Введение к работе
Актуальность проблемы. Изыскание путей и способов борьбы іумпой инфекцией по-прежнему остается актуальной проблемой, иешное решение которой неразрывно связано с исследованием нетического аппарата н антигенных своіїств чумного кроба,изменяющихся в природных условиях, в организме ;пернменталышх животных и п процессе культивирования І-1.И. Жуков-Вережннков,1940; 1].В.Домарадскни,1967; В.И. ннблат, (974; П.И.Анпспмов, 1990; Л.В. Самойлова, (990; С.А. бедева с соавт.,1993; О.В. Шеремет, 1994; И.А. Дятлов, А.Ф. [ілнпнов,1994/, а также ензучепиемтопких клеточных механизмов алнзащш естественного н приобретенного противочумного иммунитета Е.И.Коробкова, 1960; Г.Г. Коробков, 1967; И.В. Олькова,1974; .М.Исин,1985; Е.И. Тихомирова, 1989; Г.И. Васильева, 1990; В.Исуповссоавт., 1990; Л.С.Назарова ссоавт., 1990; Н.Ю.Стукова, 91; М.Ю.Ледванов, 1993/.
В последние годы нарастающий поток сообщении о неоднородности ктерпальных популяций по состоянию генетического аппарата одержанню ДНК на клетку от 1 до 4 н более полных хромосом), овнго продукции на клетку суммарного белка и специфических верхностных антигенов, а также о зависимости степени этой однородности от стадн» роста культуры и вирулентности тогенных микроорганизмов /И.В. Steenetal., 1980,1982; Е. Воуе а!., 1983; R.L. Tyndall et al., 1985; А.P. Phillips,K.L. Martin, 87; О.А. Адамов, А.Л. Кравцов с соавт., 1995/, заставляет думаться о необходимости и практической значимости количественного нтроля за содержанием биологически активных веществ в ктериях Y. pestis на дифференциальном уровне - по большой іборке отдельных клеточных элементов.
На функциональной гетерогенности основываются также временные представления о роли различных типов клеток иммунной стемыпрнчумеи других инфекциях, ответственных за реализацию ецифическнх / В.М.Земсков,1989; Г.И. Васильева, 1990; А.В аумов с соавт.,(992; М.Ю. Ледваиов, 1993/и неспецнфнческнх D.A. Bassetal., 1983; C-F. Bassoeetal.,1984/ механизмов защиты, гемотря на противоречивость взглядов относительно причин
функциональной неоднородности ііопуллциіібактерігії и клеток иммуіпіо системы макрооргани.чма, в настоящее время общепризнана актуальность песледоиапиіі, направленных па изучение процессе клеточного взаимодействия с учетом этого явления, так как усреднение результатов анализа может привести к потере информации и к ошибочным выподам /11.S Krulli, 1982; М. Lepoivn al.,1986; Г.И. Васильева, 1990/.
Для изучения гетерогенных клеточных взвесей применяю фракционирование их на субпопуляции с помощью различны препаративных методов. Однако, чтобы избежать больших клеточиы потерь, достигающих иногда до 50 % исходного суммарного пула, также недостаточно изученных сдвигов в клеточных параметрах па влиянием препаративных процедур, исследователи все чаще отдак предпочтение альтернативным цитологическим методам контроля г функциональными параметрами фенотипически неоднородны клеточных популяций, основанным на принципе импульсно проточной цитометрнн биологически активных внутриклеточны веществ /M.R. Loken, 1980; W.R. Abrams et al., 1983; C-F. Basse et al., 1984; K.A. Muirhead et al., 1985; E. Engh et al., 1992/.
Эта качественно новая технология клеточного анализ: позволяющая быстро получать, рассчитывать и сравнивать профпл статистических распределении десятков тысяч отдельных клеток г самым различным биохимическим и морфологическим показателям на протяжен ни 30 лет специально создавалась для изучения процессе клеточного взаимодействия in vivo и in vitro на субпопуляциошюі уровне. Результаты многочисленных испытаний проточной микр< флуориметрни при контроле за иммунным статусом пациентов в процессе ішднвидз'альной терапии гемобластозов и онкологически заболеваний, а также при нх дифференциальной диагностике прогнозировании, доказали более высокую (інформативності достоверность и производительность этой технологии по сравнена. с субъективными морфологическими и усредненными биохимическим методами исследования /O.D. Laerum, Т. Farsund, 1981; Н. Kruth.1982; В.Л. Исаков с соавт., 1988/.
