Введение к работе
Актуальность проблемы. Грямой пестицидный контроль на основнве сельскохозяйственные культуры в прошлом заключался, в значительной степени, в применении химических пестицидов. В настоящее время в связи с экологическими проблемами нарастает острая необходимость запрещения химических пестиципов. Это побуждает многих ученых к поиску альтернативного контроля за Фитопатогенами и «итоФагами. По мненио многих исследователей многообещающим в этом плане является биологический контроль К Stirling е.а., 1991; Spiegel е.з, /991
Большие потенциальные возможности имеет микробиологическое направление в защите растений, предусматривающее использование различных групп микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности для сдерживания массового гроявления возбудителей болезней пищевых и технических культур, уничтожения сорных растений и регуляции численности вредителей.
Литература изобилует описанием новых штаммов актиномидетов, грибов и бактерий - антагонистов вредных для растений организмов. В Институте микробиологии и вирусологии HAH РК также были проведены многолетние исследования по выделению и изучению культур микроорганизмов, перспективных для защиты растений, на основе'которых получены и испытаны в производственных условиях препарат триходермун, антибиотики 1618-306, А-23/791 и др. iCefkeroe, 1981; Ку/шибаев, 1974; Тулеьиссеа, 196$.
Анализируя большой Фактический материал по проблемам защиты растений, следует отметить, что в целом, в последние десятилетия, биологическая защита растений успешно наращивала теоретический потенциал и разработала формы его практичеаого применения. При этом пристального внимания исследователей и гроизводственников привлекают две проблемы:
-
потенциальные возможности биометода ещё далеко не'исчерпаны;
-
в растениеводстве применяется довольно ограниченный круг (їиспоепзратов.
Народу с этими вопросами нельзя не указать на то, что практически нет
эффективных средств биологического регулирования численности ряда
экономически важных групп вредителей (Фитснематод, сосущих членистоногих открытого грунта, саранчовых и др.). Неоправдан) мало внимания уделяется проблеме биологической борьба с сорными растениями.
Таким образом, существует настоятельная необходимость расширения работ по биологической борьбе с Фитогвтогенами и Фитофагами. Успех может быть обеспечен прежде всего на пути выявления механизма взаимодействия в системе хозяин-патоген-биопрепарат.
В связи с этим несомненно актуальным, остается целенаправленный поиск, выделение и изучение различных культур микроорганизмов с новыми свойствами, продуцирующих антибиотики и другие биологически активные вещества.с множественным проявлением активности в отношении патогенов, на основе которых целесообразно создать Эффективные биопрепараты для осуществления биоконтроля за численностью Фитопатогенов и фитофзгов.
В процессе поиска культур микроорганизмов необходимо использовать новые принципы их выделения и отбора. Поэтому получение возможных продуцентов важно проводить из различных экологических ниш, в том числе разных по степени техногенных воздействий. В стратегии скрининга должен использоваться широкий набор тестов (патогенные микроорганизмы, вредители, различные сельскохозяйственные, лекарственные и сорные культуры растений).
Более углубленные исследования по биологическому контролю требуют разработки новой модели, которая позволит изучить аспекты взаимодействия клетки растения-патогена-биопрепарата с целью обеспечения его высокой Эффективности при значительном снижение норм расхода и оценки перспектив практического использования.
Поэтому, возникает необходимость обобщения всех полученных результатов по панной проблеме с учетом рациональных подходов к отбору культур микроорганизмов с высокой биологической активностью и использованием широкого набора тест-организмов, получению новых сведений об известных и опробированных продуцентах и их метаболитах, созданию эффективных ресурсосберегающих технологий получения биопрепаратов и
Фактическому применению их в защите растений и хранении продукции.
Цель исследования - изыскание высокоактивных культур мифофганизмов-продуцентсе биологически активных веществ комплексного действия на возбудителей болезней и вредителей и создание на их основе экологически безопасных биопрепаратов для регулирования и ограничения численности Фитопатсгенов и фитофзгоз.
