Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. История возникновения и развития фаготерапии 9
ГЛАВА 2. Исследования по фармакокинетике бактериофагов ... 22
ГЛАВА 3. Материалы и методы 27
3.1. Материалы для исследования 28
3.2. Объем исследования 28
3.3. Методы изучения динамики выведения бактериофагов 28
3.3.1. Подготовка клинических образцов 30
3.3.2. Выявление фага методом агаровых слоев 30
3.3.3. Обнаружение бактериофага на плотных питательных средах по методу Отто 31
3.3.4. Определение фагочувствительности бактерий капельным методом 31
3.4. Методы изучения бактериологической эффективности фаготерапии 33
3.5. Метод статистической обработки 35
ГЛАВА 4. Результаты изучения динамики выведения бактериофагов из организма человека
4.1. Выявление бактериофагов в моче здоровых 36
4.2. Выявление бактериофагов в моче больных 40
4.3. Выявление бактериофагов в крови 50
4.4. Выявление бактериофагов в образцах бронхосмывов 52
4.5. Выявление бактериофагов в смывах с поверхности ожоговых ран 58
4.6. Выявление бактериофагов в ликворе 62
ГЛАВА 5. Результаты изучения бактериологической эффективности пероральной фаготерапии урологических гнойно-воспалительных заболеваний
5.1. Этиологическая структура гнойно-воспалительных заболеваний в урологических отделениях 65
5.2. Определение фагочувствительности основных возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний 65
5.3. Чувствительность возбудителей уроинфекций к бактериофагам и антибиотикам 68
5.4. Результаты перорального применения бактериофагов условно-патогенных бактерий при лечении уроинфекций 69
Заключение 75
Выводы 86
Список литературы 88
- Исследования по фармакокинетике бактериофагов
- Определение фагочувствительности бактерий капельным методом
- Выявление бактериофагов в моче здоровых
- Определение фагочувствительности основных возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний
Введение к работе
Лечение гнойно-септических инфекций остается актуальной проблемой современной медицины. После открытия лечебного действия антибиотиков и успешного применения их при лечении инфекционных заболеваний, препараты антибиотиков становятся основным средством борьбы с гнойно-воспалительными заболеваниями бактериального происхождения.
В последние десятилетия изменилась этиологическая структура гнойно-септических инфекций, стали преобладать условно-патогенные бактерии -P.aeruginosa, Enterobacter, E.coli, Proteus, Klebsiella. Наибольшая значимость условно-патогенных микробов проявляется в группах новорожденных, больных хирургических, ожоговых, урологических и реанимационных отделений. Особенности вышеназванных групп больных состоят в ослаблении иммунитета, изменении собственной микрофлоры (колонизация госпитальными штаммами) и в развитии аллергических реакций. Некоторые из вышеперечисленных состояний являются прямым следствием использования антибиотиков.
Постоянное медикаментозное вмешательство с использованием диагностической аппаратуры, длительное пребывание в организме больного катетеров, дренажей, интубационных трубок и т.д. увеличивает риск проникновения микробов. Ситуация осложняется тем, что многие из возбудителей обладают лекарственной устойчивостью к одному или нескольким антибиотикам, которая имея хромосомную или чаще плазмидную природу, передается от одного штамма другому вследствие конъюгации. Микроорганизмы, обладая высокими адаптационными способностями к условиям конкретного стационара, с течением времени приобретают устойчивость к новым антибиотикам и другим лекарственным средствам, применяемым в данном стационаре, и могут формировать госпитальные штаммы.
Необходимость лечения гнойно-септических инфекций более эффективным и щадящим способом, без побочного воздействия на общее состояние больного побудило клиницистов обратить свое внимание на бактериофаги, которые ещё в
30-40 годы XX века демонстрировали хорошие терапевтические свойства при лечении кишечных и гнойных инфекций.