В 80-х годах, с внедрением импульсной проточной цитометри в микробиологию и инфекционную иммунологию, открылись новь горизонты для дальнейшего совершенствования лабораторне диагностики, иммунопрофилактики и лечения инфекцнонны
заболеваний Е. Boye et al., 1983; K.A. Muirhea(l,1985/. В части сісти, к общепризнанным уникальным возможностям мнкрофлуори-метрнческого анализа относятся: самая быстрая детекция и специфическая идентификация микроорганизмов в крови и пробах из объектов внешней среды с порогом чувствительности (О3 м.к./мл /J.D.Mansonr et al., 1985/; контроль за процессом репликации ДНК и профилем распледеления бактерий но числу хромосом в оптически неплотных культурах для быстрой оценки чувствительности к антибиотикам без наращивания бактериальной массы /Н.В. Steenetal., 1982; O.V. Martinez et al., 1982/; дифференцирование вирулентных и авирулентных штаммов патогенных бактерий по долевому соотношению в стационарных культурах клеток с низким и высоким содержанием хромосом и специфических поверхностных антигенов /R.L. Tyndall et al., 1985/; обнаружение in vivo п in vitro зукарнотических клеток, зараженных внутриклеточными паразитами (бактернп и вирусы) с разрешающей способностью 5 % в суммарном пуле /J.Dunn et al., 1978; J.W. Whaun et al., 1983/, a также автоматический динамический контроль за показателями фагоцитарной реакции на субпоиуляционном уровне в культурах макрофагов/А.В. Филатове соавт., 1983; М. Lepoivre et al., 1986/ и лейкоцитов /D.A. Bass et al., 1983; C-F. Bassoe et al., 1984/.
Являясь в настоящее время одной нз самых информативных н перспективных технологий клеточного анализа /К. A. Muirhead et al.,1985; А.И.Полетаев с соавт., 1987; В.Л.Исаков с соавт.,1988 /, проточная микрофлуорпметрия не применялась для изучения бактерий Y. pestis, а также для исследования функциональных сдвигов в клетках иммунной системы вакцинированных и зараженных чумой лабораторных животных.
Цель работы: создание экспериментально-методической основы для контроля за функциональными сдвигами в неоднородных культурах бактерий Y.pestis и гетерогенных популяциях клеток иммунной системы инфицированного чумой макроорганизма на уровне больших выборок отдельных клеточных элементов.
Основные задачи исследования:
1. Провести комплексное исследование возможностей современных автоматических мнкрофлуорпметрнческих систем и цитологических методов контроля за физиологическим состоянием
іірокаріїотпчсских и зукариотпчсских клеток н феїіотпіінч гетерогенных популяциях.
2. Оптимизировать условия процесса измерения содержания Л суммарного белка и специфических поверхностных антигене бактериях Y. peslis, а также автоматической сортировки отдель клеток неоднородной бактериальной взвеси но этим параметр импульсном режиме анализа.
-
Исследовать и сравнить состояние генетического annaj клеток чумного микроба в оптически плотной стационарной куль* п в лаг-фазе роста бактериальной популяции. Установить хараї воздействия ингибнрующей дозы антибиотика стрептомицина процесс перераспределения отдельных бактерий по клеточном}' ци в оптически неплотных взвесях.
-
Разработать быстрый способ идентификации кле чумного микроба, основанный на принципе автоматической сортира гомологичных и гетерологичных микроорганизмов в потоке уровню интенсивности их иммунофлуоресценціш. Исследов возможность использования результатов количественіїї пммунофлуоресцентного налиэа для дифференцирования штамі возбудителя чумы с различными плазмидными профилями.