В задачу исследования входило:
поиск новых высокоэффективных культур микроорганизмов в различных экологических нишах и оцен<а их биологической активности при использовании широкого набора тестов;
получение из вторичных колоний грибов рода Триходерма стабильных зспорогенных вариантов и изучение их структурных и метаболических особенностей;
разработка технологии получения и применения биопрепаратов на основе новых высокоактивных штаммов грибов, актиномицетов и бактерий;
изучение механизмов взаимодействия в системе растение-Фитопатоген-биопрепарат и исслецовгние возможности использования для этой цели в качестве модели культуры клеток растений.
Научная новизна. Впервые у гриббв рода Триходерма получен аспарогенный устойчивый вариант, .синтезирующий биологически активные вещества, отличающиеся по своему компонентному составу от таковых у исходного варианта Э их составе впервые выделена вещества, по химической структуре близкие к полиенам, а также вещества ростовой природы типа гетероауксина. Показаны большие потенциальные возможности гриба рода Триходерма. Выявлен имрокий спектр их действия с использованием большого набора тест-патогенов, некоторые из которых в Казахстане выделены впервые {Fusarium oxysporum - среда патогенов облепихи*, Geotrtcbum candid и т и Thiehviopsis basicola - патогены кзртофєля в Казахстане обнаружены впервые). Наряду с лечебным зффєктом препарата триходермина (эффективность 80-85%), отмечено усиленное Формирование корневой системы облепихи, „вторичный" прі4рост и появление боковых побегов уже на первом
году развития. Среди стрептомицетов обнаружен новый продуцент антибиотика типа циклогексимипз ( стеалсин ) Streptomyces ahygroscopicus И847, обладающий высокой антибиотической активностью против головнёвых заболеваний зерновых (пшеницы, ячменя, овса и проса).
Впервые описана и охарактеризованы три новых антрациклина: -1-гидроксисульшурмицинон, *f-1-гидроксисульФурмицинон и|-1 -гидроксиаура-мицинон, входящих в состав агликонов антибиотического комплекса 1618-306, а также выявлено инсектицидное действие антрациклинового антибиотика 1618-306 (А.С. Ь& 162.1211). Показана Эффективность бактериальных препаратов (ХПА и ВСП) против тепличной белокрылки. Отобраны культуры перспективные для ограничения численности колорадского жука и борьбы с карантинным растением - повиликой.
Экспериментально 'показана и практически подтверждена необходимость -поиска новых высокоактивных культур микроорганизмов, способных осуществлять биоконтроль численности витопатогенов и ' фитофэгов в различных экологических нишах.
Впервые проведена оценка степени загрязнения почв Жезкаэганского горно-металлургического комбината тяжёлыми металлами и чувствительности к ним различных групп микроорганизмов. Из их числа отобраны культуры с высокой устойчивостью к тяжелым металлам и антагонистической активностью в отношении Фитопатогенов. Высокой биологической активностью обладают микроорганизмы, выделенные из термальных источников южного Казахстана.
Впервые показана возможность использования культуры ткани растений в качестве модели для изучения механизма взаимодействия в системе: растение-Фитопатоген-биопрепарат ( на примере суспензионной культуры пшеницы и её патогена - гриба Helmiathosporium). Методом электронно-микроскопических исследований впервые установлен механизм действия культуры Bacillus subtllis, составляющей биопрепарата бациФига, на мучнисто-росяной гриб Sphaerotbeca fuses, паразитирующий на листьях тепличного огурца.
Практическая значимость. Создан новый экологич'ески чистый биопрепарат нэ основе вторичной аспорогенной культуры гриба Триходерма,
Эффективный в защите растений при использовании его биологически активных метаболитов. Рекомендуются обработка семян растений < стимулирующий и лечебный эФоект) и внесете в почву спорового препарата перед посевом для её оздоровления.