В нашей стране препараты бактериофагов успешно использовали при лечении бактериальных осложнений у больных с послеоперационными и ожоговыми ранами (Лахно В.М., 1996, Лазарева Е.Б. с соавт., 1996). Положительный клинический эффект был получен при фаготерапии гнойно-воспалительных инфекций в акушерстве и гинекологии (Бартельс А.В., 1940, Левит И. Б., 1944), педиатрии (Брашнина Н.П. с соавт., 1984, Боговазова Г.Г. с соавт., 1992) в офтальмологии (Азнабаев М.Г. с соавт., 1999), отоларингологии (Коновальчиков Г.Д, с соавт., 1992, Жиленков Е.Л. с соавт., 2002).
В результате приема препаратов бактериофагов отмечали улучшение общего состояния больных, снижение температуры, уменьшение гнойного отделения из ран и быстрое их очищение, элиминацию или снижение количества бактерий возбудителей в очаге поражения, нормализацию работы кишечника. Отрицательных побочных эффектов, в том числе при повторном применении бактериофагов, не наблюдали.
В Российской Федерации выпускают фаги против основных возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний - стафилококков, стрептококков, синегной-ной палочки, протея, клебсиелл, кишечной палочки. Однако, использование препаратов бактериофагов ограничено, вследствие устоявшегося мнения об эффективности именно местного применения препаратов (аппликации, орошение ран и слизистых, введение в полость матки, мочевого пузыря, придаточных пазух носа, а так же в дренированные полости и в полости абсцессов после удаления экссудата). Это сужает границы лечебного применения бактериофагов при гнойно-воспалительных заболеваниях, когда непосредственный контакт препарата с возбудителем невозможен. Пероральный прием препаратов традиционно назначают лишь при энтеральных инфекциях и дисбактериозах.
Цель работы: обосновать пероральное применение препаратов бактериофагов условно-патогенных бактерий при лечении гнойно-воспалительных заболеваний человека.
Задачи исследования:
1) Изучить динамику выведения бактериофагов условно-патогенных бакте рий из организма человека при пероральном однократном приеме препарата.
2) Охарактеризовать фаго чувствительность современных возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний при уропатологии.
3) Изучить бактериологическую эффективность препаратов бактериофагов при лечении урологических больных с гнойно-воспалительными заболеваниями.
Научная новизна работы:
Доказано, что при пероральном введении препарата бактериофага фаги, проникая в кровь в течение первых часов после приема, достигают очага инфекции, размножаются и выводятся с мочой. Длительность пребывания бактериофага в организме и массивность его выделения связана с наличием гомологичного фа-гочувствительного возбудителя. Обнаружение фагов не только в крови, но и в бронхо-легочном содержимом, ликворе, экссудате ожоговых ран, моче свидетельствует о целесообразности перорального использования бактериофагов, если очаг воспаления не доступен для непосредственного контакта с препаратом.
Доказана бактериологическая эффективность пероральной фаготерапии гнойно-воспалительных заболеваний с локализацией инфекционного очага, недоступной местному применению.
В условиях урологического стационара показана целесообразность использования фаговых препаратов, адаптированных к госпитальным возбудителям уро-инфекций.
Практическое значение работы:
Высокая клинико-бактериологическая эффективность препаратов бактериофагов при лечении гнойно-воспалительных заболеваний у урологических больных позволяет использовать бактериофаги в качестве самостоятельного лечебного средства, либо вместе с антибиотиками.
Результаты изучения динамики выведения бактериофагов и эффективность фаготерапии уроинфекций позволяют рекомендовать эти препараты не только для местного, но и для перорального применения при лечении гнойно-воспалительных заболеваний, особенно при недоступности прямого воздействия. Доказана необходимость определения фагочувствительности возбудителя инфекции перед назначением фаготерапии.
Использование коммерческих препаратов бактериофагов, адаптированных к штаммам-возбудителям гнойно-воспалительных заболеваний, особенно госпитального происхождения, доказывает возможность их применения для борьбы с госпитальной инфекцией.
Результаты выполненных исследований с 1996 г. внедрены в практику урологического отделения городской клинической больницы №47 г. Москвы и в практику урологических отделений НИИ урологии МЗ РФ.
Основные положения, выносимые на защиту.
