Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 14
1.1 Внебольничные пневмонии у лиц пожилого возраста Роль штаммов Streptococcus pneumoniae в развитии инфекций нижних дыхательных путей у пожилых людей 14
1.2 Факторы риска развития пневмонии у лиц пожилого возраста 15
1.3 Особенности этиологической структуры возбудителей инфекций респираторного тракта у лиц пожилого возраста 17
1.4 Факторы вирулентности Streptococcus pneumoniae 18
1.5 Особенности антимикробной резистентности пневмококков 22
1.6 Лечение внебольннчных пневмоний пневмококковой этиологии у лиц пожилого возраста 28
1.7 Особенности микробиологического исследования при диагностике этиологической структуры инфекций респираторного тракта 30
1.8 Устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам микроога-низмов, выделенных при микробиологической диагностике инфекций респираторного тракта у лиц пожилого возраста 33
1.9 Распространение эпидемического варианта Streptococcus pneumoniae 34
1.10 Геном Streptococcus pneumoniae 38
1.10.1 SpPHK типирование 38
1.10.2 Мозаичные гены Streptococcus pneumoniae 39
1.10.3 Мультилокусное сиквенстипирование (MLST) 40
1.10.4 Генетические маркерыр/у и lytA 41
1.10.5 Другие генетические маркеры 43
1.10.6 Микробиологический мониторинг пневмококковых инфекци 44
1.10.7 Оценка распространения различных генотипов пневмококка в системе микробиологического мониторинга пневмококковых инфекций 44
1.10.8 Серотипирование штаммов S.pneumoniae 45
1.10.9 Генетические методы микробиологического мониторинга штаммов пневмококка 48
1.10.10 Современные аспекты диагностики пневмокковой инфекции 51
1.10.11 Молекулярно-генетические методы в диагностике пневмокковых инфекций 51
1.10.12 Основные аспекты микробиологических исследовании пневмококковой инфекции при планировании профилактических мероприятий 55
Глава 2 Направления, контингент, материал и методы исследования 59
2.1 Направления исследований 59
2.2 Контингент исследования 64
2.3 Материал для исследования 66
2.3.1 Клинический материал 66
2.3.2 Тест-штаммы 66
2.4 Методы исследования 61
2.4.1 Выделение, идентификация и дальнейшее изучение биологических свойств культур 68
2.5 Определение чувствительности к антибиотикам 70
2.5.1 Диско-диффузионный метод 70
2.5.2 Метод серийных разведений 71
2.6 Серотипирование 71
2.7 Мультилокусное сиквенстипирование MLST 71
2.8 Исследование вирулентности 73
2.8.1 Подготовка клинических образцов для исследования 73
2.8.2 Выделение ДНК микроорганизмов из исследуемых образцов 73
2.8.3 ПЦР идентификация штаммов пневмококка 74
2.9 Статистическая обработка 77
2.9.1 Статистическая обработка цифровых показателей 77
Глава 3 Заболеваемость внебольничной пневмонией лиц пожилого возраста 82
3.1 Анализ заболеваемости внебольничными пневмониями лиц пожилого возраста 82
3.2 Этиология внебольничных пневмоний у лиц пожилого возраста роль штаммов пневмококка в развитии внебольничных пневмоний 85
3.3 Результаты изучения носительства основных возбудителей внебольничных пневмоний у лиц пожилого возраста 90
Глава 4 Микробиологическая характеристика патогенности и устойчивости к антибактериальным препаратам S.pneumoniaey выделенных у лиц пожилого возраста 96
4.1 Факторы патогенности S.pneumoniae 97
4.2 Исследование устойчивости к антибактериальным химиопрепа-ратам 105
4.3 Характеристика устойчивости к антибактериальным химиопре-паратам штаммов S.pneumoniae, выделенных у больных вне-больничными пневмониями ну носителей 106
Глава 5 Мультилокусное сиквенстипирование штаммов S.pneumoniae, выделенных у лиц пожилого возраста Результаты молекулярно генетического мониторинга 114
Заключение 123
Выводы 131
Рекомендации для внедрения в практическое здравоохранение 132
Список сокращений 133
Список литературы 134
- Особенности антимикробной резистентности пневмококков
- Основные аспекты микробиологических исследовании пневмококковой инфекции при планировании профилактических мероприятий
- Результаты изучения носительства основных возбудителей внебольничных пневмоний у лиц пожилого возраста
- Мультилокусное сиквенстипирование штаммов S.pneumoniae, выделенных у лиц пожилого возраста Результаты молекулярно генетического мониторинга
Особенности антимикробной резистентности пневмококков
Устойчивость штаммов пневмококка к антибактериальным химиопрепаратам является одним из факторов, определяющих эпидемиологическую значимость пневмококковых инфекций, обусловленную риском формирования эпидемического варианта. При этом, распространенность устойчивых к антибиотикам штаммов пневмококка является и фактором, обусловливающим выбор антибактериальной химиотерапии [23, 59,76].