Показана целесообразность применения препарата триходермина для борьбы с болезнями облепихи, с грибными и бактериальными поражениями клубней картофеля при хранении, с возбудителями корневых гнилей бахчевых культур (дыни, арбузы, семечковые арбузы), перца, хлопка и сахарной свекла в условиях разных регионов, с галловыми нематодами и повиликой, с зльтернариозом пшеницы. Выявленная зффєктивность антибиотика стеалсина против головневых заболеваний зерновых позволяет предложить его для широкого использования в практике сельского хозяйства в качестве протравителя. Антибиотический комплекс 1610-306, обладая сочетанным действием, является перспективным препаратом для растениеводства. Отработаны оптимальные дозы его применения. Штаммы бактерий ХЛА и ВСП, обладающие вирулентностью в отношении вредителей овощных растений, рекомендуются к применению для ограничения численности капустной совки и белянки, тепличной белокрылки и колорадского жука.
Дальнейшее изучение отобранных активных штаммов микроорганизмов и получение на их основе эффективных препаратов позволит создать систему применения микробиологического метода для регулирования численности Фитопатогенов и фитофзгов в различных регионах, в том числе в зонах экологического бедствия.
Положения, выносимые на защиту.
Система поиска, выделения и изучения высокоактивных культур микроорганизмов, с использованием широкого набора тест-организмов для создания на их основе биопрепаратов комплексного воздействия на Фитопатогены и ФитоФаги.
Технология получения и использования про- и эукзриотных микроорганизмов и их метаболитов в качестве Эффективных препаратов для регулировз-іия и ограничения численности вредных для растения организмов.
Возможность использования культуры клеток высших растений в качестве модели их взаимодействия с микроорганизмами-возбудителями болезней и біопрепаратом.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VI и VII съездах ВМО ( Рига, 1980; Алма-Ата, 1985), международных симпозиумах ( Чехословакия, 1989; Москва, 1990; Пущино, 1991; Москва, 1992; Степногорск,1995), всесоюзных конференциях и семинарах (Оболенск, 1986; Ташкент, 1988; Кишинев, 1988; Велигож, 1989; Алма-Ата, 1989; Москва, 1989; Ташкент, 1989; Алма-Ата, 1991; Степногорск, 1991), республиканских конференциях (Алма-Ата, 1993; Караганда, 1993; Кокшетау, 1994).
Публикации. Основные материалы диссертации отражены в 50 печатных работах, 1 монографии и 1 авторском свидетельстве.
'Структура и объем диссертационной работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, состоящего из 2 глав, и 5 глав, посвященных изложению результатов собственных исследований, заключения, выводов и сгмска цитируемой литературы (&?195 зарубежных авторов). Диссертация изложена на 419 страницах машинописного текста, содержит 78 таблщ и 66 рисунков, Приложение.
В работе использовали ку/ътуры ми<роорганизмов:
грибы рода Trtchoderma. производственные штаммы (2), музейные культуры (17), и штаммы, выделенные из различных субстратов (16);
актиномицеты рода Streptomyces (44), бактериальные (240) и грибные культуры (63) из коллекции лаборатории мифобиологической защиты растений ИМиВ HAH РК;
культуры грибов, актиномицетов и бактерій, выделенных из различных экологических ниш в процессе исследований (всего 953 штамма).
При изучении биологической активности микроорганизмов в качестве тест-объектов использовали 62 культуры Фитслатогенных грибсв и бактерий (среди \т представители родов: Егяіаія, Bacillus, Fusarium,
Althcraaria, Helminthosporum, Dotrytis, Trichothcclnm,
Rhizoctonia, Trichoderma , Spbaerothcca, Cladosporum, Phytophtora, Ustilago, Tllleta, Sphacelotheca, Verticillium, Phoma), 23 вида растений и 5 видов вредителей сельскохозяйственных культур (особи различных возрастов).
Отбор дифференцированных вариантов из грибов рода Триходерма провопили на среде с зрабинозой Шяитннэ, 1975).