1) После перорального приема препарата бактериофаги с кровью проникают в различные органы и ткани человека и размножаются в очаге инфекции на гомологичном фагочувствительном возбудителе. Длительность обнаружения фагов в крови, моче, бронхо-легочном содержимом и раневом экссудате составляет V-VI суток и более. При наличии инфекционного процесса, обусловленного негомологичным или фагоустоЙчивым возбудителем, фаги выводятся из организма преимущественно в течение П-Ш суток. Результаты изучения динамики выведения бактериофагов свидетельствуют о необходимости определения фагочувстви-тельности возбудителя перед назначением фаготерапии.
Обоснована целесообразность перорального назначения бактериофагов с локализацией инфекционного очага, недоступной для непосредственного воздействия препарата.
Доказана клинико-бактериологическая эффективность пероральной фаготерапии гнойно-воспалительных заболеваний в урологической клинике.
Апробация работы.
Основные результаты исследований были доложены на Всероссийском семинаре по повышению квалификации работников предприятий, производящих МИБП и сотрудников практического здравоохранения, Москва, 2001 г.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Объем и структура работы.
Диссертация изложена на 101 стр. машинописного текста и состоит из введения, 2-х глав обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2-х глав результатов собственных экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 114 отечественных и 15 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 19 таблицами.
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Исследования по фармакокинетике бактериофагов
В 20-40-е годы XX века большое внимание уделяли изучению фармакоки-нетики бактериофагов в организме лабораторных животных (белых мышей, кроликов, морских свинок, собак). Фаги в организм вводили двумя способами: парентеральным (внутривенно, подкожно) и пероральным. В различные сроки после введения препарата животных забивали, исследовали кровь, мочу, лимфу, кишечное содержимое и внутренние органы (печень, селезенку, сердце, легкие и т.д.). Исследуемый материал (методом отпечатков или после предварительного измельчения органа) засевали на чашки Петри с индикаторным штаммом и инкубировали в течение суток при температуре 37 С. Появление на бактериальном газоне отдельных негативных колоний свидетельствовало о присутствии бактериофагов в образце.
В экспериментах использовали преимущественно кишечные фаги (дизентерийный и брюшнотифозный).
В результате исследований было выявлено, что при подкожном введении морским свинкам брюшнотифозного и дизентерийного бактериофагов фаговые частицы обнаруживали через 3-5 мин. в слюне, испражнениях, моче (Азлецкая А.Е., 1950), через 5 мин. в кровяном русле и через 10 мин. во внутренних органах (почках, печени, селезенке, мышцах, мозге и желчи) (Крестовникова В. А., Губин В.М., 1924). Калинкина А.Г. и Финкелыптейн Н.Р. (1948) при пероральном введении мышам и свинкам брюшнотифозного фага выделяли фаговые частицы через 1 час из крови, паренхиматозных органов и кишечника.
Длительность пребывания фагов в крови здоровых животных после однократного введения препарата составляла 24-48 часов (Смирнов П.В. с соавт., 1931, Каплан А.С. 1941, Зобнина К.С., 1963), единичные фаговые частицы выделяли из крови до 6 суток (Карпов СП., Яворская Б.М., 1949), из внутренних органов - до 8-10 дней (Воронец Н.П., 1971, Карпов СП., Яворская Б.М., 1949, Сутин И.А., 1947), в слюне, моче и фекалиях до 14 дней (Азлецкая А.Е., 1950). Смирнов П.В. и Гольдин М.С. (1931) обнаруживали бактериофаг спустя 13-17 дней после парентерального введения, главным образом, он локализовался в лимфатических узлах и селезенке.
Сравнительный анализ концентрации фага в крови и моче, функцию почек в процессе очищения крови от фагов был сделан Парнесом В.А. с соавт. (1950) и Зобниной К.С.(1963). После внутривенного введения препарата концентрация фага в первые часы составила 10 -10 (Парнес В.А. с соавт., 1950) или 10 -10 (Зоб-нина К.С, 1963). Парнес В.А. с соавт.(1950) при постановке опытов на собаках обнаружили, что фаги наиболее интенсивно выделялись в течение первых трех часов после введения, в меньшей степени - в последующие четыре часа. Спустя 7 часов фаг ни в одном случае найден не был. Зобнина К.С. с соавторами (1963) выделяли бактериофаг из крови мышей через 24 часа. Через 48-96 часов фаг не выявлялся. Авторы отмечали, что концентрация фага в моче всегда меньше чем в крови. При более высоких концентрациях фага в крови, он в большей степени выделяется с мочой.
