Микробиологический синтез и характеристика полигидроксиалканоатов, содержащих мономеры среднецепочечного 3-гидроксигексаноата Сырвачева Дарья Анатольевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1 Обзор литературы 14

1.1 Полигидроксиалканоаты, структура и классификация ПГА 14

1.2 Среднецепочечные ПГА: биосинтез, субстраты, условия, свойства

1.2.1 Биохимические пути синтеза ПГА 18

1.2.2 Микроорганизмы и субстраты, используемые для получения среднецепочечных ПГА 22

1.2.3 Физико-химические свойства 2х- и 3х-компонентных полигидроксиалканоатов, содержащих мономеры среднецепочечного 3-гидроксигексаноата 31

1.2.4 Исследование биологических свойств ПГА, содержащих мономеры среднецепочечного 3-гидроксигексаноата 35

1.3 Области применения полигидроксиалканоатов 41

ГЛАВА 2 Объекты и методы исследований 43

2.1 Объекты исследований 43

2.1.1 Исследуемые микроорганизмы 43

2.1.2 Среда для культивирования бактерий 44

2.2 Методы исследований 45

2.2.1 Условия роста бактерий Ralstonia eutropha H16, Ralstonia eutropha В5786 и Cupriavidus eutrophus В10646 и методы измерения параметров культивирования 45

2.2.2 Измерение параметров процесса выращивания бактерий 47

2.2.3 Исследование содержания и состава ПГА 49

2.2.4 Анализ физико-химических свойств сополимеров ПГА, содержащих мономеры среднецепочечного 3-гидроксигексаноата 50

2.2.5 Исследование биологических свойств сополимеров ПГА, содержащих мономеры среднецепочечного 3-гидроксигексаноата 52

2.2.5.1 Анализ структуры поверхности сополимерных образцов ПГА, содержащих мономеры среднецепочечного 3-гидроксигексаноата 52

2.2.5.2 Исследование биосовместимости сополимерных ПГА, содержащих мономеры среднецепочечного 3-гидроксигексаноата 53

2.2.5.3 Исследование биодеградации сополимерных ПГА, содержащих мономеры среднецепочечного 3-гидроксигексаноата, в лабораторных почвенных микроэкосистемах 54

2.2.5.4 Микробиологический анализ почвенного микробиоценоза 55

2.2.5.5 Выделение и идентификация деструкторов ПГА 56

2.3 Статистическая обработка 59

ГЛАВА 3 Микробиологический синтез двухкомпонентных полигидроксиалканоатов, содержащих мономеры среднецепочечного 3-гидроксигексаноата 60

3.1 Отбор продуктивных штаммов по выходам мономеров 3-гидроксигексаноата, общему выходу сополимеров П(3ГБ/3ГГ) и урожаю биомассы клеток 60

3.2 Исследование влияния субстратов, необходимых для микробиологического синтеза сополимеров П(3ГБ/3ГГ), на характеристики культуры C. eutrophus B10646 62

3.3 Исследование условий, обеспечивающих продуктивный процесс микробиологического синтеза двухкомпонентных сополимеров П(3ГБ/3ГГ) 70

3.4 Физико-химические свойства сополимеров П(3ГБ/3ГГ) с различным содержанием мономеров 3-гидроксигексаноата 73

ГЛАВА 4 Микробиологический синтез трехкомпонентных полигидроксиалканоатов, содержащих мономеры среднецепочечного 3-гидроксигексаноата 79

4.1 Исследование возможности синтеза 3х-компонентных ПГА, содержащих мономеры 3ГГ в культуре C. eutrophus В10646, и изучение физико-химических свойств 79

4.2 Физико-химические свойства 3х-компонентных сополимеров ПГА,

содержащих мономеры 3-гидроксигексаноата 84

ГЛАВА 5 Биологические свойства среднецепочечных пга, содержащих мономеры 3-гидроксигексаноата 91

5.1 Исследование структуры и свойств поверхности 2х- и 3х-компонентных ПГА, содержащих мономеры среднецепочечного 3-гидроксигексаноата 91

5.2 Исследование потенциальной цитотоксичности сополимерных ПГА, содержащих мономеры 3-гидроксигексаноата 94

5.3 Исследование разрушаемости сополимеров П(3ГБ/3ГГ) в почве и выявление микроорганизмов-деструкторов 97

Заключение 113

Выводы 115

Список сокращений 117

Список литературы

• Биохимические пути синтеза ПГА
• Среда для культивирования бактерий
• Исследование влияния субстратов, необходимых для микробиологического синтеза сополимеров П(3ГБ/3ГГ), на характеристики культуры C. eutrophus B10646
• Исследование потенциальной цитотоксичности сополимерных ПГА, содержащих мономеры 3-гидроксигексаноата

Введение к работе

Актуальность темы. Микроорганизмы являются источником для синтеза
целевых продуктов различного назначения. Процессы микробного синтеза,
реализуемые при благоприятных условиях выращивания продуцентов,

обеспечивают синтез первичных метаболитов и продуктов, связанных с ростом
клеток и образованием биомассы. Процессы, связанные с накоплением в клетке
продуктов обмена запасной природы, имеют место при старении продуцента или
в условиях несбалансированного роста, когда рост клеток и синтез
азотсодержащих клеточных компонентов ограничены дефицитом биогенных

элементов или энергии. Оптимизация процесса синтеза запасных соединений сложна, так как требует специальных знаний о закономерностях образования резервных макромолекул конкретной химической природы и специфических подходов в каждом конкретном случае (Перт, 1978; Работнова, 1979).