Морфологические изменения культур микроорганизмов наблюдали в нативном состоянии в световом микроскопе .Palyrar" с применением интерференционного контраста по Номэрскшу (как и далее в работе).
Антагонистические свойства проверяли методом агаровых блоков и лунок {Егоров, 1986> и встречных колоний {.Рудзхсв, 197fi.
Изучение стомудіруюш.их свойств проводили на тест-растениях. Семена проращивались на среде Ковровцева по ГОСТ І2038-Б4.
Целлюлозолитическую активность определяли чашечным методом.
Компонентный состав биологически активных веществ анализировали методом тонкослойной хроматографии на закрепленных слоях силикогеля (SiluM-254, ЧССР) в различшх системах растворителей. Зона обнаруживали в виде поглощагоших под УФ-светом пятен и после окрашивания реактивом ДрайгендорФа и Ван-Урка. Антибиотики определяли биоавтогрзФически, Спектры поглощения определяли на спектрофотометре .SpccorcF. Шункциональные группы выявляли ИК-спектроскопией VSpecord 75-IR").
Определение гетероауксина проводили хроматограФическим методом {Новикова, Цртуганова, /966.
Для электронно-микроскопических исследований ( как и далее в работе) материал Фиксировали в 3% растворе глутарового альдегида с последующей доФиксацией \% раствором осмиевой кислоты и 2% водным раствором перманганата калия. Срезы готовили на ультратоме „Rcicherf, окрашивали цитратом свинца (Regno/ds, t961 в течение 2 минут. Съемку проводили .под электронным микроскопом JEM-J00
Патогенов облепихи выделяли по методике Н.Г.Салэтовой с соавторами 0974).
При идентификации грибов использовали определители В.И. Билай , 1955, 1977;В.И. Ьилай, ЗА Курбацхой, 1990; А.А. нчшского, 1917; СА Ванина с соазт., 1950, Н.И. Василевского, Б Л. Каракулша, 1950; СР. Шварцман с соавг., 1964, 1977; З.М. Бызовой с созвт., 1967-1970; М А Литвинова, 1967; W.Migula., 1934; К.В. Raper , Ch. Thorn, 1949; PA Saccardo , 1884,1886,1866, 1891,1892, 1906,1913,1931.
Опытно-производственные испытания триходєрмина проводиш в НПО „Облепиха" Увс-Нурского аймака МНР на черенках облепихи, вьращиваемых в парниках. Получешыэ результаты подвергались математической обработке с применением критерия Стьюпента-Фишера ІЛакин, /99a. Результаты статистически обработаны на ЭВМ .Искра-1256" Патогены картошеля выделяли с клубней сортов „Невский", „Шортаидинский", „Голландский", пораженных в процессе хранения, общепринятыми микробиологическими методами. Для идентификации патогенных культур использовали соответствующее определители (Хохряков и др., I960; Би/тай и др., 1988; Птопличоо, 1977>.
Для сравнительной оценки различных химических протравителей и биологического препарата триходермин на патогенез альтернариоза у бело- и чераозародышееых семян пшеницы проведены мелкоделяночные опыты в поле Испытание нематоцидной активности препарата триходермина проводилось в вегетационных сосудах в условиях теплицы.
.Оптимизацию синтеза антибиотика стеалсина (шт.11874) проводили по схеме планирования 7 Факторов на трех уровнях (Кузнецова и др., /968. Эффективность действия антибиотио стеалсина изучали в полевых опытах в условиях северного (НИИ зернового хозяйства КАСХН) и южного (КИЗ КАСХН) регионов Республики. Биоматериалом для инокуляции семян служили популяции спор каждого возбудителя, включающие распространенные в зоне расы пыльной головни пшеницы, пыльной головни ячменя, твердой головни ячменя, пыльной головня овса, обькнсвенной головни проса В течение вегетационного периода проводили Фенологические каблопения и структурный анализ растений.