В ряде работ отмечены существенные различия в сроках выделения фаговых частиц из организма здоровых и инфицированных животных.
Сутин И.А. в опытах на белых мышах установил, что после введения фага через рот, бактериофаг сохранялся в организме до 10 дней, в первую очередь в лимфатических железах, в печени и селезенке. Одновременно в опытах, где после кормления бактериофагом производилось последующее заражение белых мышей микробом (палочкой Бреслау), бактериофаг выделялся из организма до 35 дня. «Подтверждался факт «приживаемости» бактериофага при наличии в организме лизабельной культуры» (Сутин И.А., 1947).
У белых мышей, инфицированных дизентерийной культурой Флекснера, через 2-6 ч после внутривенного введения бактериофага наблюдалось интенсивное размножение его в крови и в органах, в течение первых 12 часов концентрация увеличивалась до 10 -10 , удерживаясь на максимальном уровне в течение суток. Длительность циркуляции фага в крови равнялась 96 часов - 6 суток (Зобнина К.С., 1963).
Исследования спинномозговой жидкости здоровых собак, проведенные Пономаревым А.В. с соавторами (1935) показали, что гематоэнцефалический барьер являлся непроницаемым для фаговых частиц. Высокая концентрация фагов в крови не влияла на их проникновение в ликвор. Напротив, введенный в субарахнои-дальное пространство фаг уже через 30 мин. появлялся в кровяном русле. Выведение его из цереброспинальной жидкости происходило медленно, спустя 1 сутки его концентрация составляла 103, а на 2-3 сутки фаг обнаруживали методом обогащения. Исследование образцов ликвора 3-х человек с хронической эпилепсией показало отсутствие фага в ликворе при отсутствии очага инфекции в организме. «Нарушение центрального барьера даже в слабой степени влечет за собой поступление бактериофага из кровяного русла в liquor» (Пономарев А.В. с соавт., 1935).
Динамика выведения фагов после перорального приема препарата у здоровых и больных людей практически не изучена. В ряде работ 40-х годов, посвященных фагопрофилактике дизентерии и брюшного тифа, а так же отработке дозировки препарата, исследованию подвергалось содержимое кишечника, поскольку из мочи, в большинстве случаев, фаги выделить не удавалось.
У пациентов после перорального однократного приема препарата фаговые частицы обнаруживали в испражнениях в течение первых 3-5 дней (Гинзбург Е,Б. с соавт., 1948, Павлова Л.И. с соавт., 1971), реже 6-7 (Карпов СП., Яворская Б.М., 1949) или 10 дней (Каплан А.С. 1941 ).
Гинзбург Е.Б. с соавторами (1948) определяли количество фага на прием, необходимое для более длительного его пребывания в организме здорового человека. Было показано, что без подщелачивания желудочного сока после приема 30 мл препарата фага из 9 обследованных фаги удалось выделить только у 2 . В одном случае фаг выделялся из испражнений 2 дня, а в другом - 4 дня. Из мочи обследованных фаг выявить не удалось. Длительность выделения брюшнотифозного фага (после приема 30 мл препарата с содой) и его титр были меньше, чем у дизентерийного и составляли 3-5 дней.
Определение фагочувствительности бактерий капельным методом
Пробирки с 2,5 мл расплавленного 0,7% мясопептонного агара охлаждали в водяной бане до 46 С. Из культуры индикаторного штамма, выращенного на чашке с МПА в течение суток при температуре 37 С, готовили суспензию и по ОД мл суспензии добавляли в каждую пробирку с полужидким агаром. После этого 1 мл исследуемого образца вносили в пробирку, круговыми движениями содержимое пробирки перемешивали и выливали на поверхность чашки с 1,5 % агаром, равномерно распределяли по ней, осторожным покачиванием чашки. После застывания полужидкого агара чашки инкубировали при температуре 37 С. Учет результатов проводили через 18 -20 часов инкубации (Габрилович И.М. 1968). При подсчете числа частиц в 1 мл образца учитывали фаговые частицы, образующие негативные колонии на газоне с индикаторным штаммом (КОЕ/мл).