Ценным продуктом микробиологического синетза являются полимеры
гидроксипроизводных алкановых кислот, так называемые

полигидроксиалканоаты (ПГА). Это запасные продукты обмена прокариот,
которые служат внутриклеточным депо энергии и углерода и, за исключением
Alсaligenes eutorpha, аккумулируются внутриклеточно при ограничении
процессов синтеза первичных метаболитов и скорости роста продуцентов. ПГА
обладают широким спектром ценных свойств, включая биосовместимость,
биоразрушаемость, термопластичность и др., поэтому перспективны для

применения в различных сферах в виде различных изделий - от разрушаемой упаковки и тары до высокотехнологичных изделий биомедицинского назначения (Bugnicourt et al., 2014; Brigham and Sinskey, 2012, Philip et al., 2007).

ПГА – это семейство полимеров различной химической структуры,
различающихся базовыми физико-химическими свойствами. В зависимости от
строения мономеров, входящих в состав ПГА, они разделены на три группы:
короткоцепочечные, среднецепочечные и длинноцепочечные, соответственно,
состоящие из мономеров с длиной С-цепи С₃ - С₅, С₆ - С₁₄ и свыше С₁₄ (Steinbchel
and Valentin, 1995). Наиболее изученными к настоящему времени являются
короткоцепочечные ПГА: высококристалличный поли(3-гидроксибутират)

[П(3ГБ)], степень кристалличности (С_Х) 70-80%, который не кристаллизуется
упорядоченно, а изделия из него характеризуются низкой ударной прочностью и
«старятся» во времени, а также сополимеры 3-гидроксибутирата с

3-гидроксивалератом [П(3ГБ/3ГВ)], имеющие несколько сниженную степень кристалличности (40-50%) (Laycock et al., 2013; Volova et al., 2013).

Особо перспективными ПГА являются сополимеры, имеющие низкую кристалличность и обладающие свойствами эластомеров. Это короткоцепочечные сополимеры 3- и 4-гидроксибутирата, а также сополимеры, содержащие, помимо коротко-, среднецепочечные мономеры 3-гидроксигексаноата (3ГГ) или 3-гидроксиоктаноата (3ГО) (Madison and Huisman, 1999; Sudesh et al., 2000; Laycock et al., 2014). Однако синтез сополимерных ПГА является сложной биотехнологической задачей, так как для их получения в состав среды, как

правило, необходимо внесение дополнительных источников углерода в качестве субстратов-предшественников целевых мономеров, которые в подавляющем большинстве ингибируют рост продуцентов. Это негативно сказывается на общей продуктивности процесса биосинтеза по биомассе клеток и общих выходах сополимеров (Bhubalan et al, 2008; Bhubalan et al, 2010; Cavalheiro et al, 2012). Трудности регламентированного и воспроизводимого синтеза сополимерных ПГА сдерживают накопление знаний о влиянии состава мономеров на физико-химические свойства.

Возможности продуктивного синтеза ПГА, содержащих мономеры 3-гидроксигексаноата, дополнительно осложняются спецификой метаболизма гексаноата как субстрата-предшественника (рис.1), так как он метаболизируется в цикле ^-окисления жирных кислот на более короткие фрагменты (С₄ + С₂), снижая тем самым количество субстрата для образования и включения в полимерную цепь мономеров 3ГГ. Поэтому получение высоких выходов ПГА с высоким содержанием среднецепочечных мономеров - трудно реализуемая задача, для ее решения необходимо организовать специальные условия, при которых блокируются реакции ^-окисления гексаноата.

Рисунок 1 - Метаболическая схема синтеза сополимеров ЩЗГБ/ЗГГ)

Анализ зарубежных

публикаций показал, что до
недавнего времени были
известны образцы

П(3ГБ/3ГГ) с невысоким
содержанием мономеров

3-гидроксигексаноата (от

единиц до 10,0–20,0 мол.%). Попытки получения таких сополимеров с более высоким содержанием 3ГГ крайне негативно сказывались на урожае биомассы клеток и общих выходах ПГА (Jian et al., 2010). Наиболее значительные результаты получены только в самые последние годы в культуре рекомбинантного штамма Cupriavidus necator Re2160/pCB113 с клонированным геном ПГА-синтазы из Rhodococcus aetherivorans I24 и геном еноил-КoA гидратазы из Pseudomonas aeruginosa (Budde et al., 2011) при культивировании на маслах растительного происхождения, когда содержание мономеров 3ГГ составляло от 55,0 до 70,0 мол.% при общих невысоких выходах сополимера 45–48 % (Riedel et al., 2012; Wong et al., 2012).

Впервые в биотехнологической практике синтез сополимерных

среднецепочечных ПГА [П(3ГБ/3ГГ) и П(3ГБ/3ГО)] с содержанием мономеров 3ГГ и 3ГО от единиц до 15,0–25,0 мол.% природными штаммами Alcaligenes eutrophus и Seliberia carboxydohydrogena реализован в России (Волова с соавт., 1996). Аналогичный результат синтеза среднецепочечных ПГА, содержащих

мономеры 3ГГ и 3ГО, природным штаммом Ralstonia eutropha H16 зарубежными коллегами получен спустя несколько лет, при этом содержание мономеров 3ГГ и 3ГО не превышали 10,2 и 1,6 мол.%, соответственно (Green et al., 2002). Список природных штаммов продуцентов среднецепочечных ПГА расширяется. Однако в подавляющем количестве публикаций получены весьма невысокие общие выходы сополимеров и включения мономеров 3ГГ. При этом весьма фрагментарны и противоречивы данные по влиянию мономеров 3-гидроксигексаноата на базовые свойства сополимеров (степень кристалличности, молекулярно-массовые и температурные характеристики). Это определило направленность настоящей работы, ориентированной на изучение возможности продуктивного синтеза ПГА, содержащих мономеры среднецепочечного 3-гидроксигексаноата, и выявление взаимосвязи между структурой сополимеров этого типа и свойствами.

