Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Антибиотикорезистентность Neisseria gonorrhoeae: комплексный подход к проблеме (обзор литературы) 17
1.1. Возбудитель гонококковой инфекции 17
1.2. Современный подход к терапии гонококковой инфекции с учетом данных антибиотикорезистентности возбудителя 20
1.3. Механизмы формирования резистентности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам III-го поколения 26
1.4. Современные методы типирования возбудителя гонококковой инфекции .37
1.5. Роль микробиологических методов в изучении чувствительности N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам .44
1.6. Роль информационных технологий в сдерживании антибиотикорезистентности микроорганизмов .47
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
2.1. Штаммы N. gonorrhoeae 52
2.2. Методология изучения чувствительности N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам методом серийных разведений в агаре 53
2.3. Выделение бактериальной ДНК .56
2.4. Методология проведения полноразмерного секвенирования гена penA штаммов N. gonorrhoeae .56
2.5. Методология проведения молекулярного типирования методом NG-MAST 58
2.6. Методология проведения филогенетического анализа штаммов N. gonorrhoeae .61
2.7. Методология проведения математической обработки результатов исследований и разработки моделей прогнозирования распространения антибиотикорезистентных штаммов N. gonorrhoeae .62
Глава 3. Результаты изучения чувствительности штаммов N. gonorrhoeae, выделенных от больных гонококковой инфекцией, к антимикробным препаратам с использованием микробиологических методов 64
Глава 4. Результаты изучения взаимосвязи аминокислотных
замен в структуре пенициллинсвязывающего белка PBP2 N. gonorrhoeae с формированием механизмов развития устойчивости возбудителя к цефалоспоринам III-го поколения .75
Глава 5. Оценка генетического разнообразия штаммов N. gonorrhoeae на основании данных NG-MAST – типирования и филогенетического анализа 84
5.1. Результаты молекулярного типирования штаммов N. gonorrhoeae методом NG-MAST 85
5.2. Результаты филогенетического анализа штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих в Российской Федерации .93
Глава 6. Систематизация фено- и генотипических показателей чувствительности штаммов N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам. 105
Глава 7. Результаты изучения взаимосвязи между молекулярными типами и показателями чувствительности штаммов N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам с использованием математических методов анализа 110
Глава 8. Разработка математических моделей и компьютерной программы для анализа и прогноза распространения антибиотикорезистентных штаммов N. gonorrhoeae 124
8.1. Линейная модель (уравнение линейного тренда) .125
8.2. Линейная регрессионная модель 129
8.3. Компьютерная программа для анализа и прогноза распространения антибиотикорезистентных штаммов N. gonorrhoeae 135
8.4. Оценка качества прогноза распространения штаммов N. gonorrhoeae, нечувствительных к АМП, на территории Российской Федерации .143
Заключение .146
Выводы .159
Список сокращений .161
Список литературы
- Механизмы формирования резистентности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам III-го поколения
- Методология изучения чувствительности N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам методом серийных разведений в агаре
- Результаты филогенетического анализа штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих в Российской Федерации
- Компьютерная программа для анализа и прогноза распространения антибиотикорезистентных штаммов N. gonorrhoeae
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
В настоящее время в Российской Федерации заболеваемость гонококковой инфекцией имеет тенденцию к снижению: если в 1993 году уровень заболеваемости составлял 230,9 случаев на 100 000 населения, то к 2013 году он снизился до 29,8 случаев на 100 000 населения.
Значительное снижение заболеваемости гонококковой инфекцией
достигнуто благодаря активной политике Министерства здравоохранения
Российской Федерации, а также мероприятиям и научным исследованиям,
проведенным Государственным научным центром дерматовенерологии и
косметологии (ГНЦДК) совместно с медицинскими учреждениями
дерматовенерологического профиля Российской Федерации в рамках
федеральных целевых программ «Предупреждение и борьба с заболеваниями социального характера (2002 – 2006 г.г.)», «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями (2007 – 2012 гг.)».
Одной из основных причин медленного темпа снижения заболеваемости
является устойчивость возбудителя гонококковой инфекции к применяемым
антимикробным препаратам (АМП). По данным литературы во всем мире
отмечается высокий уровень резистентности Neisseria gonorrhoeae к
пенициллинам, тетрациклинам, фторхинолонам и макролидам (Nissinen A. et al., 1997; Lee K. et al., 1998; Ye S. et al., 2002; Dan M. et al., 2002; Arreasa L. et al., 2003; Wang S.A. et al., 2007; Tapsall J.W. et al., 2008; Chisholm S.A. et al., 2009; Ahmed M.U. et al., 2010; Cole M.J. et al., 2011; Lahra M.M. et al., 2013; Brunner A. et al., 2014).
На сегодняшний день препаратами выбора в лечении гонококковой
инфекции являются цефалоспорины III-го поколения. Однако в последние годы
публикуются сообщения о появлении штаммов N. gonorrhoeae, резистентных или
малочувствительных к данной группе АМП в разных странах (Whiley D.M. et al.,
2007; Monfort L. et al., 2009; Tapsall J.W., 2009; Ohnishi M. et al., 2011; Cmara J. et
al., 2012; Heymans R. et al., 2012; Martin I. et al. , 2012; Sethi S. et al., 2013; Tibebu
M. et al., 2013). Одними из ключевых моментов в развитии устойчивости
N. gonorrhoeae к цефалоспоринам III-го поколения являются мутации в гене penA
(Ito M. et al., 2005; Takahata S. et al., 2006; Tomberg J. et al., 2010). Этот ген
кодирует белок PBP2, который является мишенью для АМП пенициллинового
ряда. Предполагается, что на механизм снижения чувствительности
N. gonorrhoeae к цефиксиму и цефтриаксону влияет мозаичная структура гена penA, которая, как полагают, является результатом межвидовой генетической рекомбинации N. gonorrhoeae, N. cinera и N. perflava, а также число и сочетание конкретных мутаций (Ito M. et al., 2005). Поэтому выявление аминокислотных
замен в структуре пенициллинсвязывающего белка PBP2, которые могут влиять на развитие устойчивости N. gonorrhoeae к цефалоспоринам III-го поколения, имеет актуальное значение для понимания механизмов формирования устойчивости к данной группе АМП.
