распространение вибрионов, как в пресноводных, так и в морских экосистемах, относятся содержание органических и неорганических химических веществ, pH, температура, соленость, кислородный потенциал (давление кислорода) и действие УФ-света [Chakraborty S. et al., 1997]. Из них основными являются соленость (особенно концентрация Na+) и температура, которые регулируют распространение вибрионов в окружающей среде.
V. parahaemolyticus и V. alginolyticus являются естественными обитателями прибрежных зон и эстуариев и редко выделяются из пелагических зон (открытый океан) [Joseph S. W. et al., 1982]. Эти вибрионы обнаруживают в воде, донных отложениях, зоопланктоне, моллюсках и рыбе. Известны случаи выделения V. parahaemolyticus в пресной воде в Индонезии и Индии [Chakraborty S. et al., 1997]. V. parahaemolyticus и V. alginolyticus выделяют из разных морских обитателей, в том числе из моллюсков, устриц, омаров, морских гребешков, сардин, угря, крабов и креветок [Joseph S. W. et al., 1982]. Вспышки гастроэнтерита, вызванные этими вибрионами, как правило, связаны с употреблением в пищу крабов, креветок, устриц и омаров [Chakraborty S. et al., 1997].
Ареал распространения V. parahaemolyticus и V. alginolyticus достаточно широкий. Они обнаруживаются у берегов Северной и Центральной Америки (США, Канада, Панама), ряде стран Азии и Европы, Австралии, Африки (Гвинея, Морокко, Гане и т. д.), на побережье Каспийского, Балтийского, Японского, Белого, Черного (у берегов Болгарии и Турции) и Азовского морей [Daniels N. A. et al, 2000; Gonzalez N. et al., 2005; Martinez-Urtaza J. et al., 2005; Okuda J. et al., 1997; Mustapha S. et al, 2013]. Распространение парагемолитических и алгинолитических вибрионов в мире показано на рисунке 1.
Определение уреазной активности
Традиционным методом идентификации и дифференциации V. parahaemolyticus и V. alginolyticus является оценка биохимических признаков, основанная на детекции ферментативной активности бактерий. Для этого используются различные субстраты, метаболиты которых дают цветную окраску. Однако, фенотипическая изменчивость и таксономическое сходство штаммов этих видов затрудняет отличие по биохимическим признакам V. parahaemolyticus от V. alginolyticus, что требует для получения достоверных результатов диагностики использования дополнительных методов дифференциации и идентификации этих двух видов бактерий [МУК 4.2.1793-03; West P. A., Colwell R. R., 1984]. С этой целью в настоящее время во всем мире активно используют молекулярно биологические методы, одним из которых является метод секвенирования 16S рРНК и rpoB (ген, кодирующий субъединицу полимеразы РНК). Mollet C. et al. [1997] первыми применили анализ последовательностей rpoB, который оказался эффективным инструментом для идентификации вида бактерий, который затем был успешно применен для штаммов Vibrio десять лет спустя [Таrr C., et al., 2007]. Хотя в базе данных с последовательностями 16S рРНК домены бактерий и архибактерий (NCBI Генбанк) полностью описаны, полезность этого метода, как надежного для определения видов бактерий, ограничена сходством между последовательностями 16S рРНК многих видов Vibrio, в том числе V. parahaemolyticus и V. alginolyticus. Так, секвенирование 16S рРНК показало 99,7% гомологии между V. parahaemolyticus и V. alginolyticus, что не позволяет использовать этот метод для дифференциации названных микроорганизмов [Venkateswaran K. et al., 1998]. Когда дело доходит до филогенетической классификации штаммов Vibrio, то секвенирование гена rpoB (кодирующего субъединицу бета-РНК-полимеразы) является более надежным инструментом, чем секвенирование 16S рРНК (rRNA) [Ki J., et al., 2009; Mollet C. et al., 1997].