Цель работы – исследование условий продуктивного микробиологического синтеза сополимерных ПГА, содержащих мономеры 3-гидроксигексаноата, и изучение свойств сополимеров в зависимости от соотношения мономеров.

Для достижения цели сформулированы следующие задачи:

1. Сравнительное исследование природных штаммов, обладающих способностью синтезировать мономеры 3-гидроксигексаноата, и отбор наиболее продуктивного штамма по содержанию мономеров 3ГГ, общему выходу сополимеров и урожаю биомассы клеток.

2. Исследование и нахождение условий, обеспечивающих продуктивный процесс микробиологического синтеза двухкомпонентных сополимеров П(3ГБ/3ГГ).

3. Оценка возможности синтеза трехкомпонентных ПГА, содержащих мономеры 3ГГ – П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) и П(3ГБ/3ГГ/ДЭГ).

4. Микробиологический синтез семейства двух- и трехкомпонентных сополимеров с различным содержанием мономеров 3-гидроксигексаноата и изучение физико-химические свойств в зависимости от химического состава сополимеров.

5. Исследование биологических свойств сополимеров, содержащих мономеры 3-гидроксигексаноата, включая первичную оценку цитотоксичности в культуре клеток in vitro и разрушаемость почвенной микрофлорой.

Данный объем задач сформулирован впервые; их решение позволило разработать режимы и синтезировать пионерное семейство сополимерных ПГА с различным содержанием мономеров 3-гидроксигексаноата, выявить связь между содержанием 3ГГ и свойствами сополимеров.

Научная новизна. Исследовано влияние субстратов, необходимых для
синтеза среднецепочечных мономеров 3-гидроксигексаноата природным

штаммом Cupriavidus eutrophus B10646, на удельную скорость роста бактерий,
выходы и состав сополимеров. Определены границы физиологического действия
всех исследованных субстратов для штамма и установлено, что время
максимального включения мономеров 3ГГ в состав сополимеров зависит от
концентрации и времени подачи в культуру гексаноата натрия (субстрат-
предшественник мономеров 3ГГ) и акрилата натрия (ингибитор реакций цикла -
окисления жирных кислот). На основе изученных закономерностей

микробиологического синтеза ПГА бактериями C. eutrophus B10646

синтезировано пионерное семейство сополимеров с различным набором и соотношением мономеров – П(3ГБ/3ГГ), П(3ГБ/3ГВ/3ГГ), П(3ГБ/3ГГ/ДЭГ); исследовано влияние состава и соотношения мономеров на физико-химические свойства. Изучены биологические характеристики сополимеров, содержащих мономеры 3-гидроксигексаноата; показано отсутствие цитотоксичности в культуре клеток in vitro; выявлены особенности биоразрушения и специфичные первичные микроорганизмы-деструкторы П(3ГБ/3ГГ).

Практическая и теоретическая значимость работы. Разработаны и
реализованы режимы выращивания C. eutrophus B10646, обеспечивающие
продуктивный синтез сополимеров, содержащих мономеры среднецепочечного 3-
гидроксигексаноата, при сохранении общих выходов ПГА и урожая биомассы
клеток на высоком уровне. Получена научная основа для постановки новой
технологии микробиологического синтеза термопластичных и

низкокристалличных биоразрушаемых полигидроксиалканоатов с улучшенными технологическими свойствами, перспективных для применения в биомедицине, фармакологии и других сферах.

Основные положения, выносимые на защиту:

6. Исследованы условия выращивания и режимы углеродного питания природного штамма Cupriavidus eutrophus B10646, обеспечивающие продуктивный синтез сополимерных ПГА, содержащих мономеры 3-гидроксигексаноата.

7. Синтезировано семейство 2х- [П(3ГБ/3ГГ)] и 3х-компонентных сополимеров [П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) и П(3ГБ/3ГГ/ДЭГ)] с охарактеризованными физико-химическими свойствами.

8. Доказано отсутствие цитотоксичности сополимеров, содержащих мономеры 3-гидроксигексаноата, в культуре фибробластов и особенности биоразрушения почвенной микрофлорой.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были
представлены на 6^м Международном конгрессе "Biomaterials and Nanobiomaterials:
Recent Advances Safety Toxicology and Ecology Issues" Including Russian-Hellenic
Workshop and School of Young Scientists and Symposium of Nanotoxicology
«BIONANOTOX-2015» (Греция, о. Крит, г.Ираклион, 2015г); Международной
научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» в рамках
Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и

перспективы развития» (г.Москва, 2014г); XIII Всероссийской выставке «Научно-
технического творчества молодежи (НТТМ)» (г.Москва, 2013г); Городском
конкурсе «Научно-технического творчества молодежи (НТТМ)» (г.Красноярск,
2013г, 2014г); Научной сессии молодых ученых и аспирантов Института
биофизики СО РАН (г.Красноярск, 2012г, 2015г); Международной научно-
практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» в
рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и
перспективы развития» (г.Москва, 2012г); Международном семинаре

«Биотехнология новых материалов и окружающая среда» (г.Красноярск, 2011г); VII Всероссийской научно-технической конференции студентов, аспирантов и

молодых ученых «Молодежь и наука», (г.Красноярск, 2011г); I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (г.Пермь, 2011г).