С 2002 года по настоящее время на территории Российской Федерации выполняется мониторирование антибиотикорезистентности у циркулирующих штаммов N. gonorrhoeae (Кубанова А.А. и др., 2002, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009; Лесная И.Н., 2011), которое признано мировым сообществом и анализируется под названием RU-GASP (Russian Gonococcal Antimicrobial Susceptibility Programme) (Кубанова А.А. и др., 2010, 2014). Проводимые мероприятия позволяют осуществлять контроль над распространением антибиотикорезистентных штаммов N. gonorrhoeae и адекватный выбор АМП для терапии гонококковой инфекции, что может способствовать сдерживанию формирования устойчивости возбудителя к АМП, особенно к цефалоспоринам III-го поколения, и снижению заболеваемости гонококковой инфекцией.
Одним из приоритетных направлений в изучении
антибиотикорезистентности возбудителя гонококковой инфекции является
использование молекулярных методов исследования, обладающих высокой
дискриминирующей способностью (Сидоренко С.В. и др., 2008; Ilina E.N. et al.,
2010; Unemo M., Dillon J.R., 2011). Имеются единичные сообщения о возможной
взаимосвязи между сиквенс-типами N. gonorrhoeae и устойчивостью
микроорганизма, в частности, множественной устойчивостью, к АМП (Palmer
H.M. et. al., 2005; Unemo M. et. al., 2007; Ильина Е.Н., 2011). Поэтому
значительный интерес представляет исследование генетического разнообразия
штаммов N. gonorrhoeae, распространенных на территории Российской
Федерации, а также сопоставление молекулярных типов N. gonorrhoeae с
профилем их антибиотикорезистентности. Изучение доминирующих сиквенс-
типов штаммов N. gonorrhoeae в определенных географических зонах страны
позволит выявлять и прогнозировать пути распространения
антибиотокорезистентных гонококков.
Вместе с тем прогнозирование появления антибиотикорезистентности микроорганизмов также имеет большое значение для планирования и формирования программ, направленных на предупреждение распространения резистентных штаммов. По мнению авторов (Еремин А.С. и др., 2011), математический подход, используемый в моделировании приобретенной резистентности, в настоящий момент находится в самом начале своего формирования, так как скудные экспериментальные данные и статистика не позволяют выбрать один универсальный способ и составить общие модели. Поэтому прогнозирование осуществимо лишь при наличии большого массива
достоверных данных о чувствительности и генетическом разнообразии микроорганизмов, циркулирующих в Российской Федерации.
Только сочетанное применение традиционных микробиологических и
современных молекулярно-генетических методов для изучения N. gonorrhoeae
позволит получить полноценные фено- и генотипические характеристики
штаммов N. gonorrhoeae, изучить их разнообразие и закономерности
распространения, получить представление о доминирующих механизмах
антибиотикорезистентности, а также прогнозировать развитие
антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae на территории Российской
Федерации.
Цель исследования – изучить микробиологические и молекулярно-генетические характеристики N. gonorrhoeae, разработать математические модели прогнозирования распространения штаммов N. gonorrhoeae, резистентных к антимикробным препаратам.
Задачи исследования
-
Изучить чувствительность к антимикробным препаратам штаммов N. gonorrhoeae, полученных от больных гонококковой инфекцией, за период с 2010 по 2013 годы.
-
Установить взаимосвязь между аминокислотными заменами в структуре пенициллинсвязывающего белка PBP2 N. gonorrhoeae с формированием механизмов развития устойчивости возбудителя к цефалоспоринам III поколения.
-
Оценить генетическое разнообразие штаммов N. gonorrhoeae на основании данных NG-MAST – типирования и филогенетического анализа штаммов N. gonorrhoeae.
-
Изучить взаимосвязь между молекулярными типами и показателями чувствительности штаммов N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам.
-
Разработать математические модели и компьютерную программу для анализа и прогноза распространения антибиотикорезистентных штаммов N. gonorrhoeae.
Научная новизна
Изучена чувствительность штаммов N. gonorrhoeae, выделенных от больных гонококковой инфекцией, к антимикробным препаратам за период с 2010 года по 2013 год, и установлена общая тенденция к снижению числа нечувствительных штаммов N. gonorrhoeae к пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, спектиномицину и азитромицину.
Выявлены и изучены штаммы N. gonorrhoeae с признаками формирования устойчивости к цефтриаксону. Показано, что аминокислотные замены в положениях 346, 505, 511, 517, 567, 575 и 576 белка PBP2 N. gonorrhoeae приводят
к развитию резистентности штаммов к цефтриаксону, а замена глицина на серин в 543 положении белка PBP2 вызывает многократное увеличение устойчивости N. gonorrhoeae к цефтриаксону.
Впервые на репрезентативной выборке с использованием метода NG-MAST и филогенетического анализа проведена оценка генетического разнообразия циркулирующих штаммов N. gonorrhoeae. Обнаружены и описаны новые сиквенс-типы, депонированные в международной базе данных NG-MAST (). Выявлены сиквенс-типы штаммов N. gonorrhoeae, доминирующие на территории Российской Федерации: 225, 228, 285, 437, 807, 2633, 5714, 5958.