Метод ПЦР в свою очередь является быстрым и очень специфичным для обнаружения V. parahaemolyticus в экологических пробах воды, клинических образцах и различных продуктах питания [Шалу О. А. c соавт., 2010; Robert-Pillot A. et al., 2002; Tarr C. L. et al. ,2007; Ward L. N., Bej A. K, 2006]. Важнейшей задачей в данном контексте является дифференциация V. parahaemolyticus и V. alginolyticus, которые тесно связаны между собой и, поэтому, трудноразличимы [Kitasukamoto K. et al., 1993; Robert-Pillot A. et al., 2002; Xie Z. Y. et al., 2005]. В настоящее время в качестве специфичных маркеров V. parahaemolyticus предложены гены tlh (термолабильного гемолизина) [Bauer A., Rоrvik L. 2007], gyrB (гиразы) [Venkateswaran K. et al.,1998], toxR (регуляторного белка) [Bauer A., Rоrvik L., 2007], Vpfla (жгутикового антигена). Di Pinto А. et al. [2005] использовали для дифференциации V. parahaemolyticus и V. alginolyticus различия в нуклеотидных последовательностях генов металлопротеазы (коллагеназы), соответственно vppC и vapC. Однако все предложенные видоспецифичные праймеры были апробированы разными авторами на небольшом числе штаммов. Также особую важность для дифференциации и идентификации видов рода Vibrio представляет метод масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия – физический метод измерения массы ионов исследуемого вещества и их относительных количеств в смесях, использующий разделение ионов разных масс в вакууме под действием электрических и магнитных полей. Возможность получения специфических для конкретного вида микроорганизма масс-спектров белков дает основание для использования данного метода для быстрой идентификации микроорганизмов, что впервые было показано еще в 1975 году [Anhalt J. P., Fenselau C., 1975]. Однако, реализация этого принципа становится возможной только в последние годы и связана с появлением в арсенале масс-спектрометрии «мягкого» способа ионизации молекул исследуемого вещества (MALDI). Использование матричной лазерной десорбционной ионизации в комплексе с времяпролетной масс-спектрометрией (MALDIOF MS) обеспечило настоящий прорыв в анализе сложных биоорганических молекул, в частности, тяжелых, труднолетучих молекул нуклеиновых кислот и белков [Кубанова А. А. с соавт., 2005]. Анализ начинается с того, что на подложке масс-спектрометра смешивают биоматериал из колонии бактерий и специальную матрицу (2 ,5 дигидроксибензойная кислота). После этого образец помещают в прибор и подвергают воздействию наносекундных лазерных импульсов. При этом молекулы матрицы (-циано-гидроксикоричная кислота, 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты) и аналита (в частности, белки) переходят в газовую фазу, а протонированные молекулы матрицы взаимодействуют с белками, перенося на них положительный заряд. Под действием электрического поля ионизированные белки движутся от источника ионизации к детектору с ускорениями, обратно пропорциональными их атомным массам. Программное обеспечение прибора оценивает время пролета частиц и преобразует эту информацию в спектр молекулярных масс (масс-спектр). Масс-спектры анализируются экспертной системой, и на основании сведений о массах характеристических белков происходит идентификация микроорганизмов. Для идентификации используются белки, присутствующие в клетке в неизменной концентрации, независимо от внешних обстоятельств, таких как температура и время инкубации, тип питательной среды (рисунок 3).
С помощью данного метода возможно построение дендрограмм с целью определения филогенетического родства штаммов внутри вида. Преимуществами данного метода являются короткое время анализа, низкая себестоимость, широкий спектр анализируемых микроорганизмов, высокая воспроизводимость результатов. MALDIOF-MS – быстрый альтернативный метод ПЦР-анализу и биохимическим тестам для идентификации и классификации бактериальных штаммов на основе их белкового состава [Fenselau C., Demirev P., 2001; Oberkmann S., 2014; Sauer S. et al., 2008]. В нашей работе будет использован и оценен спектр методов для разработки подходящего подхода для идентификации и дифференциации видов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus (биохимические тесты, ПЦР-анализ с видоспецифичными праймерами, MALDIOF-MS), для выявления этих штаммов и оценки их патогенности. Это в свою очередь позволит сформировать рабочую коллекцию штаммов патогенных для человека вибрионов с расширенной характеристикой по фено- и генотипическим свойствам. Такая общирная характеристика станет важным шагом на характере распространения потенциально alginolyticus.