По результатам диссертационной работы опубликовано 16 печатных работ, из них 6 статей, включенных в перечень ВАК, в том числе 2 статьи в международных журналах, имеющих импакт-фактор (IF) 4,494 и IF 2,349.

Вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в планировании и проведении всех этапов исследований: от микробиологического синтеза пионерного семейства сополимерных ПГА с различным содержанием мономеров 3-гидроксигексаноата [П(3ГБ/3ГГ), П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) и П(3ГБ/3ГГ/ДЭГ)], изучения свойств полученных образцов ПГА до обработки и интерпретации результатов, подготовки докладов и написания публикаций.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописного текста и включает введение, 5 глав - обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результаты исследований, заключение, выводы и список цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 6 таблицами. Список цитируемой литературы насчитывает 176 источника, в том числе 154 иностранных.

Связь работы с научными программами. Работа выполнена при
финансовой поддержке гранта Правительства РФ для государственной поддержки
научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в
российских образовательных учреждениях высшего профессионального

образования №11.G34.31.0013 «Биотехнология новых биоматериалов» (2010– 2014гг); гранта Американского фонда гражданских исследований и развития для независимых государств бывшего Советского Союза (CRDF) №RUNXO-002-KR-06 (2012г); гранта «Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности» соглашение № 50/14 от 20.11.2014г.

Благодарности. Автор благодарит своего научного руководителя Волову Татьяну Григорьевну за постоянное внимание и помощь в работе, сотрудников базовой кафедры биотехнологии СФУ: канд. биол. наук Жила Н.О. за помощь в проведении и обсуждении экспериментов, д-ра биол. наук Прудникову С.В. за помощь в первичной оценке почвенной микрофлоры.

Биохимические пути синтеза ПГА

Другой подход для увеличения содержания фракции 3ГГ в сополимере заключается в модификации метаболических путей биосинтеза бактерий. Добавление акрилата натрия в среду является возможным путем/агентом таких модификаций, так как акриловая кислота является ингибитором пути -окисления жирных кислот. В доступной литературе известна только одна подобная работа. Green с коллегами изучил и показал влияние различных концентраций акрилата натрия на синтез полимера, выход биомассы и включение мономеров 3ГГ в полимер [Green et al., 2002]. В качестве продуцента ПГА использовали природный штамм Ralstonia eutropha H16, источником углеродного питания являлся октаноат натрия. В ходе экспериментов выявлено, что соли акриловой кислоты токсичны для изучаемых бактерий, следовательно, с увеличением концентрации акрилата натрия в среде рост микроорганизмов ингибировался; в результате урожай биомассы снижался с 3,3 до 2,5 г/л, содержание полимера в клетках также падало (с 50 до 32 % от веса сухой биомассы), однако включение мономеров 3ГГ в сополимере возрастало (с 0,19 до 5,68 мол.%). ПГА с высоким содержанием мономеров 3ГГ авторам не удалось получить. Таким образом, достигнутые уровни включения 3ГГ в ПГА у природных штаммов микроорганизмов, опубликованные до недавнего времени, составляли от 1,0–5,0 до 15,0–20,0 мол.%.

Таким образом, анализ зарубежных публикаций показал, что до недавнего времени были описаны образцы П(3ГБ/3ГГ) с невысоким содержанием мономеров 3-гидроксигексаноата, от единиц до 10,0–20,0 мол.%. Попытки получения таких сополимеров с более высоким содержанием 3ГГ крайне негативно сказывались на урожае биомассы клеток и общих выходах ПГА.

Помимо синтеза двухкомпонентных ПГА, содержащих мономеры среднецепочечного 3ГГ, изучают способность штаммов-продуцентов к синтезу трехкомпонентных ПГА, содержащих помимо мономеров 3ГБ и 3ГГ мономеры 3-гидроксивалерата (3ГВ). В имеющейся литературе показано, что ранее на способность к синтезу сополимеров П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) были изучены некоторые природные штаммы бактерий, в том числе Rhodospirillum rubrum [Brandl et al., 1989], Rhodocyclus gelatinosus [Leibergesell et al., 1991] и Rhodococcus sp. [Anderson et al., 1990-2]. Все исследованные штаммы накапливали ПГА в клетках, однако в большинстве случаев, полимер содержал 3-гидроксибутират и 3-гидроксивалерат мономерные единицы. Тем не менее, Brandl с коллегами установили, что при культивировании R. rubrum на n-алкановых кислотах с длиной углеродной цепи С4 и больше возможен синтез сополимера, содержащего мономеры 3-гидроксигексаноата в дополнении к 3ГБ и 3ГВ мономерам. Авторы заключили, что полученные сополимеры представляют собой новый класс биоразлагаемых термопластов [Brandl et al., 1989]. Позднее появились работы с использованием специально разработанных рекомбинантных штаммов для получения П(3ГБ/3ГВ/3ГГ). Park с соавторами исследовали рекомбинант Escherichia coli при культивировании бактерий на среде с додекановой кислотой и жирными кислотами с нечетным числом атомов углерода [Park et al., 2001]. В результате экспериментов синтезированы сополимеры П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) с содержанием мономеров 3ГВ 0,5–33,6 мол.% и 3ГГ 4,0–22,0 мол.%. Общий выход полимера при этом не превышал 33 % от веса сухой биомассы, урожай биомассы – 3,6 г/л. В исследованиях Zhao и Chen изучен рекомбинант Aeromonas hydrophila 4АК4 [Zhao and Chen, 2007]. Бактерии культивировали на смеси додекановой и пропионовой кислот. В зависимости от концентрации пропионовой кислоты в среде содержание мономеров 3ГВ составляло 2,3–7,1 мол.%, мономеров 3ГГ варьировало в пределах от 5,0 до 11,6 мол.%. Урожай биомассы при этом составлял от 0,43 до 3,3 г/л, выход полимера не превышал 36 % от веса сухой биомассы. В работе Bhubalan с соавторами исследовали рекомбинантный штамм Cupriavidus necator PHB-4/pBBREE32d13. Основным субстратом было масло пальмовых зерен, в качестве предшественников для синтеза мономеров 3ГВ использовали валерат натрия или пропионат натрия. Валерат натрия явился лучшим предшественником для накопления 3ГВ мономеров в сополимере (2,0–60,0 мол.%), при этом урожай биомассы составлял 0,7–7,1 г/л, выход полимера – 6–80 % от веса сухого вещества, однако содержание 3ГГ мономеров было низким и не превышало 7,0 мол.% [Bhubalan et al., 2008].