При выявлении инсектицидной активности 'антибиотик 1618-306 гт-і'-'еняли в концентрациях 1; 0,1 и 0.01 с использованием особей воеімтєлгй
различных возрастов. Антивирусная, мутагенная, антимутагенная и комутагенная активность антибиотиков проверялась совместно с сотрудниками лаборатории генетики вирусов ИМиВ АН Каз.ССР, согласно методическим указаниям КАшмзріїн, Воробьева, 1952; Колотое, 1982). Изучение канцерогенности проводилось совместно с сотрудниками лаборатории антибиотиков с использованием новой грибной тест-системы F.buibigeanm (Кзршэвидр., I98&.
При изучении компонентного состава антибиотического комплекса 1618-306 использовали колоночную хроматографию < Brocmann e.g., /959), .препаративную ТСХ и аналитическую ВЭЖХ {Di/pont, США) с различными системами растворителей. Снимали спектры ПИР IBrvkerLH-J60). Масс-спектры (MAT-J//A и МАТ~1!2 (Varian, FRg)J, ИК- спектры {спехтррфотомгтр 5Р //00, Pye Unlearn, Вл-шофит-зниА, УФ-спектры {і/І/5260, Beckman, Австрия, КД-спектры (Gcbfn rvon III, фэан&еЬ. Работа выполнялась во Всесоюзном научно-исследовательском институте по изысканию новых антибиотиков РАИН (г.Москва).
В работе по изучению знтомопатогенной активности бактериальных культур идентификацию проводили по опрепелителям В.И.Полтевой (1969); Д. Берги (1980); В.В.Гулий и Т.В.Тепляковой (1981). Энтомопатогенные свойства выявляли.на тест-организмах - вредителях сельскохозяйственных растений: тепличной белокрилке, капустной белянке, капустной совке и колорадском жуке в лабораторных и полевых условиях.
Объектами микробиологического мониторинга явились почвы территории, примыкающей к предприятиям Жезказганского горно-металлургического комбжата. Количество тяжелых металлов определяли методом спектрального анализа на базе Института геологических наук HAH. РК. Выделение микроорганизмов проводили по методу Н.А.Красильникоэа (1987). Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили в 'соответствии с Manual of Sistematic Bacteriology {A'rfeg, Holt', 1974; Гаузе и др., /9ВЛ Математическая обработка данных пров'одилась' на компьютере типа IBM пакетом специализированных программ.
Обследование термальных источников Юнмого Казахстана проводились
совместно с Институтом гидрогеологии и геоФизіжи АН КазССР. Выделение, изучение культурал»юН5иохимических особенностей облигатно-термоФильных вактерий, актиномицетов и грибов проводились согласно методике, разработанной в лаборатории физиологии и биохимии термофильных микроорганизмов Института микробиологии Afl СССР (.Логинова, Берховцева, /963; Лоппова и др., /966/ Егорова идр., 1973; Логнюва и др, 1975).
Систематическое положение выделенных микроорганизмов определяли по D.Beigey (1974) и ряду других работ ( /фасилтков, 1949, Ferrari, 1956; Allen, 1959; Emoto, 1962; Remalcy, Hixcon, 1970; Oclrima, Imahori, 1974; Агре и др., /972; Косшч$в, 1956;/фасиътсов и др., 1971; Smith ел., /952; Бешр, /963; /Щюкхо, 1953; Логинова и др., 1966; Лигчтов, I967i.
Для исследования взаимодействия в системе растение-Фитопатоген-биопрепарат использовали каллусную ткань и суспензионную культуру, полученную из зародыша пшеницы сорта .краснодарская-23" и листовой пластинки картофеля сорта „Невский; патогенный гриб llelmiutosporulm и антибиотики 1618-306и А-23/791.
Для электронно-микроскопического изучения влияния биопрепарата бациФита на мучнисто-росянные грибы огурцов материал Фиксировали на 2-е -7-е-сутки после обработки препаратом.