-
Установить долевое распределение перитонеальных макрофа в организме ннтактных морских свинок по фазам клеточного цик Оптимизировать условия детекции ДНК бактерий Y.pestis внут активных макрофагов п разработать способ проточно-ціг флуориметрнческого мониторинга за уровнем содержания ДН1< инфицированных чумой фагоцитах для контроля за характерол исходом фагоцитарной реакции в условиях in vitro.
-
Разработать способ контроля за уровнем пролиферативн активности лейкоцитов в крови и органах нммушюіі енстеї инфицированных чумой лабораторных животных, основанный определении относительного количества клеток гетерогенного пу на стадиях синтеза ДНК, иредмитоза и митоза. Исследовать сравнить сдвиги по этому показателю при чумном вакцинальном остром инфекционном процессах.
-
Провести на уровне отдельных клеток и их субпопуляци в одинаковых условиях измерения, сравнительное псследовапі состояния лизосомалыюго аппарата лейкоцитов в цельной крої людей, некоторых видов чувствительных к чуме грызунов
нечувствительных к заражению чумой крупных млекопитающих (собак н лошадей).
8. Изучить сдвиги в цптофлуорпметрпческнх показателях активности хроматина и лизосомальноіі системы лейкоцитов крови 3'лабораторных животных, иммунизированных штаммами Y. pestis, отличающимися по плазмндному составу и уровню нммуногенностн.
Научная новизна. Впервые с использованием проточно-цнтофлуориметрического измерения относительного содержания ДНК в отдельных бактериях Y.pestis установлена возможность контроля за перераспределением их по клеточному циклу в процессе культивирования, за степенью неоднородности популяции клеток чумного микроба по состоянию генетического аппарата отдельных клеточных элементов. Обнаружено, что при отсутствии в среде антибиотика стрептомицина, ннгибнруюіцего процесс размножения клеток вакцинного штамма ЕВ, з'ровень содержания ДНК в подавляющей доле бактерий Y. pestis (не менее 50 %) увеличивается в 2-4 раза в интервале времени от 3 до б ч - до перехода кз'льтуры из стационарной в быструю экспоненциальную фазу роста. К 6 ч культивирования в оптически неплотных бактериальных взвесях зарегистрировано появление клеток с повышенным содержанием суммарного белка и специфических поверхностых антигенов, детерминируемых плазмндой pFra чумного микроба.
Впервые разработан быстрый способ идентификации клеток Y. pestis и их дифференциальной диагностики от близкородственных бактерий псевдотз'беркз'леза, основанный на измерении интенсивности нммунофлуоресценции и на автоматической сортировке десятков тысяч отдельных бактерий по этому параметру не на 4 субъективных З'ровня (от «+» до «+-Н-+» при люминесцентной микроскопии), а на 512 одинаковых количественных з'ровней интенсивности свечения (каналов амплнтз'Дного анализатора импз'льсов). Установлено, что сравнительный анализ профилен статистических распределений отдельных клеток чумного микроба по содержанию специфических поверхностных антигенов до и после 6 ч подращивания при 37С позволяет дифференцировать штаммы нзогенной системы, лишенные р Fran/либо pPst, от полноценного но плазмндному составу вакцинного штамма ЕВ.
Вперш.іе в піім і ах с ііеріпонсалі.пьімн макрофага!1 культивируемыми in vitro с чумным микробом, оптпмнэиров? условия процесса измерения, позволяющие обнаруживать появлеї бактериальной ДНК в активных фагоцитах на фоне постоянн содержания ЛИК (2с) в неактивных диплоидных макрофаг Разработан способ мониторинга развития фагоцитоза ну идентификации нарастания поглощения микробов, их виутриклеточи переваривания, а также за счет автоматического днфференцнроваї фагоцитов с неповрежденными и поврежденными ядрами по урої интенсивности ДНК флуоресценции.
Установлено, что динамика изменении относительного ко чества ДНК в макрофагах в условиях in vivo и in vitro зави от вирулентности штамма чумного микроба.
