Введение к работе
Актуальность теми. Актуальность данной темы обусловлена тем, что инфекционные заболевания сохраняют лидирующие места в структуре заболеваемости, и смертности как в мире, так и в РФ. Это делает специфическую активную профилактику инфекционных заболеваний задачей первостепенной важности. Среди перспективных вакцин наибольшее внимание привлекают мультивалентные генно-инженерные векторные вакцины, на основе аттенуированных микроорганизмов-переносчиков гетерогенных антигенов. Получение подобных вакцин осуществляется с помощью методов генной инженерии и выражается в создании системы вектор-хозяин, способной экспрессировать ряд чужеродных протективных антигенов и осуществлять их доставку в различные эффекторные органы иммунной системы. Общепризнанными и наиболее распространенными носителями, для создания таких вакцин, являются аттенуированные штаммы бактерий рода Salmonella, семейства Enterobacteriacea, обладающие рядом определенных преимуществ перед другими видами микроорганизмов.
Кроме того, аттенуированные штаммы сальмонелл могут непосредственно использоваться для профилактики сальмонеллеза животных, что достоверно снижает заболеваемость сальмонеллезом среди людей, так как животные являются основным источником возбудителей этой инфекции. Садьмонеллез представляет, на сегодняшний день, одну из актуальных проблем современной медицины и ветеринарии, являясь одним из самых распространенных аооантропонозов в развитых странах.
Существует большое равнооборазие как мутаций, приводящих к аттенуации сальмонелл, так и способов их получения. Однако, жесткие требования предъявляемые к векторным вакцинным штаммам резко сужают круг мутаций пригодных для использования. Одним из новых важных требований появившихся с развитием молекулярной биологии стала генетическая характеристика полученных мутаций.
Мутации в цАМ-регуляторной системе соответствуют этим требованиям. Суа и сгр мутации являются двумя независимыми мутациями, находящимися на достаточно большом расстоянии на генетической карте, что исключает возможность их перекрывания вторичными мутациями; мутационные повреждения в генах суа и сгр у сальмонелл приводят к снижению вирулентности бактерий без снижения их имму-ногенных свойств и способности приживаться в макроорганизме, что особенно важно для векторного штамма; подобные мутанты демонстрируют хороший протективный эффект на моделях животных и добровольцах. В связи с этим создание специальных донорных штаммов сальмонелл, несущих детерминированные делеционные суа и сгр мутации, является актуальным для получения методами генетической рекомбинации широкого набора аттенуированных мутантов сальмонелл различных сероваров. Это позволит исключить использование химического и транспозонного мутагенеза, которые применялись для этих целей и приводили к появлению вторичных мутаций и нестабильности генома.
Расшифровка нуклеотидных последовательностей мутаций в данных генах и использование молекулярно-биологических методов для идентификации этих мутаций позволят контролировать передачу данных мутаций при создании штаммов, проводить четкую дифференциацию мутантных вакцинных штаммов от штаммов дикого типа и других типов мутантов со схожим фенотипом, в частности мутантов по генам фос-фотрансферной системы.
Цель настоящего иследования: Получить штамм-донор бсгр-мута-ции серовара S.typhimurium с системой молекулярно-биологической идентификации мутации на основе ПЦР. Отработать оптимальную методику передачи сгр-мутации с использованием трансдукции в штаммы с генотипом суа.
- з -Основные задачи исследования:
-
Получить штамм-донор сгр-мутации.
-
Охарактеризовать сгр-мутацию полученного штамма.
-
Разработать систему идентификации сгр-мутации на основе ЩР.
-
Отработать методику передачи охарактеризованной 5сгр-мутации с использованием трансдукции в штаммы Salmonella spp. с генотипом суа.
-
Получить двойной суа,сгр-мутант S.typhimurium, и изучить его биологические свойства.
Научная новизна: Работа носит приоритетный характер, так как в ней впервые в мире разработана тест-система на основе ЩР для молекулярно-биологической идентификации аттенуирующей бсгр-мута-ции у сальмонелл.
Практическая значимость:
-
Получен штамм S.typhimurium B-5S, с охарактеризованной бсгр мутацией, пригодный для использования в качестве донора этой мутации при получении двойных суа,сгр-мутантов, а также сгр-мутантов других сероваров сальмонелл.
-
Разработана тест-система на основе ЩР позволяющая контролировать результат передачи вышеозначенной мутации, а также осуществлять мониторинг штаммов, несущих подобную мутацию при их использовании в полевых условиях.
-
Материалы диссертации предполагается использовать при чтении лекций по генетике микроорганизмов на кафедре микробиологии ММА им. И.М.Сеченова.
Апробация материалов диссертации: Материалы диссертации были представлены:
На 7 съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва-1997г.
На 8 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и
- 4 -инфекционным заболеваниям. Лозанна-май, 1997г.
По теме диссертации опубликовано 3 статьи и Z тезисов в отечественной и зарубежной печати.
Апробация диссертации была проведена на научной конференции кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова 26.06.1997г.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав обзора литературы, главы материалов и методов, двух глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 28 отечественных и 121 иностранную работу. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и ил-люстррована 7 таблицами, 5 рисунками и 11 фотографиями.