Введение к работе
Актуальность проблемы. Пневмококковая инфекция (ПИ) продолжает оставаться актуальной проблемой детской инфекционной патологии в связи с повсеместным распространением, разнообразием клинических форм, частотой регистрации и тяжестью течения пневмоний, отитов, септицемии и ряда других клинических форм. Существенными являются высокие показатели летальности при пневмококковом менингите (25-50%), частота неврологических осложнений и последующая инвалндизация детей (Жданова Л.Г., 1981; Костюкова Н.Н., 1981; Baylet et al., 1982; Michalcu et at., 1983; Pedersen et al., 1983; Shclech et al., 1984; Velimkovic, 1984; Bolan et al., 1985; Burman et at., 1985; Покровский В.И. и соавт., 1986; Покровская Н.Я. и соавт., 1986, 1987; Beinert, 1988; Finch, 1988; Rotta, 1988; Shen, 1989; Катосова Л.К., 1990; Shann, 1990; Berga, 1991; Gratten et al., 1991; Вишнякова Л.А., 1992; Сорокина M.H., 1992: Волкова M.O., 1993; Qugliarello et al., 1993).
К настоящему времени наиболее исследованы вопросы таксономии, морфолорш и антигенной структуры пневмококков (Костюкова Н.Н., 1981).
В последние годы благодаря успехам иммунологии, генетики, молекулярной биологии установлено, что пневмококки, как и многие другеє микроорганизмы, обладают всеми тремя группами факторов патогенносте, обеспечивающими им колонизационную, инвазивную и токсическую функции (Езепчук Ю.В., 1977, 1985; Костюкова Н.Н., 1989; Boulnois, 1992). Развитие ПИ связывают с адгезивностью штаммов, с их способностью вырабатывать инвазивные факторы (нейраминидазу и гиалуронидазу) и токсический фактор - пневмолизин (Езепчук Ю.В., 1977, 1985; Вишнякова Л.А. и соавтор., 1990; Резцова Ю.В., 1990; Boulnois, 1992; Волкова М.О., 1993). Экспериментально доказана роль степени гаалуронидазной активности в преодолении штаммами пневмококка гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) (Волкова М.О., 1993). Обсуждается значение протеазы пневмококка, способной расщеплять иммуноглобулины Ig Ai, как фактора колонизации (Mulks et al., 1980; Wilson et al., 1981; Kornfeld et al., 1981; LaMarco at al., 1984, Courtney et al., 1987; Костюкова H.H., 1989; Bolnois, 1982), и пневмококкового поверхностного белка А, обеспечивающего ему устойчивость к действию комплемента (Yother et al., 1987; Briles et al., 1988; Crain et al., 1990). Доказана роль капсулы пневмококка в зашите его от фагоцитоза (Davis et al., 1968; Briles et al., 1992; Езепчук Ю.В., 1977). Высказываются предположения, что, помимо пневмолизина, токсическими свойствами обладают поверхностный протеин
4 A (Davis et al., 1988, 1992) и продукты энзимного распада клеточной стенки пневмококка (Tuotnanen et al., 1985; Garsia-Bustos er al., 1989; Thomasz et al., 1989).
Однако результаты изучения патогенных потенций пневмококка не
позволяют комплексно оценить их совместное воздействие на организм.
До настоящего времени все еще распространенной является оценка
патогенності! пневмококков по ЛДсгч для белых мышей при
внутрибрюшинном введении определенных доз возбудителя (Вишнякова Л.А. и соавт., 1988; Резцова Ю.В., 1990). Между тем эта аппликация исключает воспроизведение начального этапа взаимодействия возбудителя с клетками хозяина.
Оценка инвазивных свойств в сочетании с характеристикой адгезивной и токсической функций совершенно необходима для получения объективных представлений о патогенных потенциях пневмококка и природе механизмов взаимодействия возбудителя с макроорганизмом в системе "паразит-хозяин".
Широкое использование антибиотических и других антибактериаль^ ных препаратов существенным образом изменило течение пневмококковых заболеваний, нередко принимающих затяжное течение и рецидивирующий характер (Покровская Н.Я. и соавт., 1987; Сорокина М.Н., 1992). Механизмы формирования затяжных, рецидивирующих форм, в частности гнойных менингитов, менингоэнцефалитов и отитов, активно обсуждаются в современной литературе, однако в большинстве работ эта проблема рассматривается без учета возможности индукции в организме атипичных форм возбудителя, способных к длительной персистенции.
В начале 80-х годов появилась перспектива улучшения микробиологической диагностики ПИ благодаря усовершенствованию и внедрению количественных методов, а также иммунологических тестов обнаружения бактериальных антигенов и антител к ним. Вместе с тем диагностика ПИ все еще не налажена в полной мере в связи с питательными потребностями возбудителя, его изменчивостью, появлением устойчивых штаммов к пенициллину и друпім антибиотикам, разнообразием клинических форм заболеваний, недостатком диагностических препаратов и отсутствием питательных сред отечественного производства.