Характеристика уреазопозитивных парагемолитических вибрионов и продукция ими гемолизина TRH in vitro
На первом этапе исследования была проведена работа по оптимизации преаналитического этапа MALDIOF-MS. В методических указаниях для работы на приборах серии flex компании Bruker Daltonics указано, что условия культивирования исследуемых микроорганизмов не оказывают существенного влияния на процедуру прямого бактериального профилирования. При этом можно использовать различные среды и различные условия роста, рекомендуемые для конкретных групп патогеннов, что мало повлияет на набор пиков, представленных на масс-спектрометре.
Культивирование вибрионов возможно на различных питательных средах (Мартен, щелочной агар, LB), в том числе и селективных с добавлением специальных индикаторных веществ (СЭДХ-М, TSBS). Так как парагемолитические и алгинолитические вибрионы являются галофилами, то в соответствующие среды желательно добавление до 2% NaCl. Поэтому представляется важным проверить воспроизводимость и возможность снятия пиков при использовании культур вибрионов, выросших на различных питательных средах, в том числе с добавлением и без NaCl. Для этих целей по 10 штаммов видов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus были выращены на средах Мартен, щелочной агар, LB, СЭДХ-М и TSBS с добавлением и без добавления NaCl.
При использовании таких сред как Мартен, щелочной агар, LВ воспроизводимость пиков была достаточно хорошей, идентификация до вида была с достоверным показателем Score во всех случаях. При идентификации культур вибрионов, выросших на щелочном агаре уровень Score соответствовал в среднем 2.34, на Мартене – 2.45 и LВ – 2.51. Добавление в среду до 2% NaCl на показатель Score и идентификацию не повлияло. Однако, при культивировании вибрионов на селективных средах СЭДХ-М и TSBS возникли некоторые сложности с идентификацией исследуемых культур. В случае использования среды TSBS определение вида было затруднено (низкие значения показателя Score 1.85-1.99). А при культивировании вибрионов на СЭДХ-М снятие пиков и идентификация была вообще не возможна. Можно предположить, что это обусловлено индикаторными красителями, присутствующими в средах СЭДХ-М и TSBS (бромтимоловый и тимоловый синий). Таким образом, нами было показано, что использование различных сред для культивирования оказывает существенное влияние на прямое бактериальное профилирование представителей рода Vibrio.
Для надежной и эффективной идентификации вибрионов методом MALDIOF масс-спектрометрии с использованием масс-спектрометра Bruker Daltonics можно порекомендовать любую из щелочных сред: среду Мартена, щелочной агар или LВ как с добавлением 2% NaCl, так и без. При исследовании колоний вибрионов, выросших непосредственно на селективных средах СЭДХ-М и TSBS необходимо производить пересев на одну из щелочных сред без красителей.
Следующим этапом нашей работы явился анализ результативности использования MALDIOF масс-спектрометрического метода для характеристики близкородственных видов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus, а также определение масс-спектров, представляющих собой надежные маркеры для выявления внутривидового разнообразия V. parahaemolyticus.
Все исследуемые штаммы были изучены методом MALDIOF масс-спектрометрии с использованием масс-спектрометра Bruker Daltonics (Германия) с программным обеспечением Biotyper. Для определения возможности применения MALDIOF масс-спектрометрического анализа для внутривидовой дифференциации парагемолитических вибрионов и межвидовой дифференциации V. parahaemolyticus и V. alginolyticus в программе Flexcontrol в ручном режиме проводили обстрел с регистрацией до 70 наиболее интенсивных белковых спектров.
Анализ масс-спектров (рисунок 5, 6) V. parahaemolyticus и V. alginolyticus выявил у них 28 общих пиков, из которых 4 пика были с индексом интенсивности более 50 % (m/z 3627, 4284, 5181, 7200).