Впервые путем сопоставления результатов изучения чувствительности N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам с результатами их молекулярного типирования методом NG-MAST, выделен ряд кластеров N. gonorrhoeae, объединяющих родственные сиквенс-типы и ассоциированных либо с показателями резистентности штаммов N. gonorrhoeae к АМП (резистентные кластеры), либо с показателями чувствительности к АМП (чувствительные кластеры).
Впервые на основании изучения показателей чувствительности
N. gonorrhoeae к АМП, молекулярных типов N. gonorrhoeae и данных их
филогенетического анализа, оценки статистических результатов по
заболеваемости гонококковой инфекцией разработаны математические модели прогнозирования распространения штаммов N. gonorrhoeae, резистентных к антимикробным препаратам.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные данные о микробиологических и молекулярно-генетических свойствах N. gonorrhoeae могут послужить теоретической базой для понимания механизмов формирования устойчивости возбудителя гонококковой инфекции к АМП.
В разработанной базе данных по штаммам N. gonorrhoeae собрана и
систематизирована информация о фено- и генотипических характеристиках
штаммов гонококков, циркулирующих на территории Российской Федерации.
База данных дает возможность анализировать результаты исследований и
своевременно информировать специалистов медицинских организаций
дерматовенерологического профиля об изменчивости N. gonorrhoeae и
резистентности к применяемым АМП, что будет способствовать выбору оптимальной схемы лечения гонококковой инфекции.
Разработанная компьютерная программа для анализа и визуализации данных по лекарственной устойчивости и молекулярному типированию возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), поможет составлять статистические отчеты по состоянию антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae
в различных округах Российской Федерации, прогнозировать распространение резистентности к АМП среди штаммов N. gonorrhoeae, выявлять закономерности возникновения их филогенетических связей и распространения.
Внедрение результатов диссертации в практику
Основные результаты диссертации внедрены в работу отдела лабораторной
диагностики ИППП и дерматозов ФГБУ «Государственный научный центр
дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России. Материалы
диссертационной работы используют в педагогической деятельности кафедры дерматовенерологии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России и кафедры кожных и венерических болезней ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Минздрава России. Программу для анализа и визуализации данных по лекарственной устойчивости и молекулярному типированию возбудителей ИППП используют в практической деятельности ГАУЗ АО «Архангельский клинический кожно-венерологический диспансер» и ГБУЗ «Клинический кожно-венерологический диспансер» Министерства здравоохранения Краснодарского края для своевременного планирования мероприятий по предупреждению распространения гонококковой инфекции в определенном регионе.
Полученные результаты изучения чувствительности N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам положены в основу схем антибактериальной терапии, включенных в Федеральные клинические рекомендации по ведению больных гонококковой инфекцией (2015 г., ).
В международную базу данных NG-MAST ) депонировано 103 вновь выявленных сиквенс-типа N. gonorrhoeae.
Получено свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2014617611 от 29 июля 2014 г. «Программа для анализа и визуализации данных по лекарственной устойчивости и молекулярному типированию возбудителей ИППП».
Положения, выносимые на защиту
1. Наряду со снижением в период с 2010 по 2013 годы в Российской Федерации
общего числа нечувствительных штаммов N. gonorrhoeae к пенициллину,
тетрациклину, ципрофлоксацину, спектиномицину и азитромицину,
установлено наличие высокого уровня чувствительности N. gonorrhoeae к цефтриаксону (100%), при этом процент штаммов N. gonorrhoeae с МПК цефтриаксона, превышавшими значения 0,032 мг/л, варьировал от 0,7% до 10%, что указывает на наличие тенденции к формированию устойчивости к цефтриаксону среди изученных штаммов N. gonorrhoeae.
-
У штаммов N. gonorrhoeae с признаками снижения чувствительности к цефтриаксону выявлены аминокислотные замены в положениях 346 , 505, 511, 517; 543, 567, 575 и 576 пенициллинсвязывающего белка PBP2, что может свидетельствовать о значительном влиянии данных мутаций белка PBP2 N. gonorrhoeae на развитие резистентности штаммов N. gonorrhoeae к цефтриаксону.
-
На территории Российской Федерации выявлено значительное генетическое разнообразие штаммов N. gonorrhoeae, что указывает на высокую скорость накопления мутаций генов por и tbp среди российской популяции штаммов гонококков. Установлена генетическая близость отдельных сиквенс-типов штаммов N. gonorrhoeae, определены общие и доминирующие сиквенс-типы штаммов, распространенные не только в различных федеральных округах страны, но и за рубежом. Это подтверждает возможность переноса данных штаммов между территориями Российской Федерации и в страну из-за рубежа за счет активной миграции населения.
-
Наличие достоверной корреляционной связи между МПК антимикробных препаратов и характеристикой чувствительности к ним штаммов N. gonorrhoeae может свидетельствовать о наличии мультирезистентности N. gonorrhoeae к двум разным АМП в изученных культурах возбудителя. Корреляционный анализ значений МПК каждого АМП в отношении разных штаммов N. gonorrhoeae и свойств кластеров N. gonorrhoeae, полученных в результате филогенетического анализа, выявил ряд кластеров N. gonorrhoeae, которые, видимо, объединяли родственные сиквенс-типы, ассоциированные либо с показателями резистентности штаммов N. gonorrhoeae к АМП (резистентные кластеры), либо с показателями чувствительности к АМП (чувствительные кластеры).