Нами была определена морфологическая характеристика негативных колоний изучаемых фагов (синегнойного, коли и клебсиеллезного) на индикаторных штаммах, таким образом, по характеру и степени лизиса мы могли оценивать факт присутствия искомых фагов и массивность их присутствия в исследуемом образце.
Мясо-пептонный агар 1,5% разливают в чашки Петри, После застудневания питательную среду засевают 16-18-часовой бульонной культурой бактерий, гомологичных искомому фагу (индикаторный штамм). Для получения сплошного роста, 2-3 капли культуры, нанесенные в центре чашки, растирают шпателем равномерно по всей её площади. Спустя 5-10 мин. после посева на подсушенную поверхность питательной среды наносят каплями исследуемый фильтрат. После того как жидкость впитается в среду, чашки перевертывают вверх дном и ставят в термостат при 37 С на 18-24 ч (Лабинская А.С., 1978).
Учет результатов проводили по четырехкрестовой системе (см. гл. 3.3.4. «Определение фагочувствительности штаммов бактерий капельным методом»), 2 мл суспензии, приготовленной из культуры бактериального штамма, выращенного на чашке с МПА в течение суток при температуре 37 С, наслаивали на поверхность 1,5% мясопептонного агара, удаляли излишек суспензии пастеровской пипеткой и подсушивали чашку при комнатной температуре в течение 20-30 мин. На поверхность бактериального газона пастеровской пипеткой наносили по 1 капле (0,03 мл) соответствующего набора препаратов бактериофагов. После подсыхания капель чашки инкубировали в термостате при 37 С в течение 18-24 ч (Лабинская А.С., 1978).
Учет результатов проводили по четырехкрестовой системе. Четырех и трех-крестовыми реакциями (++++ и +++ ) обозначали сливной и полусливной лизис бактериального газона индикаторного штамма, который соответствовал высокой-концентрации фаговых частиц в образце, двух-крестовыми реакциями (++) обозначали скопление в месте нанесения препарата более 50 негативных колоний, что свидетельствовало об умеренном содержании фаговых частиц в образце. Единичное присутствие фага в образце обозначали как + или ± (+ - от 10 до 50 колоний фага, ± - менее 10 негативных фаговых колоний) (рис 1).
Опытная группа больных состояла из 107 человек (из них - 15 детей) с различными инфекционно-воспалительными урологическими заболеваниями (уретриты, циститы, хронические и острые пиелонефриты, мочекаменная болезнь). Возраст пациентов составлял от 1 года 8 мес. до 81 года. В группу вошли больные с дренажами (66 чел.) и без дренажей (41 чел.).
В контрольную группу вошли больные (51 чел.) с аналогичными заболеваниями, лечение которых осуществлялось антибиотиками. Для объективной оценки результатов антибиотикотерапии в отдельную подгруппу (1 п/гр.) были выделены больные, получавшие ципрофлоксацин - современный препарат из группы фтор-хинолонов (25 чел.), который к моменту проведения клинических испытаний был новым препаратом для урологического стационара, обладающим сильным антибактериальным действием, особенно в отношении штаммов синегнойной палочки и энтеробактера. Лечение остальных пациентов (2 п/гр.) проводили традиционными антибиотиками, применяемыми в клинике в течение ряда лет: гентамицином, ампиоксом, налидиксовой кислотой и цефазолином (26 чел.).
В соответствии с видом возбудителя инфекции, больным назначали жидкие препараты бактериофагов (синегнойный, протейный, стафилококковый, стрептококковый, коли) или комбинированный пиобактериофаг, в состав которого вошли все вышеперечисленные бактериофаги. В работе использовали коммерческие препараты бактериофагов, изготовленные на ДП «Биофаг» Уфимского ГУП «Имму-нопрепарат». Так же был использован экспериментальный фаг против бактерий рода Enterobacter, разработанный Алферовой Э. В. и Ворошиловой Н.Н. в Уфимском НИИВС им. Мечникова.