Масс-пики коллекционных штаммов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus m/z V. parahaemolyticus V. alginolyticus tdh+/trh- tdh+/trh-О3:К6 tdh-/trh- tdh-/trh+ 3627 4284 5181 7200 4970 6167 9935 10300 4785 4800 9570 5517 11029 9896 6546 Так как основным фактором патогенности V. parahaemolyticus является термостабильный гемолизин TDH, то актуален поиск молекулярных меток характерных для tdh+ штаммов. В нашем исследовании 2 пика, соответствующие белкам с m/z 5517 и 11029, были зарегистрированы только у штаммов с генетической характеристикой tdh+trh-, независимо от других характеристик (год и место выделения, серогруппа). Также особую важность представляет определение масс-пиков высоковирулентных штаммов V. parahaemolyticus серогруппы О3:К6, представляющих наибольшую угрозу для здоровья населения. Так масс-пики с m/z 4785, 4800, 9570 были выявлены только у штаммов данной серогруппы. Также масс-пики с m/z 9896 и 6546 были характерны только для trh+ штаммов (рисунок 5). На основе масс-спектрометрических профилей исследованных коллекционных штаммов V. parahaemolyticus, V. alginolyticus и других представителей рода Vibrio возможно построение дендрограмм, которые позволяют проводить молекулярное типирование и устанавливать степень филогенетического родства штаммов, выделенных в разные годы, на разных территориях. Дендрограмма, построенная в программе MALDI Biotyper 2.0 на основе сравнительного анализа масс-спектров штаммов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus демонстрирует эффективное разделение микроорганизмов этих видов. По результатам кластеризации видно, что V. parahaemolyticus и V. alginolyticus разделились на две ветви и только один штамм V. alginolyticus 13675, выделенный от больного в г. Новороссийске в 1975 году обособился в отдельный кластер. Также два штамма V. alginolyticus 16600, обладающий геном trh и изначально идентифицируемый как V. parahaemolyticus по биохимическим признакам и типовой штамм 16463 вошли в одну обособленную ветку в составе кластера V. parahaemolyticus (рисунок 7). Это свидетельствует о сильном сходстве этих близкородственных видов, которые раннее составляли общий вид. Штаммы V. alginolyticus в свою очередь были разделены на два кластера. Первый включал культуры, выделенные преимущественно в г. Новороссийске как из воды, так из клинических образцов. Во второй кластер вошли штаммы, выделенные главным образом на территории Республики Крым. Кластер парагемолитических вибрионов был разделен на несколько подкластеров также преимущественно по территориальному признаку.
Оценка антибиотикорезистентности штаммов V. parahaemolyticus и V. alginolyticus
Титр гемолизина этих штаммов составил 1/128-1/256. Обусловленность лизиса гемолизином TRH подтверждалась тем, что прогревание культур при 600С в течение 10 минут приводило к утрате гемолитической активности. Известно, что TRH, в отличие от TDH, при таком тепловом воздействии термолабилен [Honda Т. et al., 1988]. Интересно отметить, что уреазопозитивные вибрионы, в геноме которых присутствовали одновременно гены tdh и trh, не экспрессировали их in vitro. Такие штаммы были слабоактивны в тесте Канагава и не проявляли активности по отношению к эритроцитам кур в объемной реакции гемолиза. По предположению японских исследователей, этот факт объясняется существованием неуреазного фактора, ассоциированного с низким уровнем продукции гемолизинов у штаммов, обладающих одновременно генами tdh и trh [Nakaguchi Y. et al., 2003].
Для выявления оптимальных условий продукции TRH парагемолитические вибрионы инкубировали в течение 4, 20 и 48 часов. Максимальная продукция гемолизина выявлена при культивировании в течение 20 часов. Кроме того, отмечено, что у штаммов, формирующих 2 типа колоний – «оптически плотные» и «прозрачные», гемолитическая активность по отношению к эритроцитам кур более выражена у «прозрачного» клона.
Цитотоксический эффект наблюдали только у двух из 11-ти изученных tdhrh+ штаммов, причем только у тех, которые продуцировали TRH in vitro в сравнительно высоком титре. Вибрионы, у которых на модели куриных эритроцитов не выявлена экспрессия trh-гена или отмечена слабая продукция этого гемолизина не проявляли цитотоксической активности. Trh-зависимая цитотоксичность отмечена на культурах тканей Hela, McCoy и L-929, т.е. все взятые в опыт клеточные линии были чувствительны к этому гемолизину.
Таким образом, в результате проведенного исследования сформирована и охарактеризована рабочая коллекция уреазопозитивных штаммов V. parahaemolyticus, представленная tdhrh+ и tdh+trh+ группами вибрионов. Показано, что in vitro TRH продуцируют отдельные представители только первой группы, у которых выявлена гемолитическая и цитотоксическая активности. Подобраны оптимальные условия экспресии гена trh. Определен штамм V. parahaemolyticus КМ-228 (293), обладающий высокой гемолитической активностью, обусловленной гемолизином TRH, который может быть рекомендован в качестве штамма-продуцента TDH-подобного гемолизина TRH (акты внедрения ФГКУЗ Противочумная станция Республики Крым Роспотребнадзора от 27.12.2015 г. и ФКУЗ Причерноморская противочумная станция Роспотребнадзора от 26.01.2016 г.).