Следовательно, назрела необходимость комплексного изучения вопросов, касающихся микробиологических и патогенетических аспектов ПИ у детей. Поиск и идентификация биомолекулярных функций патогенности пневмококка, разработка критериев их оценки, системный подход к изучению природы и характера взаимодействия пневмококка и
5 макроорганизма (в системе "паразит-хозяин") составили основу научных исследований в этом направлении.
Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте детских инфекций и связана с НИР института.
Цель исследования. Выявить ведущие факторы патогенности и определить фенотипический профиль изменчивости пневмококков на основе разработки новых и совершенствования существующих методов выделения, идентификации и определения патогенных потенций возбудителя для оценки их значимости в формировании инфекционного процесса.
Задачи исследования. 1. Дать сравнительную характеристику патогенных потенций штаммов пневмококка, выделенных при различных формах ПИ у детей.
2. Изучить основные биологические свойства R-, L- и форм
несбалансированного роста (ФНР) штаммов пневмококка, выделенных от
больных и носителей.
-
Провести комплексную оценку значимости факторов патогенности пневмококков (адгезивных, инвазивных и токсических свойств) при различных формах инфекционного процесса (на клиническом материале и в эксперименте на животных).
-
Изучить особенности взаимодействия пневмококков с организмом хозяина на стадии формирования первичного инфекционного очага.
5. Определить динамику формирования антибиотикорезистснтности
клинических изолятов, изучить их толерантность к бензилпенициллину.
6. Усовершенствовать методы лабораторной диагностики ПИ.
Научная новизна работы. Установлено, что исход взаимодействия в
системе "паразит-хозяин" определяется не столько показателями адгезивности штаммов пневмококка, сколько их пнвазивными и токсическими свойствами. Показатели вирулентности для мышей, гиалуронидазной активности и адгезивности штаммов пневмококка не бывают выражены одновременно в одинаковой степени. Особенности вызываемого ими процесса определяются степенью активности того или иного фактора.
Феномен инвазии является ведущим в патогенезе генерализованных форм ПИ. Он обуславливается либо определенным уровнем гиалуронидазной активности, либо еще неизвестным фактором, которым характеризуются штаммы сероваров 1,2 и 3. Пневмолизин выполняет токсическую функцию при всех формах ПИ, реализуя патологические изменения в организме, степень выраженности которых определяется адгезивной или гиалуронидазной активностью штаммов пневмококка.
Установлено, что степень адгезивной активности пневмококка зависит от штаммовых особенностей возбудителя и наиболее выражена у бескапсульных вариантов пневмококка, выделенных от больных пневмонией и носителей. Капсула пневмококка создает экранируюший эффект в механизме лиганд-репепторного взаимодействия в системе "паразит-хозяин".
Впервые на клиническом и экспериментальном материале доказана способность авирулентных для мышей штаммов (R-форм), обладающихj3 -гемолитической активностью и высокой адгезивностью, вызывать локализованные формы ПИ (например, пневмонию). Полученные данные могут явиться основанием для создания нового поколения пневмококковой вакцины, при конструировании которой целесообразно введение не только капсульных антигенов наиболее распространенных сероваров/серогрупп, но и других антигенных детерминант, например, пневмолизина.
Впервые в эксперименте in vitro показана возможность получения стабильных R-форм пневмококка под действием поверхностно-активных веществ (ПАВ) - 0,5% желчи крупного рогатого скота и 1% дезоксихолата натрия, что имеет значение для объяснения условий R -трансформации пневмококка в организме.
Установлена персистенция атипичных форм возбудителя (в виде L -форм и ФНР) при затяжном и рецидивирующем течении ПИ (менингите и отите), что указывает на их патогенетическую роль в развитии и поддержании инфекционного процесса в организме больного.
Впервые на основе изучения стимулирующего влияния лецитина на рост пневмококка обоснованы предпосылки к раскрытию механизма вторичной колонизации пневмококка в тканях органов (легких и мозга), богатых фосфолипидами, в частности лецитином.
Впервые в стране выявлены штаммы пневмококка, толерантные к бактерицидному действию пенициллина, а также хлорам-фениколрезистентные культуры, инактивирующие хлорамфеникол.
Практическая значимость работы. На основе антипневмококковой сыворотки отечественного производства использована реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) для экспресс-диагностики ПИ.
На принципе ингибиции роста клеток пневмококка препаратом - хинином предложен способ видовой идентификации Streptococcus pneumoniae (S.pneumoniae) (Приоритетная справка №5060421 от 08.10.92).
На основе коммерческого питательного бульона с лецитином создана бессывороточная питательная среда для выделения и культивирования пневмококков (А.с. №1622390 от 22.09.90).
В результате использования методов (цитобактериоскопии и РНИФ), позволяющих выявлять варианты пневмококка, утратившие способность к репродукции на искусственных питательных средах, а также специальных сред для выделения L-форм и ФНР возбудителя расширены возможности установления этиологической роли пневмококка в развитии различных форм ПИ.
Обоснована тактика рациональной этиотропной терапии затяжных и рецидивирующих форм ПИ (менингитов, отитов) с учетом выявления атипичных (L-форм и ФНР) и толерантных к пенициллину штаммов возбудителя.