-
На основании имеющихся данных, оценок их надежности, и целей прогноза разработанный спектр прогностических моделей может способствовать выбору адекватной модели. Разработанная программа для анализа и визуализации данных по лекарственной устойчивости и молекулярному типированию возбудителей ИППП позволит в интерактивном режиме проводить ввод, визуализацию, статистический анализ и прогнозирование лекарственной устойчивости штаммов N. gonorrhoeae.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
В работе использованы современные микробиологические и молекулярно-генетические методы исследования, сертифицированные реагенты и лабораторное оборудование. О достоверности полученных результатов исследования свидетельствует репрезентативный объем проанализированных данных и их адекватный статистический анализ.
Диссертационная работа апробирована на научно-практической
конференции ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России, протокол № 3 от 06 ноября 2015 года.
Результаты проведенных исследований доложены на следующих научно-
практических мероприятиях: 17th ISSTDR International society for STD research,
10th IUSTI World congress (Сиэтл, 2007), II Всероссийском конгрессе
дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2007), VI Всероссийской научно-
практической конференции с международным участием «Молекулярная
диагностика – 2007» (Москва, 2007), семинаре-тренинге «Мониторинг
изменчивости и контроля качество лабораторной диагностики возбудителей
ИППП» (Краснодар, 2008), BASHH/ASTDA 3rd joint Conference «Converging
Approaches in STI control and reproductive health» (Нью-Йорк, 2008), Conference on
Sexually Transmitted Infections and HIV/AIDS, 24th IUSTI - Europe (Милан, 2008), Х
Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2008), 18th ISSTDR in
conjunction with BASHH (Лондон, 2009), Научно-практической конференции
«Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до
2020 года» (Москва, 2009), III Всероссийском конгрессе дерматовенерологов
(Казань, 2009), XI Международном конгрессе по антимикробной терапии
МАКМАХ/ESCMID (Москва, 2009), XVII Российском национальном конгрессе
«Человек и лекарство» (Москва, 2010), XII Международном конгрессе по
антимикробной терапии МАКМАХ/ESCMID (Москва, 2010), Областной научно-
практической конференции, посвященная 85-летию Архангельского областного
клинического кожно-венерологического диспансера, «Актуальные вопросы
оказания дерматовенерологической помощи в Архангельской области»
(Архангельск, 2010), Научно-практической конференции «Актуальные вопросы
дерматовенерологии и косметологии» (Томск, 2010), XI Всероссийском съезде
дерматовенерологов и косметологов (Екатеринбург, 2010), IV Российской научно-
практической конференции «Санкт-Петербургские дерматологические чтения»
(Санкт-Петербург, 2010), 25th IUSTI-Europe Conference (Тбилиси, 2010), 2-ом
Континентальном конгрессе дерматовенерологов Международного
дерматовенерологического общества / 4-ом Всероссийском конгрессе
дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2011), 19th ISSTDR (Квебек, 2011), XII Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (Москва, 2012), V Всероссийском конгрессе дерматовенерологов и косметологов (Казань, 2013), XIV Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (Москва, 2014), II Конференции дерматовенерологов и косметологов Челябинской области (Челябинск, 2014), XV Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (Москва, 2015).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 63 научные работы, из них 18 в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России.
Личный вклад автора в проведенное исследование
Автором проведен анализ российских и зарубежных источников литературы
по теме исследования, по результатам которого подготовлен аналитический
обзор. Организовано получение жизнеспособных штаммов N. gonorrhoeae из
медицинских учреждений дерматовенерологического профиля различных
регионов страны. Систематизированы и проанализированы результаты
проведенных микробиологических и молекулярно-генетических исследований,
сформулированы выводы диссертации. Разработан проект базы данных для
систематизации фено- и генотипических свойств N. gonorrhoeae в Российской
Федерации с отбором показателей, которые характеризуют штаммы
N. gonorrhoeae. Создан пул данных по результатам изучения чувствительности гонококков к антимикробным препаратам для разработки математических моделей прогнозирования распространения антибиотикорезистентных штаммов N. gonorrhoeae. Сформированы требования к программе анализа и визуализации данных по лекарственной устойчивости и молекулярному типированию возбудителей ИППП, проведено тестирование системы.
Культуры N. gonorrhoeae получены из медицинских организаций дерматовенерологического профиля регионов Российской Федерации в рамках федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями (2007 – 2012 годы)» подпрограммы «Инфекции, передаваемые половым путем», Государственного задания ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России (наименование работы «Молекулярно-эпидемиологические исследования резистентности возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, на территории Российской Федерации», соглашение 114/БУ-2012-051 от 16.01.2012 г., соглашение 114/БУ-2013-051 от 15.01.2013 г.), Государственного соглашения №14.607.21.0065 «Разработка тест-системы для выявления и анализа лекарственной устойчивости инфекционных агентов, приводящих к нарушениям репродуктивных функций» федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологичного комплекса России на 2014-2020 годы». Микробиологические и молекулярно-генетические исследования проводили в отделе лабораторной диагностики ИППП и дерматозов ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России. Компьютерная программа создана совместно с сотрудниками ФГБУН «Институт вычислительной математики» РАН в рамках федеральной целевой программы «Предупреждение и
борьба с социально значимыми заболеваниями (2007 - 2012 годы)» (Государственный контракт № К-32-НИР/121-3 от 10.11.2011 г.).
Структура и объем диссертации
Работа изложена на 199 страницах машинописного текста и состоит из введения и 8 глав, содержащих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения, выводов, списка сокращений и списка литературы, который включает 303 источника, из которых 69 работ российских и 234 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 38 рисунками.
Механизмы формирования резистентности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам III-го поколения
Гонококковая инфекция, вызываемая N. gonorrhoeae, относится к социально значимым заболеваниям. В настоящее время в Российской Федерации заболеваемость гонококковой инфекцией имеет тенденцию к снижению. В 2013 году ее уровень составил 29,8 случаев на 100 000 населения [56], однако он превышал аналогичные показатели в развитых странах Европы [258].