Больные без дренажей (41 чел.) принимали только препарат бактериофага, среди больных с дренажами (66 чел.) одна группа принимала только препараты бактериофага (36 чел.), вторая группа, наряду с бактериофагами, получала антибиотики (30 чел.). Курс лечения 7-10 дней, либо дольше, в зависимости от результатов контрольного бактериологического анализа мочи и клинической картины заболевания (табл.2).
Выявление бактериофагов в моче здоровых
В течение первых 24 часов после однократного перорального приема жидкого препарата пиобактериофага фаговые частицы выделялись у всех обследованных. Основным фактором, влияющим на динамику выведения фагов, а так же на уровень их содержания в образцах мочи являлась фагочувствительность штаммов гомологичных бактерий, возбудителей ГВЗ.
Через 2 часа фаги присутствовали в 90,9 % образцов у больных с фагочувст-вительными штаммами и в 33,3% образцов с фагоустойчивыми штаммами гомологичного возбудителя инфекции и в 84,6- 87,5 % образцов при отсутствии гомологичного возбудителя у больных и здоровых. Длительность выведения фаговых частиц с мочой у обследованных составляла в среднем VI суток (таковы были сроки нашего обследования). В группе больных с фагоустойчивыми штаммами P.aeruginosa фаги выделялись в течение П-Ш суток.
Высокий уровень содержания фаговых частиц в образцах мочи, особенно в более удаленные от приема препарата сроки (III-VI сутки), свидетельствовал о поддержании высокой концентрации фагов в крови за счет размножения бактериофагов на гомологичных фагочувствительных бактериях. Через VI суток после однократного приема пиобактериофага только у больных, инфицированных фаго-чувствительными штаммами бактерий (P.aeraginosa, E.coli, Е. agglomerans) частота выявления образцов, содержащих гомологичные фаги составляла 87,5%, при этом 50% образцов характеризовались высокой концентрацией фагов.
При отсутствии гомологичного возбудителя у больных и у здоровых массивный выход синегнойных или коли фагов с мочой осуществлялся в течение первых 6- 8 часов после приема препарата, затем следовало постепенное снижение концентрации, вплоть до полного исчезновения фагов в последующие сутки (III-VI). Низкое содержание фагов в образцах свидетельствовало об отсутствии гомологичного возбудителя в организме. Была выявлена определенная специфика в динамике выведения фагов у больных с мочекаменной болезнью, наиболее выраженная при поражении обеих почек. Первые сутки после приема препарата характеризовались низким уровнем выведения фага с мочой, что свидетельствовало о плохой фильтрации фагов в почках, происходящей из-за адсорбции фаговых частиц на поверхности камней.
Нами были изучены образцы крови (п=51), полученные от 8 больных с урологическими инфекциями (пиелонефрит, мочекаменная болезнь, аденома простаты) и 4 больных реанимационного отделения института скорой помощи им. Н.В. Склифосовского с ожогами и черепно-мозговыми травмами.
В результате микробиологического исследования мочи у всех обследованных урологических больных была выявлена бактериурия. Высевали штаммы Р. aeruginosa, в концентрации 103-108 (5 чел.) и E.coli - 102-104(3 чел.). Больные принимали перорально 30 мл комбинированного пиобактериофага однократно. Первый образец у всех больных брали через 1 час после приема препарата, повторный образец брали у каждого обследуемого в течение первых 6 часов (через 3,4 или 6 часов). Таким образом, было исследовано по 2 образца крови у каждого больного.
Все полученные образцы характеризовались высокими концентрациями си-негнойных и коли фагов, о чем свидетельствовали реакции сливного лизиса бактериального газона индикаторных штаммов (см. гл.З «Материалы и методы»),
У хирургических больных реанимационного отделения (4 чел.), по результатам бактериологического исследования мочи, мокроты и ликвора, чаще других возбудителей высевались штаммы К, pneumoniae: у 3-х больных из мокроты (105-10 ), у 2-х - из ликвора (10 -10 ). Штаммы P. aeruginosa были выделены у одного больного Б-9 из мочи (10 ), у больного Б-11 из мокроты (10 ).