Недавно Bhubalan с коллегами изучили синтез сополимеров П(3ГБ/3ГВ/3ГГ) другим рекомбинантом – C. necator PHB-4, несущим ген ПГА-синтазы бактерии из рода Chromobacterium, имеющей высокое сродство к синтезу 3ГВ мономеров [Steinbchel et al., 1993; Kolibachuk et al., 1999; Bhubalan et al., 2010]. Бактерии культивировали на среде, содержащей масло сырых пальмовых зерен и пропионат натрия или валерат натрия. При добавлении в среду валерата натрия содержание фракции 3ГВ в сополимере составляло от 2,0 до 91,0 мол.%, в то время как при добавлении пропионата натрия содержание 3ГВ мономеров не превышало 69,0 мол.%. Урожай биомассы в разных экспериментах варьировал от 0,5 до 11 г/л, общий выход сополимера – от 3 до 86 % от веса сухого вещества. Следует отметить, что во всех проведенных экспериментах содержание мономеров 3ГГ не превышало 7,0–9,0 мол.%.

Перечень ПГА постоянно пополняется, и сравнотельно недавно предложено подразделить их дополнительно в зависимости от частоты встречаемости на две категории: «обычные» и «необычные» полигидроксиалканоаты [Olivera et al., 2010]. К «обычным» ПГА относят полимеры, которые синтезируют микроорганизмы внутриклеточно в качестве запасных макромолекул (полимеры, которые были описаны выше) [Steinchel and Fchstenbusch, 1998; Olivera et al., 2001-1; 2001-2; Kessler and Witholt, 2001]. Термин «необычные» ПГА объединяет множество различных ПГА, включая полусинтетические и синтетические полимеры, гомополимеры и смешаные или гибридные полимеры. Среди «необычных» ПГА полимеры микробного происхождения, которые синтезируются либо из природных мономеров, несущих различные функциональные группы, либо из их химических, производных, а также полимеры, полученные химическим синтезом, либо химической модификацией исходных микробных полимеров [Olivera et al., 2010]. К «необычным» ПГА возможно отнесение сополимеров, образованных мономерами гидроксипроизводных алкановых кислот и полиэтиленгликоля.

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) представляет собой семейство нейтральных водорастворимых полиэфиров с различной величиной молекулярной массы, представляющих собой от маслянистой, вязкой жидкости с MЧ = 106 г/моль, известной как диэтиленгликоль (ДЭГ или ПЭГ-106) до воскообразных, кристаллически твердых ПЭГ (MЧ свыше 900 г/моль). ПЭГ считается относительно нетоксичным веществом для клеточных систем. Взаимодействие ПЭГ с синтезом ПГА было исследовано для стимулирования изменений в составе полимера и молекулярной массе ПГА. Исходя из литературных данных, добавление ПЭГ в культуру оказывает влияние на рост клеток, урожай биомассы и состав полимера. Установлено, что при наличии в культивационной среде ПЭГ возможен микробиологический синтез диблок-сополимера ПГА/ПЭГ, где карбоксильный конец (-COOH) цепей ПГА ковалентно связан эфирной связью с цепью ПЭГ. Это явление было названо «PEGylation» [Foster, 2007]. Кроме того, Gross с соавторами показали возможность микроорганизмов включать повторяющиеся единицы мономера этиленгликоля на конец цепи П(3ГБ), тем самым блокируя удлинение С-цепи [Gross et al., 1994]. Структурная формула диэтиленгликоля представлена на рисунке 1.3.

Среда для культивирования бактерий

Исследованы образцы полигидроксиалканоатов, синтезированные в культуре бактерий Cupriavidus eutrophus B10646 по авторской технологии, позволяющей получать образцы ПГА различного химического состава [Volova et al., 2013, 2014]. Для анализа структуры поверхности, а также биологических свойств, включая биосовместимость и биодеградацию, изготовлены плотные гладкие пленки, полученные методом полива из растворов полимеров в хлороформе. Гомогенные растворы, содержащие 20 г/л полимера, нагретые до 35 С, выливали на обезжиренную поверхность чашек Петри и высушивали в течение 2–3 суток при комнатной температуре в боксе ламинаре и досушивали до постоянного веса в десикаторе (Labconco, США).

Микроструктуру поверхности пленочных сополимерных ПГА исследовали с помощью сканирующей электронной микроскопии, используя прибор сканирующий электронный микроскоп (СЭМ) S5500 («Hitachi», Япония).