Впервые, термин гонорея встречается в трудах Галена (130 г. н.э.), ошибочно рассматривавшего выделение гноя при уретрите как «истечение семенной жидкости» (gone - семя и rhoia - теку). Несмотря на то, что термин «гонорея» неверно отражал сущность заболевания, он прочно закрепился в медицине. В немецкоязычных странах это заболевание иногда называют «триппер» (trophen — капля), а во Франции — «бленнорея». О болезненном мочеиспускании и гнойных истечениях из половых органов писали в «Каноне врачебной науки» Авиценна, а также Гиппократ и, позже, Цельс. Филипп Рикор подробно описывал гонорею как отдельную нозологию в «Практическом руководстве по венерическим болезням» (1838), а Альфред Жан Фурнье (1832– 1914) – гонорейный полиартрит и конъюнктивит [68]. В ходе экспериментов, выполненных на здоровых людях, доказано отличие данного заболевания от сифилиса, с которым некоторые врачи смешивали гонорею. Однако открытие возбудителя гонококковой инфекции – Neisseria gonorrhoeae – стало возможным намного позже, в 1879 году (немецкий врач Albert Ludwig Sigmund Neisser) [203]. Neisseria gonorrhoeae – это неподвижный, неспорообразующий, грамотрицательный диплококк, принадлежащий семейству Neisseriacea, роду Neisseria [13, 14, 47]. Все семейство Neisseriacea окисляет диметил- или тетраметил-парафенилендиамин, что лежит в основе оксидазного теста [59, 254]. Гонококки отличаются от других нейссерий по способности расти на селективных средах, ферментировать только глюкозу (не разлагают мальтозу, сахарозу, лактозу), отсутствию роста при низких температурах или на простом питательном агаре [44, 47, 59, 111].
На поверхности N. gonorrhoeae расположены специфические структуры (пили или фимрии), ответственные за адгезию и способность проникновения в клетки и ткани, цитотоксичность и уклонение от защитных механизмов хозяина, как на системном, так и на уровне слизистых оболочек [59, 254]. Также, пили, наряду с другими поверхностными структурами, способствуют формированию устойчивости гонококков к губительному действию нейтрофилов [51, 59, 211].
Оболочка возбудителя гонококковой инфекции состоит из трех слоёв: внутренняя цитоплазматическая мембрана, промежуточный слой пептидогликанов и наружная мембрана, содержащая липоолигосахариды (LOS), фосфолипиды (PL) и различные белки [13, 254, 284].
Белок наружной мембраны - порин (Por), ранее известный как протеин I, играет важную роль в патогенезе гонококковой инфекции [87]. Порин тесно связан с липоолигосахаридами и образует в гидрофобной наружной мембране каналы, пропуская внутрь клетки гидрофильные растворенные вещества. Порин подразделяют на два серовара РIA и РIB, каждый из которых состоит из отличающихся серотипов, что лежит в основе серотипирования возбудителя [51, 59, 111, 165]. По данным литературы, штаммы с сероваром PIA чаще соотносили с диссеминированной формой гонококковой инфекции [89, 288], тогда как штаммы с сероваром PIB связывали с формированием резистентности к АМП [51, 89, 186, 261].
К белкам наружной мембраны относятся протеины непрозрачности (Opa), ранее известные как протеины II [111, 259]. Количество экспрессируемых генов, кодирующих эти белки, может варьировать от нуля до 11, но одновременно не более трёх, и в зависимости от этого колонии могут быть прозрачными или не прозрачными [59, 259]. Opa-протеины повышают способность гонококков к адгезии друг с другом и с различными эукариотическими клетками, включая фагоциты [286], способствуют проникновению возбудителя в эпителиальные клетки [186]. На поверхности эукариотических клеток обнаружены Opa-рецепторы (гепариноподобные и CD66), за счёт которых происходит проникновение гонококков в клетки хозяина [283, 289].
Также к важным белкам наружной мембраны относят восстановительно-изменяемый протеин (Rmp), ранее известный, как протеин-III, который взаимосвязан с Opa-белком и липоолигосахаридами [91, 111]. Данный белок стимулирует выработку блокирующих антител, снижающих антигонококковую бактерицидную активность плазмы крови, что облегчает развитие инфекции при повторном заражении [59, 227, 237].
Липоолигосахариды гонококков состоят из липида А и олигосахаридной цепи, которая в отличие от полисахаридов большинства грамотрицательных бактерий не имеет боковых О-антигенных цепочек [135]. Олигосахариды, входящие в состав липоолигосахаридов, довольно часто подвергаются фазовым и антигенным изменениям как in vitro, так и in vivo, что вносит определённый вклад в патогенез инфекции, включая устойчивость к бактериальным анти-LOS антителам, присутствующим в нормальной плазме [79, 187, 284].
Пептидогликановый слой гонококков также играет роль в воспалительной реакции [59]. По данным Fleming T.J. с соавт., фрагменты пептидогликана обнаружены в стерильной синовиальной жидкости пациентов с синдромом гонорейного артрита-дерматита [127].
Методология изучения чувствительности N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам методом серийных разведений в агаре
Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности генов porB и tbpB сравнивали с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в международной базе данных NG-MAST (http://www.ng-mast.net). При полном совпадении нуклеотидной последовательности исследуемого гена с одной из имеющихся в базе данных аллелей получали ее номер. При отсутствии совпадения результатов секвенирования с имеющимися аллелями, оригинальную хроматограмму секвенирования направляли в международную базу данных NG-MAST для присвоения номера новой аллели. По полученной комбинации номеров аллелей определяли сиквенс тип штамма. Если в базе данных комбинация аллелей отсутствовала, данные направляли международную базу данных NG-MAST для присвоения номера новому сиквенс типу.