Хирургическим больным вводили 30 мл препарата пиобактериофага поливалентного с клебсиеллезным компонентом через зонд в желудок однократно. Образцы крови брали с помощью постоянных катетеров через 2, 4, 8, 10, 12, 24 часа после введения препарата, и затем один раз в день в течение V суток. Выявляли присутствие в крови синегнойных и клебсиеллезных фагов (табл. 9).
Поскольку хирургические больные получали большие дозы антибиотиков, которые, находясь в образцах крови, в ряде случаев вызывали подавление роста наших индикаторных штаммов, массивность выхода бактериофагов не определяли. Однако, при выведении антибиотика или снижении его концентрации в крови, фаговые частицы проявлялись в виде негативных колоний на бактериальном газоне индикаторных штаммов.
Через 2 часа после перорального приема пиобактериофага синегнойные и клебсиеллезные фаги были обнаружены в образце крови больного Б-12. Необходимо отметить, что клебсиеллезные и синегнойные фаги выделялись из образцов крови у больных как при наличии гомологичного возбудителя (Б-9, Б-11, Б-12), так и в его отсутствии (Б-10, Б-12). У больного Б-9, из мочи которого высевали штаммы P.aeruginosa, синегнойные фаги обнаружили в образце крови, взятом через VI суток после введения препарата «per os» .
Таким образом, исследование образцов крови, взятых у больных после пе-рорального однократного приема пиобактериофага, выявило присутствие в крови фаговых частиц уже через 1 час после приема препарата. Высокая степень лизиса образцов у урологических больных свидетельствовала о высокой концентрации фаговых частиц в крови в течение первых 6 часов. Синегнойные фаги обнаруживали в крови хирургических больных в течение VI суток после однократного приема препарата пиобактериофага.
Определение фагочувствительности основных возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний
Фармакокинетика бактериофагов в организме лабораторных животных (мыши, свинки, собаки) подробным образом была изучена рядом исследователей в двадцатом веке. Результаты экспериментов показали, что бактериофаги присутствовали в крови и паренхиматозных органах животных (печени, селезенке, сердце, почках, лимфатических узлах и т.д.) через 5-Ю мин. после парентерального (и/к, в/м, в/в) введения (Крестовникова В.А., Губин В.М., 1924, Азлецкая А.Е., 1950, Аникина Т.А., 1974, Ворошилова Н.Н., 1992) и через 1 час после перорального приема препаратов бактериофагов (Калинкина А.Г., Финкельштейн Н.Р., 1948). Длительность пребывания фагов в крови здоровых животных после однократного введения препарата любым способом (подкожным, внутри брюшинным, внутривенным, пероральным) составляла 24-48 часов (Смирнов П.В. с соавт., 1931, Ка-план А.С, 1941, Зобнина К.С., 1963, Ворошилова Н.Н., 1992), единичные фаговые частицы обнаруживали на 6 сутки (Карпов СП., Яворская Б.М,, 1949). Из внутренних органов, слюны, мочи и фекалий фаги выделяли в течение 14 суток (Карпов СП., Яворская Б.М., 1949, Сутин И.А., 1947, Азлецкая А.Е., 1950, Воронец Н.П., 1971).
Польские исследователи, основываясь на многолетний опыт клинического использования препаратов бактериофагов (1983-1987 гг.) показали эффективность пероральной фаготерапии таких гнойно-воспалительных инфекций, вызванных условно-патогенными бактериями, как плевриты, пневмонии, бронхопневмонии, менингиты, септицемии и урологические заболевания. Было доказано, что у больных, получавших курс фаготерапии пероральным способом, фаги проникали в кровь и выделялись с мочой. У здоровых фаги были выявлены в крови и в моче через 3 часа после перорального приема препарата (Slopek S. et al., 1987, Weber-Dabrowska В. et al., 1987).