Свойства поверхности изучали с помощью прибора Drop Shape Analyzer – DSA-25E («Krss», Германия) для измерения контактных краевых углов капель воды и дийодметана методом Оунса-Вендта-Рабеля-Кьельбле [Owens and Wendt, 1969; Kaelble, 1970; Rabel, 1971] измерением свободной поверхностной энергии (СПЭ), ее дисперсной и полярной составляющей с последующей обработкой данных с помощью программы DSA-4. 2.2.5.2 Исследование биосовместимости сополимерных ПГА, содержащих мономеры среднецепочечного 3-гидроксигексаноата

Использована линия фибробластов мыши NIH 3Т3, которыми засевали мембраны 5103 клеток/см2, размещенные в 24-луночных культуральных планшетах («TPP», Svitzerland). Культивирование фибробластов проводили по стандартной методике в среде ДМЕМ [Фрешни, 2010], с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки – 10 %, раствора антибиотиков (стрептомицин 100 мкг/мл, пенициллин 100 ед./мл («Gibco, Thermo Fisher Scientific», USA)) в СО2-инкубаторе при 5 %-ной атмосфере СО2 при 37 С. Замену среды производили раз в три дня.

Количество жизнеспособных клеток оценивали с помощью МТТ-теста: для этого в лунку с каждым типом носителя было добавлено по 50 мкл раствора МТТ (5 %) и 950 мкл полной питательной среды. Через 3,5 часа культивирования среду с раствором МТТ замещали ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов МТТ-формазана. Супернатант переносили в 96-луночный культуральный планшет и проводили измерение оптической плотности при длине волны 540 нм на микропланшетном фотометре Bio-Rad 680 («Bio-Rad Laboratories Inc.», США). Количество клеток оценивали по калибровочному графику.

Морфологию клеток, прикрепившихся к поверхности матриксов, определяли с помощью окраски флуоресцентными красителями DAPI и фаллоидином, коньюгированным с флуорохромом (FITC) (маркеры на ДНК и актин цитоплазмы клеток) («Sigma–Aldrich», USA). Для флуоресцентной микроскопии клетки на матриксах фиксировали 3,7 %-ным раствором формальдегида (ЗАО «Химреактивснаб», Россия) в течение 60 минут, затем промывали в фосфатно-солевом буфере, чтобы удалить закрепитель. После этого пленки с прикрепленными клетками обрабатывали раствором Triton X-100 (0,1 %) («GERBU Biotechnik GmbH», Германия) в течение 5 минут и раствором бычьего сывороточного альбумина (1,0 %) («Ampresco», США) в течение 30 минут при комнатной температуре. Цитоплазму клеток окрашивали раствором FITC (разведение 1/100) в течение 60 минут при комнатной температуре с последующим контрастированием ядер клеток красителем DAPI (раствор 300 нM, в течение 5 минут). Матриксы с клетками исследованы с помощью микроскопа Leica DM 6000 B («Leica Microsystems», Германия).

Для исследования биодеградации из полученных полимерных пленок высекали диски диаметром 30 мм, толщиной 0,045±0,005 мм, которые взвешивали на аналитических весах Discovery («Ohaus», Швейцария), затаривали в нейлоновые сетки и размещали в пластиковых контейнерах объемом 250 см3 с массой полевой почвы в контейнере 200 г на глубину 2 см (рисунок 2.1).

Для исследования использовали агрогенно-преобразованную полевую почву (поселок Минино, Сибирский регион, Красноярский край, Россия). Исследовали химический состав почвы, включая регистрацию рН водной суспензии [ГОСТ 26423-85], концентрацию нитратного азота [ГОСТ 26488-85], подвижного фосфора и обменного калия [ГОСТ 26204-91]. Почва представляла собой криогенно-мицелярный агрочернозем с высоким содержанием гумуса в слое 0–20 см (7,9–9,6 %), слабощелочной реакцией среды (рН 7,1–7,8), высокой суммой обменных оснований (40,0–45,2 м-экв/100 г); с содержанием нитратного азота N-NO3 – 6 мг/кг, а Р2О5 – 6 и К2О – 22 мг/100 г почвы [ГОСТ 26204-91]. Плотность почвы имела рыхлое и нормальное сложение пахотного слоя (0,85–1,11 г/см).

Длительность экспозиции полимерных пленок в почве составляла 35 суток при двух температурных режимах: 21 и 28 С и абсолютной влажности почвы 50 %. Уменьшение массы образцов определяли в динамике с периодичностью в 7 дней, для этого образцы ПГА (по 3 шт.) изымали из почвы. Одновременно с отбором проб ПГА регистрировали следующие показатели: рН и влажность почвы с использованием стандартных физико-химических методов [Звягинцев, 1991]. Образцы после изъятия из почвы отмывали от земли дистиллированной водой, помещали в термостат при 40 С на 24 ч для высушивания до постоянного веса, далее пленки взвешивали на аналитических весах Discovery («Ohaus», Швейцария).

Показателями биодеградации ПГА служили: убыль массы образцов, изменение молекулярно-массовых характеристик, степени кристалличности; морфология и свойства поверхности.

Исследование влияния субстратов, необходимых для микробиологического синтеза сополимеров П(3ГБ/3ГГ), на характеристики культуры C. eutrophus B10646

Для повышения общих выходов биомассы клеток и сополимера П(3ГБ/3ГГ), а также увеличения содержания мономеров 3ГГ исследовано варьирование режимов дозирования в культуру гексаноата натрия и акрилата натрия на фоне поддержания текущих концентраций глюкозы и азота в культуре в границах физиологического действия этих параметров для штамма C. eutrophus В10646.