Филогенетический анализ штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих в Российской Федерации, проводили путем анализа последовательностей вариабельных участков двух генов N. gonorrhoeae: рorB (ген, кодирующий белок поринового канала) и tbpB (ген, кодирующий трансферрин-связывающий белок), которые являлись объектами исследования при проведении молекулярного типирования N. gonorrhoeae методом NG-MAST.
Филогенетический анализ штаммов N. gonorrhoeae осуществляли в несколько этапов: – определение нуклеотидной последовательности генов porB и tbpB N. gonorrhoeae методом секвенирования по методу Сенгера [246]; – выравнивание последовательностей вариабельных участков генов porB и tbpB N. gonorrhoeae с целью установления позиционной гомологии нуклеотидов в разных последовательностях с помощью программы AlignX из пакета программ Vector NTI 9.1.0, а также с использованием сервера ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/); – построение филогенетического дерева на основании сравнения выровненных последовательностей генов porB и tbpB N. gonorrhoeae при помощи программ AlignX из пакета программ Vector NTI 9.1.0 и программы MEGA 5. 2.7. Методология проведения математической обработки результатов исследований и разработки моделей прогнозирования распространения антибиотикорезистентных штаммов N. gonorrhoeae
Для установления возможной взаимосвязи между молекулярными типами N. gonorrhoeae и антибиотикорезистентностью штаммов N. gonorrhoeae проводили анализ между значениями минимальных подавляющих концентраций каждого из примененных в исследовании антимикробных препаратов и сиквенс-типами N. gonorrhoeae.
Статистический анализ связи между молекулярными типами N. gonorrhoeae и резистентностью штаммов N. gonorrhoeae к АМП, применяемым для лечения гонококковой инфекции, проводили в несколько этапов: – анализ вида распределения уровней резистентности штаммов N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам, применяемым для лечения гонококковой инфекции, и встречаемости молекулярных типов N. gonorrhoeae в исследуемом массиве данных [3]; – анализ корреляций между уровнем антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae и молекулярными типами N. gonorrhoeae в представленном массиве данных [11]; – статистический анализ связи между структурой филогенетического дерева для исследуемых молекулярных типов N. gonorrhoeae и уровнями их резистентности к АМП [65]; – статистический анализ связи между уровнями резистентности штаммов N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам и молекулярными типами N. gonorrhoeae, включая характеристики филогенетического расстояния между штаммами, полученными методом кластерного анализа [2]. На основании изучения молекулярных типов, данных филогенетического анализа и показателей антибиотикорезистентности штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих на территории Российской Федерации, разработаны 2 математические модели распространения штаммов N. gonorrhoeae, резистентных к антимикробным препаратам.
Для построения математических моделей прогнозирования распространения антибиотикорезистентных штаммов N. gonorrhoeae применили уравнение линейного тренда и регрессионное уравнение [41]. При построении моделей учитывали: – показатели минимальных подавляющих концентраций штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих в Российской Федерации, к каждому антимикробному препарату, в динамике – на протяжении 2007 – 2011 гг. [31, 34-36]; – номера аллелей генов por и tbp N. gonorrhoeae и номера сиквенс-типов N. gonorrhoeae в динамике – на протяжении 2007 – 2011 гг. [31, 34-36]; – тенденции изменений резистентности штаммов N. gonorrhoeae к разным антимикробным препаратам на протяжении 2007 – 2011 гг. [31, 34-36]. Для проведения математической обработки результатов и разработки математических моделей прогнозирования антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae использовали: методы ранговой корреляции, наименьших квадратов, уравнение линейного тренда, регрессионное уравнение, коэффициент корреляции модели, пакет прикладных программ Matlab компании MathWorks (анализ данных, моделирование) [65, 2, 160, 248, 41, 11].
Результаты филогенетического анализа штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих в Российской Федерации
С целью выявления возможных механизмов резистентности штаммов N. gonorrhoeae к цефалоспоринам III-го поколения проведено полноразмерное секвенирование гена penA у штаммов N. gonorrhoeae со сниженной чувствительностью и штаммов, высокочувствительных к цефалоспоринам III-го поколения. Основанием для проведения исследований явились данные научной литературы о появлении штаммов N. gonorrhoeae, резистентных к цефалоспоринам III-го поколения, и результаты анализа МПК цефтриаксона российской популяции штаммов (глава 3). Впервые устойчивый штамм Н041 с МПК = 2-4 мг/л зарегистрирован в Японии в 2011 году [213]. Однако в последние годы все чаще публикуются сведения о появлении штаммов N. gonorrhoeae, малочувствительных и резистентных к цефалоспоринам III-го поколения в разных странах мира (Испании, Голландии, Канаде, Вьетнаме, Индии, Пакистане, Франции и др.) [96, 144, 192, 216, 249, 277].
По данным научной литературы, мутации в гене penA влияют на развитие устойчивости N. gonorrhoeae к цефалоспоринам III-го поколения [157]. Этот ген кодирует пенициллинсвязывающий белок PBP2, который является мишенью для АМП пенициллинового ряда. Авторы считают, что на механизм снижения чувствительности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам III-поколения влияет мозаичная структура гена penA, которая, по-видимому, является результатом межвидовой генетической рекомбинации N. gonorrhoeae, N. cinera и N. perflava, а также количество и сочетание конкретных мутаций [157]. По данным отечественной литературы исследования, направленные на изучение роли мутаций в гене penA N. gonorrhoeae в формировании резистентности микроорганизмов к цефалоспоринам III-го поколения, в России не проводили.