Впервые разработан микрофлуориметрпческий метод контроля in v за уровнем активности процесса пролиферации иммунокомпетенти клеток у инфицированных чумой лабораторных животій учитывающий характер долевого распределения их в гетерогеш популяции на стадиях Gt/Go, S п G2+M клеточного цикла качестве показателя степени интенсивности процесса репродукі лейкоцитов в вакцинированном и зараженном чумой оргаииз уровня иммунологической реашруемости со стороны иммуш системы в ответ на антигенную стимуляцию, предложено использов сдвиги в относительном количестве ДНК-сннтезирующих и делящн: клеток (S+G2+M, в %). Установлено, что формированию нриобрет ного противочумного иммунитета у морских евнпок, иммунизирован и протектнвной дозой вакцинного штамма ЕВ чумного микро предшествуют умеренные сдвиги (1,5-2 раза) по этому показате в крови и органах иммунной системы, в отличие от резкого непрерывного повышения уровня пролнферативной активної нммунокомпетентных клеток (в 4-6 раз) у зараженных особе первые трое суток развития острого чумного инфекцношг процесса с летальным исходом на 3-5 сутки.
Впервые с использованием автоматического микрофлуо-риметрическ анализа проведено сравнительное исследование состояни лнзосомалыюго аппарата лейкоцитов крови людей, пяти ви; чувствительных к чуме грызунов, а также двух нечувствительны заражению чз'мой крупных млекопитающих.
У собак п лошадей, в отличие от человека и грызунов, об
ружепо две субпопуляции гранулоцнтои кропи с различным содержанием лнзосом на клетку - наличие очень высокой степени неоднородности по состоянию лизосомального аппарата в суммарном пуле лейкоцитов. 1\ля всех чз'вствительных к чуме лабораторных грызунов, кроме однородности суммарного пула фагоцитов но лпзосомальным свойствам, характерен дефицит лизосомальных гранул в фагоцитах крови по сравнению с людьми, собаками и лошадьми.
Установлено, что низкий уровень аккумуляции молекул флз'орохрома акридинового оранжевого в лизосомах фагоцитов грызунов (особенно мышей) коррелирует с дефицитом в них азурофпльных гранул, несущих ленкоцнтарггз'юэластазуЕСЗ.4.21.11. Уровень активности эластазы, выполняющей физиологическую функцию гидролиза гидрофобных термостабильных структурных белков бактерии в фагоцитах, более чем на порядок различается у высокочувствительных и нечувствительных к чуме видов животных. Для из\'ченной группы лабораторных грызунов (мышеи, морских свинок, крыс и кроликов) этот биохимический показатель строго коррелпрз'ет с интенсивностью внутриклеточного киллинга чумного микроба лейкоцитами крови и с уровнем их видовой естественной резистентности к чуме.
Впервые в процессе формирования противочумного иммз'ннтета Зг лабораторных животных, с использованием микрофлуоримет-рнческого анализа, обнарз'жены конформационные изменения в ДНК лейкоцитов крови, связанные с фз'нкциональной активацией их центрального генетического аппарата (хроматина), а также сдвиги в лнзосомальном аппарате фагоцитов на субпопуляционном з'ровне. Установлено, что характер клеточной реакции по этим двз'М параметрам в з'словиях in vivo зависит от плазмидного профиля и уровня иммуногенности штамма изогешюй системы, нспользз'емого для иммз'ннзацнн лабораторных животных. Только у двз'х наиболее протективных штаммов КМ 226 и ЕВ НИИЭГ, одновременно несущих pFra и pCad, независимо от вида чувствительного к чз'ме организма, выявлена способность активировать центральный генетический аппарат нммунокомпетептных клеток в стерильной фазе иммуногенеза.
Практическая значимость работы заключается в разработке и внедрении в практику научных исследовании новых принципов
и методов клеточного анализа, учитынаюших функциональные параметры большого числи индивидуальных клеток в сложных гетерогенных популяциях: для лабораторної! диагностики чумногс микроба и характеристик» спененн неоднородности культур возбудителя чумы по антигенным свойствам и состоянию генетического аппарата клеточных элементов; для оценки воздействия штаммов Y. peslis с различными биологическими свойствами на организм восприимчивых к чуме животных но уровню сдвигов Е иролнфератпвной активности лейкоцитов крови и центральных органов иммунной системы, а также но способности их активировать, лнбе повреждать хроматин иммунокомпетентных клеток; для контроля за характером и неходом фагоцитарной реакции в условиях in vitrc с использованием профилей ДНК-гистограмм; для сравнительной: исследования состояния лизосомального аппарата лейкоцитов кровн на субпопуляционном уровне у животных с различной естественной резистентностью к чуме н контроля за сдвигами пс этому показателю при чумном вакцинальном и инфекционном процессах.