Результаты исследования влияния концентрации гексаноата натрия в культуре на урожай биомассы бактерий, выход сополимера и содержание в нем мономеров 3ГГ при стабилизации концентраций глюкозы и азота в границах физиологического действия этих субстратов представлены на рисунке 3.4 а. С учетом выявленного снижения содержания мономеров 3ГГ в сополимере с увеличением длительности культивирования бактерий после добавки гексаноата натрия в культуру длительность опытов не превышала 40–48 ч. С увеличением концентрации гексаноата натрия в среде содержание мономеров 3ГГ в сополимере возрастало. Самое высокое содержание мономеров 3ГГ в сополимере (12,0 мол.%) получено при концентрации гексаноата натрия 2,0 г/л. При этом урожай биомассы и общий выход сополимера составляли 4,7 г/л и 57 % от веса сухой биомассы, соответственно.

Вторым фактором, влияющим на образование мономеров 3ГГ, является акриловая кислота, блокирующая реакции цикла -окисления жирных кислот. Результаты исследования влияния концентрации акрилата натрия на характеристики культуры C. eutrophus В10646 представлены на рисунке 3.4 б. Исследован диапазон концентраций акриловой кислоты от 0,1 до 1,0 г/л. Варьирование концентрации акрилата натрия в культуре проводили при стабилизации концентрации гексаноата натрия на уровне 1,0 г/л. С

Показатели роста и синтеза П(3ГБ/3ГГ) в культуре C. eutrophus В10646 в различных режимах дозирования гексаноата натрия и акрилата натрия: варьирование концентрации гексаноата натрия без подачи акрилата натрия (а); варьирование концентрации акрилата натрия при стабилизации концентрации гексаноата натрия на уровне 1,0 г/л (б); дробная подача в культуру гексаноата натрия (однократная доза 0,5 г/л) с одновременной подачей акрилата натрия (однократная доза 0,1 г/л) (в)

Как следует из рисунка 3.4 б, с увеличением концентрации акрилата натрия от 0,1 до 0,4 г/л отмечено возрастание содержания мономеров 3ГГ в сополимере от 20,0 до 56,0 мол.% при близких значениях урожая биомассы бактерий (5,7–6,1 г/л), однако общее содержание сополимера снижалось. При повышении концентрации акрилата натрия до 0,5 г/л отмечено снижение урожая биомассы и более значительное – сополимера на фоне повышения содержания 3ГГ до 65,7 мол.%. С последующим увеличением концентрации акриловой кислоты в среде (до 1,0 г/л) наблюдали значительное снижение урожая биомассы до 3,3 г/л и выхода полимера до 25 % от веса сухой биомассы, в то время как величина включения 3ГГ оставалась на довольно высоком уровне и составляла 58,0 мол.%.

С учетом ингибирующего действия одновременной подачи в культуру гексаноата натрия и акрилата натрия принята дробная схема дозирования этих субстратов. В периодическую культуру C. eutrophus В10646, выращиваемую в режиме синтеза ПГА, дробно вносили различное количество добавок гексаноата натрия (от одной до пяти) (разовая доза гексаноата натрия составляла 0,5 г в расчете на 1 л культуры) с интервалом 6–8 ч. Одновременно с добавкой гексаноата натрия в культуру бактерий вносили добавку акрилата натрия (0,1 г/л), не лимитирующую рост бактерий исследуемого штамма (рисунок 3.4 в). Первая добавка гексаноата натрия и акрилата натрия была сделана на 24 ч культивирования. Содержание сополимера в клетках бактерий в разных опытах варьировало от 31 до 75 % от веса сухой биомассы, содержание мономеров 3ГГ в сополимере составляло от 17,0 до 68,0 мол.%. Максимальное содержание мономеров 3ГГ (68,0 мол.%) в сополимере получено в условиях, при которых одновременная подача гексаноата натрия и акрилата натрия при дробном режиме суммарно составляла, соответственно, 2,5 и 0,5 г/л, урожай биомассы при этом составлял 3,5 г/л, выход сополимера был сниженным (31 % от веса сухой биомассы). В ходе экспериментов выявлено, что акриловая кислота в большей степени по сравнению с гексановой негативно влияет на синтез сополимера и выход биомассы. Кроме того, установлено, что максимальное содержание 3ГГ в сополимере достигается, когда подачу гексаноата натрия и акрилата натрия осуществляли при сниженной остаточной концентрации глюкозы в культуре.

Таким образом, используя предложенный дробный режим дозирования гексаноата натрия и акрилата натрия в культуру и варьируя концентрацию этих субстратов, реализованы режимы продуктивного синтеза сополимеров П(3ГБ/3ГГ) без резкого снижения общих выходов сополимера и урожая биомассы в культуре C. eutrophus В10646, и синтезировано семейство сополимеров с различным, в том числе высоким, содержанием мономеров 3ГГ. Однако для получения образцов сополимера с содержанием 3ГГ свыше 50,0 мол.% приходится жертвовать урожаем биомассы и выходом П(3ГБ/3ГГ).