Для выявления особенностей молекулярной структуры белка PBP2 в зависимости от уровня чувствительности штаммов N. gonorrhoeae к цефтриаксону изучены: 30 штаммов, с признаками снижения чувствительностью к цефтриаксону (МПК цефтриаксона у данных штаммов составила 0,03, 0,06, 0,12 и 0,25 мг/л, и превышала МПК высокочувствительных штаммов N. gonorrhoeae в 30, 60, 125 и 250 раз, соответственно) и 20 высокочувствительных к препарату штаммов N. gonorrhoeae (МПК = 0,002 мг/л). Штаммы N. gonorrhoeae отобраны из «Коллекции штаммов и генетического материала возбудителей ИППП» ГНЦДК. Принадлежность к виду N. gonorrhoeae подтверждена с вероятностью 99% у всех штаммов. ДНК для изучения гена penA, кодирующего пенициллинсвязывающий белок цитоплазматической мембраны (PBP2), выделяли из чистых культур N. gonorrhoeae.
В результате секвенирования получено 50 нуклеотидных последовательностей гена penA для штаммов N. gonorrhoeae с высокой и сниженной чувствительностью к цефтриаксону. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей гена penA гонококков с последующей трансляцией в аминокислотные последовательности PBP2, проведенный с использованием программы MEGA5 и пакета программ BLAST, установил большое число аминокислотных замен в структуре белка PBP2 штаммов N. gonorrhoeae, соответствующих мутациям в гене penA.
Среди штаммов N. gonorrhoeae с высокой чувствительностью к цефтриаксону аминокислотные замены в структуре белковой цепи PBP2 (в положениях 346, 505, 511, 517, 542, 543, 552, 567, 575, 576) выявлены у 16 из 20 штаммов (80%). Четыре штамма оказались «дикими» и мутаций (а, соответственно, и аминокислотных замен) не имели.
У всех штаммов N. gonorrhoeae со сниженной чувствительностью к цефтриаксону аминокислотные замены регистрировали в тех же положениях аминокислотной цепи, что и у высокочувствительных штаммов, а также в положениях 502, 553, 556, 557, 101, 160, 173, 201, 202, 203, 204, 462, 463, 469, 470, 473, 481, 513, 542, 546. Кроме того, 2 штамма имели инсерцию в положении 345 (инсерция Asp-345).
С использованием расчета показателя отношения шансов (OR) и критерия 2 проведен анализ ассоциаций между наличием (по частоте регистрации в двух группах штаммов) отдельных аминокислотных замен в структуре белковой цепи PBP2 и появлением признаков снижения чувствительности штаммов N. gonorrhoeae к цефтриаксону. Выявлены достоверные различия между группами (таблица 8).
На основании проведенного анализа также установлено, что в структуре белковой цепи PBP2 штаммов N. gonorrhoeae с признаками появления резистентности к цефтриаксону достоверно чаще, чем среди высокочувствительных штаммов, встречались аминокислотные замены в положениях: - 346 (D346), 505 (F505L), 511 (A511V), 517 (A517G) (у 93,3% штаммов с признаками снижения чувствительности и у 50-60% высокочувствительных штаммов); - 543 (G543S), 567 (I567V), 575 (N575), 576 (A576V) (у 60% штаммов с признаками снижения чувствительности и у 25% высокочувствительных штаммов); Замена 552 (P552L) выявлена у 23,2% штаммов с признаками снижения чувствительности и у 5% высокочувствительных штаммов. Однако анализ ассоциаций показал, что связь между этой заменой и снижением чувствительности гонококков к цефтриаксону статистически не достоверна (р 0,05).
Напротив, в группе высокочувствительных штаммов (у 6 из 20 штаммов, 30%) достоверно чаще выявляли аминокислотную замену в положении 542 (H542N), а среди штаммов с признаками резистентности – у 2 (6,7%) из 30 штаммов ( OR = 0,17 , S = 0,88, CI = 0,03; 0,94, 2 = 4,9, p 0,05).
Компьютерная программа для анализа и прогноза распространения антибиотикорезистентных штаммов N. gonorrhoeae
Для изучения направлений эволюционного преобразования и степени родства между штаммами возбудителя гонококковой инфекции проведен филогенетический анализ штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих на территории Российской Федерации, путем определения последовательностей вариабельных участков двух генов N. gonorrhoeae рor (ген, кодирующий белок поринового канала) и tbp (ген, кодирующий трансферрин-связывающий белок), которые явились объектами исследования при проведении молекулярного типирования N. gonorrhoeae методом NG-MAST.
Основным инструментом филогенетического анализа штаммов возбудителей является сравнение первичных последовательностей близких по структуре или по функции генов (или белков) микроорганизмов, восстановление списков эволюционных событий (замен нуклеотидов, делеций и вставок) в предковых линиях этих макромолекул, заканчивающееся построением филогенетических деревьев (дендрограмм) [42]. Филогенетическое дерево состоит из вершин и ребер (ветвей). Вершины обозначали таксономические группы (гены porB и tbpB N. gonorrhoeae), а ребра -отношение родства. Длина ребра отражает число эволюционных изменений (эволюционную дистанцию), произошедших во времени между штаммом -потомком и штаммом - предком и позволяет оценить степень клонального родства между штаммами.
В результате построения дендрограмм можно определить штамм – родоначальник и его носителя, эволюционные связи штаммов и степень родства между ними, наиболее представительные и наименее представительные кластеры штаммов [42]. Кроме того, можно установить возможные пути распространения изолятов в пределах отдельных регионов и между регионами, зная их происхождение (географическое).