При этом, отмечается и повышение числа инфекций, вызванных антибиотикоустойчивыми штаммами, которые чаще всего являются следствием приобретения циркулирующих в данном географическом регионе резистентных штаммов. Кроме того, и пациенты с пневмококковыми инфекциями, и бессимптомные носители могут являться источником подобных штаммов, что в результате приводит к тому, что снижение частоты пневмококковых инфекций в структуре общей заболеваемости не всегда приводит к автоматическому снижению циркуляции резистентных к антимикробным химиопрепаратам штаммов пневмококка среди населения [1-5, 26,43,75].
Общим в микробиологических особенностях развития антимикробной резистентности является то, что основным способом приобретения генетического материала, обусловливающего устойчивость, является трансформация (о с о ода роль здесь приобретает естественное состояние компетентности некоторых штаммов).
Большую роль, по сравнению даже с близкородственными видами, приобретает обмен коньюгативными транспозонами, редкая обусловленность развития устойчивости с участием плазмид или точечных мутаций.
Чаще всего резистентные штаммы встречаются чаще всего у детей независимо от региона проведения исследования. Это объясняется более широким применением антимикробных химнопрепаратов у детей в сочетании с более высоким назофарингеальным носительством и более благоприятными условиями к трансформации [6-9,15,26,79].
Несмотря на то, что для эпидемиологического надзора за развитием устойчивости S. pneumonaie к антимикробным химиопрепаратам было организовано достаточно много программ на уровне национальных проектов, для получения сравнимых данных состояния проблемы является использование данных проекта «AlexanderProject» [47,53, 83].
Международным исследованием «Alexanderproject» (1992-1993) показано, что резистентность к пенициллину в США и странах Европы составила 6-54%. На первом этапе исследования - в 1991-1992 годах-4% пневмококков оказались устойчивыми к эритромицину. На втором этапе во второй половине 90-х у 16-20% умеренно-резистентных пневмкококов наблюдалась резистентность к эритромицину, у 49-57% штаммов. Исследования показали, что в некоторых странах встречается до 35% пневмококков, нечувствительных к пенициллину [132,133,139, 199, 204].
Первые полирезистентные штаммы были обнаружены на юге Африки, затем в Испании-около 60% от исследуемого количества [45]. В настоящее время штаммы выявляются во многих странах. Их количество достигает порядка 25% всех выделяемых штаммов [178, 199, 201]. Испанские исследователи при помощи мультивариантного анализа установили, что использование бета-лактамов в течение 3-х предыдущих месяцев, хронические интоксикации (алкоголизм и курение) и выделение S.pneumoniae из мокроты служат факторами риска по формированию резистентности штамма к пенициллину [227].
Клиническое значение устойчивых штаммов пневмококка чрезвычайно велико, так как отсутствие их эрадикации в локусе инфекции может приводить к увеличению сроков и/или неэффективности антимикробной химиотерапии. В одном из исследований было показано, что летальность при менингитах, вызванных устойчивыми или умеренно-устойчивыми штаммами пневмококка, составила 30% по сравнению с 10% в контрольной группе [160, 196, 239]. Учитывая тот факт, что устойчивость микроорганизмов является селективным фактором по распространению именно антибиотикоустойчивых клонов, то, очевидно, что понимание механизмов устойчивости к антибактериальным препаратам имеет важное клиническое значение. Непосредственное воздействие механизмов устойчивости может привести к общему снижению резистентности, внедрению более эффективных методов диагностики и лечения, что приведет, в свою очередь, к уменьшению летальности по отдельным нозологическим формам пневмококковой инфекциии помочь снизить показатели заболеваемости пневмококковым иинфекциями в целом. Полирезистентные штаммы S.pneumoniae в центральных областях России встречаются нечасто [34, 35, 89]. По данным мультицентрового российского исследования ПеГАС резистентность пневмококка к пенициллину составляет в среднем 7,5%.