Реализация результатов исследования. По представленным результатам исследований получено 2 авторских свидетельства СССР на изобретения: "Питательная среда для культивирования Streptococcus pneumoniae" (№1622390 от 15.10.87), "Способ моделирования пневмококковой инфекции" (№1807515 от 10.10.92) (в соавт. с Л.В.Говоровой, М.О.Волковой и Р.А.Насыровым) и 1 приоритетная справка на изобретение "Способ идентификации пневмококков" (№5060421 от 08.10.92), на которую истребован патент.
В процессе выполнения работы подано и признано 12 рационализаторских предложений, в том числе 3 - отраслевого значения.
- методические рекомендации "Метод непрямой иммунофлюоресценции
в ранней диагностике пневмококковой инфекции у детей". - Л., 1989,
утверждены заместителем министра Минздрава РСФСР (в соавт. с
А.П.Батуро, В.В.Ивановой, Г.П.Курбатовой, М.О.Волковой и др.);
методические рекомендации "Диагностика и особенности терапии тяжелых форм острых респираторных заболеваний у детей". - Санкт-Петербург, 1992, утверждены заместителем министра Минздрава РФ (в соавт. с В.В.Ивановой, О.А.Аксеновым, Г.П.Курбатовой, Э.Г.Камальдиновой и др.);
методические рекомендации "Современные методические подходы к микробиологической диагностике гемофильной инфекции". - Санкт-Петербург, 1992, утверждены заместителем министра Минздрава РФ (в соавт. с Е.Н.Ореховой, Н.Г.Лоскутовой, Л.И.Железовой и др.);
- информационное письмо ."Методы выделения и идентификации
пневмококков, выделенных от больных и носителей". - Санкт-Петербург,
1994 (в соавт. с М.О.Волковой, Н.Н.Костюковой, Н.ГЛоскутовой,
Н.А.Ивановым и др.).
Диссертационные материалы реализованы в отраслевой научно-техничекой программе в области медицины С. 14 (02.01.24 подпрофамма 02 "Стрептококковые заболевания", 1986-1988 гг.).
Результаты исследований используются в процессе обучения студентов на кафедрах микробиологии Военно-медицинской академии и Санкт-Петербургской государственной медицинской академий, а также в практической работе бактериологических лабораторий института Педиатрии (София, Болгария) и учреждений саннадзора Санкт-Петербурга.
Апробациц работы. Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на всесоюзных научных конференциях: "Биология возбудителей инфекционных заболеваний и их экспресс-диагностика" (г.Горький, 1986), "Менингококковая инфекция и гнойные менингиты (диагностика, профилактика и лечение)"(г.Архангельск, 1986, г.Новоснбирск, 1990); Всесоюзном съезде врачей-ифекционистов (г.Суздаль, 1992); Межрегиональной научно-практической конференции "Бактериальные инфекции у детей" (Санкт-Петербург, 1992);Ш Национальном конфессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 1992); Объединенном пленуме проблемных комиссий - "Медицинская микробиология" и "Теоретическая и прикладная инфекционная иммуноло -гня, посвященная вопросам персистенции и смешанным инфекциям" (Санкт-Петербург, 1990); XII Lancefield International symposium on Streptococci and Streptococcal diseases (Санкт-Петербург, 1993); заседаниях Всероссийского научного общества эпидемиологов и микробиологов Санкт-Петербурга (1985, 1988, 1990 гг.) и Москвы (1994г.); итоговых научно-практических конференциях НИИ детских инфекций МЗ и МП РФ (Санкт-Петербурга, 1986, 1987, 1988, 1989, 1990, 1992, 1993 гг.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 работ.
Основные положення, выносимые на зашиту. 1. Фенотнпический профиль изменчивости пневмококков (R-, L-формы и ФНР, устойчивые и толерантные к бензилпенициллину штаммы) влияет на течение и исход инфекционного процесса у детей. Отмеченный факт существования атлпичных форм пневмококка в организме больного свидетельствует о функциональной мобильности и пластичности возбудителя, характеризует закономерную и своеобразную форму его адаптации к изменившимся условиям и указывает на необходимость коррекции терапевтической тактики.
2. Исход взаимодействия в системе "паразит-хозяин" определяется не столько показателями адгезивности штамма, сколько его инвазивными и токсическими свойствами. Показатели вирулентности для мышей,
9 піалуронидазной активности и адгезивности штаммов пневмококка не бывают выражены одновременно в одинаковой степени. Особенности вызываемого ими процесса определяются степенью активности того или иного фактора.
-
Степень адгезивной активности пневмококка зависит от штаммо-вых особенностей возбудителя и наиболее выражена у бескапсульных вариантов. Капсула пневмококка создает экранирующий эффект в механизме лиганд-рецепторного взаимодействия в системе "паразит-хозяин".
-
Разработанные - РНИФ на основе сывороток отечественного производства, питательная среда с лецитином и хинин-тест для видовой идентификации S.pneumoniae, а также внедрение питательных сред на PPLO- основе позволяют существенно улучшить диагностику ПИ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 316 страницах машинописного текста, включая 66 таблиц, 21 рисунок; состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов. Список литературы включат 211 отечественных и 283 иностранных источника,