Так как у человека бактериофаги выделяли только из мочи, крови и кишечного содержимого, мы, изучая динамику выведения фагов, использовали доступные для обследования экссудаты и жидкости различных систем организма (лик-вор, бронхо-легочный и раневой экссудаты, мочу, кровь). Динамика выведения бактериофагов с мочой была изучена на здоровых добровольцах (27 чел.) и на урологических больных (22 чел.) НИИ урологии МЗ РФ. Процесс распространения фагов после перорального приема препарата изучали на образцах, полученных от больных с уроинфекциями НИИ урологии (8 чел.) и хирургических больных ожогового и реанимационного отделений (22 чел.) института скорой помощи им. Н.В.Склифосовского. Все обследуемые получали однократно перорально 30 мл препарата бактериофага (ДП «Биофаг» ГУП «Йммунопрепа-рат») (см. гл. 3 «Материалы и методы»).
Основным критерием при анализе полученных результатов являлось наличие у больных бактериального возбудителя инфекции, гомологичного выделенному фагу.
Исследования образцов крови, полученных от 8 урологических и 4 хирургических больных, принимавших перорально пиобактериофаг, выявили присутствие в крови синегнойных и коли фагов уже через 1 час после приема препарата. Фаги обнаруживали в крови в течение VI суток.
В течение первых часов после приема пиобактериофага фаговые частицы выявляли в раневом экссудате и образцах бронхосмывов независимо от бактериальной контаминации ран или бронхов. Наличие у больного бактериального возбудителя способствовало постоянному присутствию гомологичных фагов в образцах (бронхосмывы, смывы с поверхности ожоговых ран) в течение первых суток, а так же приводило к повышению концентрации фагов через V-VI суток, что при однократном введении препарата свидетельствовало о процессе репродукции бактериофагов на чувствительных бактериальных клетках.
У больных с ожогами дыхательных путей І-Ш степени (10 чел.), инфицированных штаммами P.aeruginosa, в течение первых 4-х часов после приема препарата пиобактериофага в образцах бронхосмывов были обнаружены как синегнойные, так и коли фаги, несмотря на то, что штаммы E.coli из мокроты не высевались. Через VI суток после приема препарата на фоне постоянного выделения из брон-хо-легочного содержимого штаммов P.aeruginosa у 4 больных из 5 обследованных концентрация синегнойных фагов в образцах возрастала до 10-10 КОЕ/мл. У двух больных синегнойные бактериофаги были обнаружены в образцах бронхос-мывов через VII и X суток после однократного приема пиобактериофага (10 КОЕ/мл). Таким образом, фагочувствительные штаммы бактерий обеспечивали процесс репродукции гомологичных фагов, поддерживая тем самым высокую концентрацию фаговых частиц в крови и в самом органе.
Отсутствие в мокроте возбудителя, например, Е. coli, приводило к элиминации коли фагов, преимущественно, в течение первых суток. Через VI суток только у одного больного из 7 обследованных в образце бронхосмыва были обнаружены единичные частицы коли фага.
У больных из отделения нейрохирургической реанимации (3 чел.) наличие в бронхо-легочном эксудате фагочувствительных штаммов К. pneumoniae способствовало поддержанию высокой концентрации клебсиеллезных фагов в образцах бронхосмывов, особенно, в течение первых суток после приема препарата,
У 8 больных с ожоговыми ранами через 1 час после перорального приема пиобактериофага синегнойные фаги были выделены из раневых эксудатов 5 человек, независимо от вида возбудителя, присутствующего в ране. При инфицировании раневой поверхности штаммом P. aeruginosa (один больной) синегнойные фаги выделялись в течение всего периода наблюдения (V суток), при этом концентрация фаговых частиц в образце, полученном через V суток возрастала по срав-нению с предыдущими сутками до 1,18x10 КОЕ\мл (табл. 13).
Из 7 больных с ожоговыми ранами неинфицированными (3 чел.) или конта-минированными Staphylococcus spp. (4 чел.) синегнойньгй фаг выделялся только у 4-х больных, и, главным образом, в течение первых суток, при этом концентрация фаговых частиц значительно снижалась через 4-6 часов после приема препарата. Через V суток синегнойные фаги были обнаружены в раневом экссудате 2-х больных, концентрация фага составляла 10 КОЕ/мл в одном образце и 4 КОЕ/мл в другом.