На сегодняшний день нам удалось идентифицировать в полногеномных сиквенсах и собрать полные последовательности областей trh-nik-ure (рисунок 9) двух клинических штаммов V. parahaemolyticus из нашей коллекции – 16763 (Керчь, 1977) и 16976 (Бердянск, 1984). Они депонированы соответственно.
Сравнительный биоинформационный анализ показал, что гены trh обоих штаммов относятся к аллелю trh2. Данный вывод был сделан на основе их гомологии по отношению к референсным последовательностям trh1 штамма AQ4037 (АВ112353) и trh2 штамма АТ4 (М88112). Так, ген trh штамма 16763 был гомологичен trh1 на 84,6%, и trh2 на 98,4%. Ген trh штамма 16976 был гомологичен trh1 AQ4037 на 84,0%, и trh2 АТ4 на 99,3%. Промоторная область обоих секвенированных нами генов была на 98,6% гомологична промоторной области референсной последовательности trh2 и на 87,5% таковой trh1. Единственная нуклеотидная замена в промоторной области trh2 изученных нами штаммов (Т у референсного штамма заменен на С у V. parahaemolyticus 16763 и V. parahaemolyticus 16976) расположена между регионами -35 и -10 (рисунок 10).
Нуклеотидные последовательности промоторной и кодирующей частей генов trh1 и trh2, принадлежащих штаммам V. paraharmolyticus 16763, 16976, AT4 и AQ4037 AlignX-анализ продуктов двух генов trh показал, что аминокислотная последовательность TRH2 V. parahaemolyticus 16763 совпадает с таковой штамма 16976 на 97,4%. Разница заключается в пяти аминокислотах, расположенных в позициях 67 (Asn/Thr), 73 (Tyr/Asn), 113 (Asp/His), 115 (Ile/Thr), 183 (Gly/Asp) соответственно. В свою очередь, аминокислотный состав TRH2 V. parahaemolyticus 16763 и TRH2 V. parahaemolyticus 16976 соответствует референсному TRH1 на 85,2% и 84,1%, а референсному TRH2 на 100% и 97,4% соответственно, что подтверждает принадлежность обоих белков к типу TRH2.
Ранее [Kishishita М. et al., 1992; Park K. S. et al., 2000] было показано, что штаммам V. parahaemolyticus, обладающим геном trh1, свойственна более высокая продукция TRH, чем таковым, несущим в своем составе ген trh2, что связано, по-видимому, с различиями в структуре промоторов [Nakaguchi Y. et al., 2005]. Данные по гемолитической активности исследованных нами штаммов совпадают с данными названных авторов – оба штамма обладали низкой активностью по отношению к эритроцитам кур. Оба штамма содержали также сцепленный с trh [Iida T. et al., 1997; Osawa R. et al., 1996] полный ure-кластер, влючающий 16 открытых рамок считывания (ORF), из которых восемь генов (ureABCDEFGR) относятся непосредственно к синтезу уреазы, а 5 генов кодируют систему, обеспечивающую транспорт никеля через клеточную мембрану. Оба штамма обладали высокой уреазной активностью, которая определялась по способности ферментировать мочевину на среде Кристенсена.
По сравнению друг с другом и представленным в GenBank trh-nik-ure кластером штамма TH3996 (AB038238) отдельные гены указанной области содержали различные нуклеотидные замены, что, по-видимому, не повлияло на уреазную активность штаммов.
В настоящее время известно, что trh-nik-ure кластер является частью острова патогенности, обозначаемого как thr-PAI [Okada N. et al., 2009]. Помимо этих генов он включает кластер системы секреции третьего типа T3SS2. Его почти полная последовательность была определена только у того же штамма TH3996 (AB455531). С помощью использованных методов секвенирования и сборки нам не удалось целиком собрать весь остров, однако многие из генов T3SS2 были выявлены в разных контигах. Это позволяет предполагать наличие интактного кластера T3SS2 у изученных нами штаммов, однако вопрос об их способности экспрессировать данную систему секреции требует отдельного исследования.