Исследование потенциальной цитотоксичности сополимерных ПГА, содержащих мономеры 3-гидроксигексаноата

Степень кристалличности наименее разрушенных образцов П(3ГБ) через 35 суток экспозиции в почве практически не изменилась (таблица 5.2), следовательно, в процессе разрушения этого типа ПГА обе фазы (кристаллическая и аморфная) разрушались равномерно. Степень кристалличности образцов сополимера П(3ГБ/3ГГ) от исходной 56 % возрастала, при этом более отчетливо при 21 С – до 60 %, то есть в данном случае более активно разрушалась аморфная фаза. Прямой связи между разрушаемостью образцов ПГА и исходными значениями молекулярной массы не выявлено. Величина МВ медленно разрушаемого гомополимера П(3ГБ) и сополимера П(3ГБ/3ГГ) практически не изменялась, несмотря на значительную убыль массы. Установлено, что в течение экспозиции полимерных пленок в почве на поверхности образцов формируется микробное сообщество, отличающееся по набору и соотношению видов от микробиоценоза почвы, в который экспонировали образцы ПГА. Среди микроорганизмов, выделенных из пленок обрастания с поверхности образцов, экспонированных в почве в течение 35 суток, выделено 58 изолятов бактерий, принадлежащих к 14 родам Achromobacter, Arthrobacter, Acidovorax, Bacillus, Chitinophaga, Corynebacterium, Ensifer, Mitsuaria, Nocardia, Pseudomonas, Pseudoxanthomonas, Stenotrophomonas, Streptomyces, Variovorax.

Последующий высев микроорганизмов, выделенных из пленок обрастания, на селективные плотные среды (минеральный агар с полимером в качестве единственного источника углерода) показал, что первичных деструкторов полимеров значительно меньше. Значительная часть выделенных из пленок обрастания бактерий не являлась первичными деструкторами полимеров и не обладала способностью метаболизировать исходный высокомолекулярный полимер. Следовательно, в пленках обрастания присутствовали как первичные деструкторы, которые способны метаболизировать высокомолекулярный исходный полимер, так и организмы-комменсалы, утилизирующие олигомеры, мономеры, ацетоацетат и другие продукты разрушения высокомолекулярных

ПГА, которые появляются в среде благодаря жизнедеятельности первичных ПГА-деструкторов. Высев проб на плотные среды (метод прозрачных зон, рисунок 5.9) позволил выделить ключевые виды микроорганизмов-деструкторов, специфичных для исследованных типов ПГА.

Образование прозрачных зон на диагностической среде с полимером (деполимеразная активность) было обнаружено у 35 изолятов бактерий, принадлежащих к 11 родам. Среди микроорганизмов-первичных деструкторов ПГА идентифицированы: Acidovorax sp. (2 штамма), Achromobacter sp. (4 штамма), Bacillus pumilus (2 штамма), Bacillus sp. (3 штамма), Chitinophaga sp. (2 штамма), Ensifer adhaerens (3 штамма), Mitsuaria sp. (2 штамма), Nocardia sp. (3 штамма), Pseudomonas fluorescens (2 штамма), Pseudoxanthomonas sp. (4 штамма), Streptomyces albolongus (2 штамма), Streptomyces sp. (3 штамма), Variovorax sp. (3 штамма) (таблица 4.3). Анализ таксономического состава бактерий – первичных деструкторов ПГА, включающий морфологические, биохимические, культуральные и молекулярно-генетические тесты, показал, что спектр деструкторов различен для каждого из исследованных типов ПГА (таблица 5.3).

Таким образом, впервые обнаружено, что спектр деструкторов различен для каждого из исследованных типов ПГА (таблица 5.3). Специфичными среди микроорганизмов, деградирующих гомополимер П(3ГБ), определены представители Acidovorax, Achromobacter, Mitsuaria, Chitinophaga, Nocardia, Streptomyces, Variovorax не встречающиеся среди деструкторов на П(3ГБ/3ГГ). Специфичными деструкторами для П(3ГБ/3ГГ) определены Ensifer adhaerens, Pseudoxanthomonas sp., Bacillus sp., Pseudomonas fluorescens, Bacillus pumilus. Помимо специфичных деструкторов, общими деструкторами для П(3ГБ) и П(3ГБ/3ГГ) определены представители Streptomyces albolongus.

Филогенетический анализ показал, что сообщество деструкторов формирует 4 кластера, объединяющих представителей на уровне филумов: Proteobacteria, Bacteroides, Actinobacteria и Firmicutes (рисунок 5.11). Большинство штаммов (7 родов – Variovorax, Acidovorax, Mitsuaria, Achromobacter, Pseudomonas, Pseudoxanthomonas и Ensifer), выделенных с разных типов полимеров, принадлежат к протеобактериям, среди которых деструкторы П(3ГБ) – Variovorax, Acidovorax, Mitsuaria, Achromobacter принадлежат к классу -протеобактерий, а деструкторы сополимера – Pseudomonas, Pseudoxanthomonas, Ensifer – к - и -протеобактериям. Актинобактерии (2 рода) также включают представителей – Nocardia и Streptomyces, выделенных с обоих типов полимеров. К фирмикутам принадлежат только деструкторы сополимера – два штамма из рода Bacillus, и один штамм-деструктор П(3ГБ) Chitinophaga sp. принадлежит к филуму Bacteroidetes.

Проведены исследования по изучению спектра микромицетов, выделенных с поверхности полимерных пленок исследуемых типов ПГА; выделен 21 изолят, принадлежащих к родам Aspergillus, Botrytis, Corethropsis, Fusarium, Haplographium. При идентификации микромицетов с поверхности пленок на П(3ГБ) определены представители Fusarium roseum, Fusarium dimerum, Botrytis cinerea и Aspergillus sp., на поверхности П(3ГБ/3ГГ) – Fusarium moniliforme, Fusarium chlamydosporum, Botrytis cinerea, Haplographium sp. и Corethropsis sp. По результатам исследований установлено, что доминирующим представителем микромицетов является род Fusarium. Представители данного рода обнаружены в большом количестве на поверхности полимерных пленок при деградации всех типов исследуемых ПГА.