По материалам диссертационной работы оформлено две заявки на изобретения, на которые Государственным Комитетом СССР по делам открытий и изобретений выданы авторские свидетельства: "Способ постановки реакции иммунофлуоресценции" N 1220176 от 22.11.85 г. и "Способ оценки фагоцитоза" N1522923 от 15.07.89 г.
Результаты исследовании, представленные в диссертации, использованы при разработке методических рекомендаций:
1) 4Определение синтезирующих ДНК и делящихся клеток методом проточной цнтометрни»- (утверждены МЗ СССР 28 июня 1988 г.);
2) «Быстрая оценка специфической активности иммуногло
булинов диагностических чумных люминеецпрующнх методом им
пульсной проточной цнтометрни (утверждены Ученым советом
РосНИПЧИ «Микроб» 26 октября 1987 г.);
3) 4 Быстрая оценка модулирующего действия фосфолипазы Д
чумного микроба на клетки крови с помощью проточной цнтометрни»-
(утверждены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» 30 июня
1992 г.).
Методы, разработанные в ходе выполнения диссертационной работы, включены в методическое пособие « Современные методы диагностики особо опасных инфекций и способы их применения»,
утвержденное ГСУ Минздрава СССР 25 сентября 1991 г., а также в руководство «Иммунология чумы* (Саратов, 1992). Они включены в учебную программу, используемую при чтении лекции на курсах специализации и повышения квалификации врачей н биологов по особо опасным инфекциям при РосІІИПЧИ « Микроб» (лицензия N 16-098 выдана Государственным Комитетом России по высшему образованию).
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены н обсуждены на: Всесоюзной конференции -«Молекулярная биология, генетика и иммунология возбудителен ООИ (Ростов-на-Дону, 1984 ); Всесоюзном симпозиуме, посвященном 60 -летию Тбилисского НИИ ВС (Тбилиси, 1984); Всесоюзном совещании молодых ученых противочумных учреждении СССР (Саратов, 1986); Всесоюзної! научной конференции «Механизмы нротивоинфекционного иммунитета (Саратов, 1987); III Республиканской конференции «Автоматизация цитологических исследований (Киев, 1988); Всесоюзной научно-практической конференции (Владивосток, 1989); научной конференции «Лабораторные животные для медико-биологических и бнотехнологнческнх исследований (Москва, 1990); II Междз'народном симпозиуме «Реабилитация иммунной системы» (Цхалтубо, 1990); Всесоюзной конференции «Молекулярные механизмы развития инфекционных заболевании» (Звенигород, 1990); научной конференции « Актуальные вопросы вакцинопрофнлактикн при ООИ (Киров,1992); 8-ом Международном конгрессе иммунологов (Будапешт, 1992); Российской научной конференции «Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций» (Волгоград, 1992); Российской конференции «Иммунология и специфическая профилактика ООИ (Саратов, 1993); 1-м Интернациональном конгрессе но нммунореабнлитации (Цхалтубо, 1994); Интернациональном симпозиуме по новым методам исследования и стандартизации в микробиологии (Словакия, 1996); VII сьезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997); научных конференциях Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб».
Материалы диссертации вошли в научные отчеты по законченным НИР, выполнявшимся в соответствии с планами Министерства здравоохранения в период с 1985 по 1996 год. Они
опубликованы в 50 научных работах, и том числе в центральной и зарубежной печати.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 239 стр.машинописи, иллюстрирована 8 таблицами и 38 рисунками, состоит из введения, I главы обзора литературы, описання материалов и методов, 4 глав, отражающих результаты собственных исследований по теме, заключения и выводов. Указатель литературы содержит 115 отечественных и 136 иностранных источников.