Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема научно обоснованной охраны природной среды в настоящее время признана одной из наиболее актуальных для человечества [Алпатьев А.И., 1983; Лекявичус Р. К., 1983]. Чтобы оградить биосферу и человека от отрицательного влияния различных химических соединений» необходимо изучение их свойств и воздействия на биологические системы. Ряд химических соединений способны взаимодействовать с молекулами ЛИК. вызывая изменения в ее структуре и, как следствие, влияя на точность механизма передачи информации. Генетические изменения являются причиной значительной доли заболеваний, однако, до сих пор не ясно, в какой мере присутствующие в окружающей среде химические вещества обуславливают возникновение наследственных заболеваний. Актуальной задачей при решении данной проблемы в целом является скрининг химических веществ, вызывающих мутагенный, как наиболее опасный для генофонда видов, и канцерогенный эффекты [Поликарпов Г.Г., Цуцугина В.Г.,1985; Турусов B.C., Парфенов
Ю.Д., 1986; Fieehbein L., Flamm W.G., Falk H.L., 1970].
В сложившихся условиях первостепенной задачей является создание и совершенствование экспресс-методов для тестирования вновь синтезируемых соединений с целью определения их биологического действия на живые организмы. В литературе описано более сотни тест-систем для исследования генотоксичности веществ в которых используют тест-объекты различного уровня биологической организации - от бактериофагов до млекопитающих [Абилев С.К..Порошенко Г.Г. 1986; Гигиенические критерии окружающей среды. Серия 51, 1989; Foriin
L., Andereson Т., Koivussari V., Haneaon Т., 1984].
Краткосрочные тесты с использованием бактерий в качестве индикаторов, для выявления мутагенного потенциала химических веществ согласно многочисленным исследованиям являются наиболее приемлимыми в настоящее время [Am»* B.N., Мс Cann Y., Yamasaki Є., 197Э; ДемаКОВ В.А.. КоЛОТОВ В.М., ЕрвМИНа А.А.,
1981. Фонштейн Л.М., Абилев С.К.. Бобринев Е.В.. 1985;].
Бактериальные тест-системы имеют ряд несомненных преимуществ по сравнению исследованиями на высших организмах: в одном
-2-тесте может быть изучена популяция состоящая из многих миллионов клеток с относительно коротким периодом размножения; возникшие нарушения в геноме бактерии проявляются фенотипически уже в следующем поколении; тесты относительно просты и доступны.
Другими, не менее эффективными тестами для исследования генотоксичности химических веществ, являются дрожжевые тест-системы. Следует отметить, что дрожжевым тестам присущи все перечисленные положительные качества бактериальных систем. Дрожки и грибы в отношении сложности генетического материала занимают промежуточное положение между бактериями и клетками млекопитающих. Биологическая организация дрожжевых клеток обнаруживает очень большое сходство с клетками высших организмов вследствие наличия дифференцированного ядра, содержащего ядрышко. Тесты с использованием дрожжей, таких как
S«ccharomyc«» eerevieiae, ПРИГОДНЫ ДЛЯ ВЫЯВЛ6НИЯ ШИРОКОГО
спектра генетических изменений.
Известно, что у бактерий и дрожжей отсутствуют некоторые ферменты, необходимые для метаболизма различных мутагенных и канцерогеных соединений, присущие высшим формам живых организмов. Поэтому микробные тест-системы должны быть дополнены необходимыми препаратами никросомальных ферментов млекопитающих или других высших организмов. При этом в тесте появляются возможность улавливать видовые особенности метаболизма исследуемых химических соединений. Кроме того, как правило, исследования проводят на нескольких тестерных штаммах, что обусловлено избирательностью действия химических соединений.
Паль и задачи. Основной целью данной работы была разработка подходов к оптимизации, а так же повышению чувствительности и воспроизводимости результатов бактериальных и дрожжевых тестов, используемых для оценки мутагенной активности химических веществ, посредством введения в систему очищенных раановидовых никросомальных Фракций. В связи с чем были сформулированы следующие задачи:
1. Получение очищенных препаратов микросом - биокомпонентов бактериальных тест-систем;
2.Исследование биотрансформирующей активности полученных препаратов в краткосрочных бактериальных и дрожжевых тестах:
3.Определение условий стабилизации микросомальных фракций, используемых в бактериальных и дрожжевых тест-системах;
4.Создание оптимальных режимов хранения полученных препаратов и определение сроков их пригодности для использования в микробиологических тестах.
Научная новизна. Впервые на бактериальных и дрожжевых тестах скринирования мутагенов дана сравнительная оценка биотрансформирующей активности разновидовых мембранных препаратов различной степени очистки, полученных из печени кур, крыс, плаценты человека, растений как между видами, так и с фракциями s-9, используемыми в классических вариантах бактериальных тестов. Проведено определение оптимальных условий стабилизации полученных мембранных препаратов. В результате исследований определены оптимальные сроки использования в краткосрочных бактериальных тестах полученных препаратов микросом; доказана адекватность применения метода сублимационного высушивания для их стабилизации. Результаты исследований позволяют рекомендовать новые подходы к усовершенствованию бактериальных тест-систем скрининга веществ на мутагенность.
Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований модифицировании бактериальные и джрожжевые тесты, используемые для определения мутагенной активности химических соединений, посредством изменения качественного состава биокоипонентов системы. Определены необходимые параметры получения высокоочищенных микросомальных препаратов, обладающих значительно большей биотрансформирующей активностью, чем у используемых в классических вариантах бактериальных и дрожжевых тестов. Даны рекомендации по стабилизации полученных фракций. На основе проведенных в микробных тест-системах исследований получены мембранные препараты, сохраняющие активность в течение 1-1,5 лет (период наблюдения). Применение указанных препаратов в бактериальных тестах позволит практическим лабораториям отказаться от необходимости содержания животных» сократить объем подготовительных работ, стандартизировать схемы проведения анализов» повысить воспроизводимость и достоверность
-4-результатов. Введение в тест-систему мембранных препаратов» обладающих значительно более высокой активностью по сравнению с s-9, позволит проводить выявление слабых и средних мутагенов окружающей среды. Результаты исследований внедрены в практику в лаборатории химического мутагенеза ИЭГМ; прошли испытание в НИИ онкологии им.Н.Н.Петрова г.Санкт-Петербург, Институте канцерогенеза РАМН г.Москва.
Апробация работы. Основные результаты исследований
доложены на:
-всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека" (Москва,1985); школе молодых ученых "Проблемы экологического мониторинга и научные основы охраны природы на Урале" (Свердловск,1985); на выездном заседании Секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" ГКНТ СМ СССР (Ордженикидэе, 1985); конференции молодых ученых "Экологические системы Урала" (Свердловск,1987), "Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов" (Уфа, 1987), конференции "Здоровье населения - критерий качества окружающей среды" (Пермь,1987); всесоюзном симпозиуме "Объем и методы генотоксической оценки побочных эффектов биологически активных веществ" (Ленинград,1989); региональной школе семинаре молодых ученых и специалистов "Актуальные проблемы экологии: Экологические системы в естественных и антропогенных условиях среды" (Уфа,1989); Международной конференции "Цитохром Р-450 - структура и функции. Биохимические и биофизические аспекты" (Москва,1991); Международном симпозиуме "Проблемы токсикологии и прикладной экологии" (Москва-Пермь.1991), Международном симпозиуме "Загрязнение окружающей среды, токсикология и эпидемиология" (Москва-Пермь, 1993).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 144 страницах машинописного текста, включая 15 таблиц и 5 рисунков. Список литературы содержит 267 наименований работ: 1Е1 на русском и 156 иностранных языках.