Для филогенетического анализа микроорганизмов необходимо наличие определенного уровня изменчивости генов. Мутации, делеции и вставки являлись своего рода метками (маркерами), благодаря которым можно восстановить пути эволюции современных форм макромолекул. При этом в качестве таких маркеров выступают отдельные нуклеотидные позиции определенного гена.
С помощью филогенетического анализа внутрипопуляционных генетических различий штаммов N. gonorrhoeae установлено несколько важных особенностей. Определено, что для российской популяции гонококков характерна иерархичная структура кластерных построений. Кластеры, объединявшие родственные сиквенс-типы штаммов N. gonorrhoeae, по степени родства и сложности структуры делились на более мелкие субкластеры. Крупные кластеры включали несколько субкластеров.
Филогенетический анализ штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих в Российской Федерации, выявил 5 крупных, 9 средних и 13 мелких кластеров. Эволюционно выборка российских штаммов N. gonorrhoeae дивергировала в одном направлении, разбиваясь на кластеры и субкластеры, но при этом выделялся 1 кластер, состоявший из 27 штаммов, который был эволюционно дистанцирован от остального массива микроорганизмов. Учитывая, что входившие в состав данного кластера штаммы N. gonorrhoeae выделены в основном в Южном федеральном округе, можно предположить, что штамм – предшественник (родоначальник) этого кластера привнесен в Российскую Федерацию извне.
В результате филогенетического анализа штаммов N. gonorrhoeae, выделенных в пределах одного федерального округа, установлена внутрипопуляционная генетическая гетерогенность кластерных построений штаммов N. gonorrhoeae, индивидуальная для каждого федерального округа. На рисунке 16 представлено филогенетическое дерево, на котором отражена популяции N. gonorrhoeae Центрального федерального округа (ЦФО). У 54 штаммов N. gonorrhoeae, выделенных в ЦФО, выявлено 25 сиквенс-типов. Наиболее представленными являлись сиквенс-типы 807 (13%) и ST 5937 (14,8%), т.е. можно предположить, что популяция штаммов N. gonorrhoeae в ЦФО относительно гомогенна. Это подтверждено результатами филогенетического анализа штаммов из данного округа. Выборка штаммов N. gonorrhoeae содержала 4 крупных и 3 мелких кластера, при этом эволюционное расстояние между кластерами относительно небольшое (эволюционное расстояние 0,005), что подтвердило гомогенность выборки.
При исследовании 52 штаммов N. gonorrhoeae, распространенных в Южном федеральном округе (ЮФО), определено 30 сиквенс-типов. Филогенетический анализ выявил 10 приблизительно равных кластеров (рисунок 17), что свидетельствует о гетерогенном и мозаичном распределении сиквенс-типов в данном округе.
У 66 штаммов N. gonorrhoeae, выделенных в Северо-Западном федеральном округе, выявлено 38 сиквенс-типов. Наиболее распространенными являлись сиквенс-типы 228 (10,6%), 285 (9,1%) и 1523 (7,6%). На дендрограмме (рисунок 18) можно выделить 3 крупных и 8 мелких кластеров. Несмотря на большое количество сиквенс-типов, филогенетический анализ показал, что эволюционно штаммы не сильно удалены друг от друга (эволюционное расстояние 0,01).
При изучении 50 штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих на территории Дальневосточного федерального округа, определено 35 сиквенс-типов. Наиболее часто встречающимися явились сиквенс-типы 673 (8%), 2905 (8%) и 6182 (6%). Филогенетический анализ выявил 3 крупных (рисунок 19), эволюционно близких кластера, а также ряд мелких подкластеров (эволюционное расстояние 0,05).
У 50 штаммов N. gonorrhoeae из Сибирского федерального округа обнаружено 30 сиквенс-типов. Наиболее распространенными сиквенс-типами явились сиквенс-типы 228 (8%), 5940 (8%), 5941 (10%), 5943 (8%), 5948 (8%) и 5958 (8%) вместе составляющие 50% выборки. Филогенетический анализ показал 3 крупных и 2 мелких кластера (рисунок 20), эволюционно удаленных друг от друга.
При исследовании 52 штаммов N. gonorrhoeae из Уральского федерального округа установлено 16 сиквенс-типов, из которых наиболее часто встречались сиквенс-типы 228 (7,7%), 437 (15,4%), 5958 (7,7%) и 6185 (9,6%). Филогенетический анализ показал, что, несмотря на малое разнообразие сиквенс 96 типов, выборка достаточно гетерогенна. На дендрограмме можно выделить 5 крупных и 2 мелких кластера, эволюционно удаленных друг от друга (рисунок 21).
У 55 штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих в Приволжском федеральном округе, определено 26 сиквенс-типов. Наиболее представленными сиквенс-типами являлись 3158 (10,9%), 5714 (10,9%) и 5824 (9,1%). Филогенетический анализ выявил гетерогенность среди штаммов, распространенных на территории округа. На рисунке 22 можно выделить 4 крупных и 3 мелких кластера, эволюционно удаленных друг от друга. При изучении 50 штамма N. gonorrhoeae из Северо-Кавказского федерального округа установлено 19 сиквенс-типов. Малое количество сиквенс-типов может говорить об однородности, что подтверждено филогенетическим анализом. На дендрограмме определены 4 крупных кластера (рисунок 23), которые составили 70% выборки. На основании филогенетического анализа установлена генетическая близость между отдельными сиквенс-типами штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих внутри различных округов Российской Федерации. Это подтвердило результаты, полученные методом NG-MAST, которые свидетельствовали о возможности переноса этих сиквенс-типов между территориями Российской Федерации за счет миграции населения (туризм, деловые поездки, миграция беженцев, военнослужащих и т.д.).