Исследователи выделили умеренно-резистентные штаммы, для которых МПК по пенициллину составляет 0,1-1мкг/мл. Данный показатель не составляет клинической проблемы, так как для лечения вполне достаточно дозы пенициллина 150000-200000ЕД/кг [123, 124, 130-135]. Исследования показали, что первым кластером генов, связанным с толерантностью клинических штаммов, является vex/pep27/vncS/R. VncS-VncR является двух компонентной регуляторной системой, используемой для передачи сигнала запуска аутолизина через бактериальную мембрану с помощью пептидинкиназы VncS[38]. VncR, в свою очередь, является регулятором экспрессии гена [205]. В настоящее время считается, что накопление внеклеточного Pep27 определяется системой VncS/R, что приводит к активации аутолизина, вследствие чего мутация в любом из компонентов приводит к развитию толерантности.
По данным большинства авторов, пенициллин-резистентные пневмококки, как правило, устойчивы к ряду других антибиотиков, в том числе к: - макролндам;
- цефалоспоринам;
- ко-тримоксазолу;
- тетрацЕжлинам;
- линкосамидам.
Наиболее эффективными препаратами в отношении пенициллин-резистентных пневмококков являются цефалоспорины третьего-четвертого поколения, гликопептидыинмипенем. Иногда выделяют штаммы, резистентные к цефалоспоринам третьего поколения (цефтриаксон, цефотаксим), но чувствительные или с промежуточной устойчивостью к пенициллину.Чаще всего резистентные штаммы S.pneumoniae относятся к одному из серотипов (B6,9V,14,19f,23F) [184,232].
По данным других исследований, показано, что 25% штаммов S.pneumoniae резистентны к триметоприм/сульфаметоксазолу (ко-тримоксазолу), причем иногда отмечается крайне высокий уровень устойчивости (от 43,8% до 70,9% ); к макролидам-19%, к тетрациклинам-14%, к хлорамфениколу-7%, к клиндамици-ну-6% [3, 47, 144, 183, 210]. Все штаммы S.pneumoniae чувствительны к амоксициллину /клавуланату и ванкомицину. При этом, пенициллинрезистентные штаммы чаще всего являлись полирезистентными по отношению к не бета-лактамным антибиотикам [38,141].
Для S.pneumoniae характерна низкая природная активность ранних фторхинолонов (ципрофлоксацина, пефлоксацина). Хотя, согласно последним исследованиям сохраняется чувствительность к новым (к примеру, моксифлокса-цину), фторхинолонам. При этом, нужно учитывать и возможность последних противостоять отдельным штаммам S.pneumoniae, резистентных к бета-лактамам и макролндам [101, 205, 202]. Относительно механизма формирования резистентности к хинолонам в настоящее время помимо ее основного механизма-мутации в области «хинолонового кармана»-активно обсуждается роль снижения проницаемости внешних структур: клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, а также механизм эффлюкса, что имеет значение, учитывая активное изучение роли пептид огликанового комплекса пневмококка
Активность макролидов в отношении S.pneumoniae различна: эритромицин в 2 раза активнее азитромицина. Устойчивость пневмококков к препаратам ряда макролидов у 75% штаммов связана с наличием механизма эффлюкса ответственные за этот процесс белки, кодируются генами mejA. У 25% штаммов устойчивость к макролндам связана с изменением в рибосомах (опосредованным ферментами метилазами, кодирующимися егт генами. При этом, функциональная активность эффлюкса приводит к резистентности со значением МПК1-32 мкл/мл, а активность метилаз к высокому уровню резистентности-МПК до б4мкл/мл. Доказано, что мутантные штаммы благодаря наличию механизма эффлюкса могут быть подавлены кларитромицином-макролидом с наибольшей активностью в отношении S.pneumoniae [109,167].
Основные аспекты микробиологических исследовании пневмококковой инфекции при планировании профилактических мероприятий
Итак, внебольничные пневмонии пневмококковой этиологии представляют реальную опасность в связи с длительной потерей трудоспособное и и большой летальностью, что представляет собой особенно актуальную проблему именно у лиц пожилого возраста. Учитывая, при этом, увеличение удельного веса в общей структуре населения групп лиц с различной сопутствующей (чаще всего хронической) заболеваемостью, в том числе, и лиц со сниженным иммунным статусом, становится очевидной проблема необходимости пересмотра мер по контролю за распространением пневмококковых инфекций и их лечением. Это связано с изменением вирулентности возбудителя, его чувствительности к антибактериальным препаратам, снижением коллективного иммунитета.
Тем не менее, в литературе не разработан аспект, оценивающий влияние сопутствующей заболеваемости (коморбидности) на развитие пневмококковых инфекций в той или иной группе населения, что значительно осложняет как выбор рациональной терапии, так и организацию профилактических мероприятий по развитию пневмококковых инфекций у каждого отдельного больного с учетом данных анамнеза. Даже при наличии данных о высеваемости возбудителя в той или иной группе населения, среди той или иной категории больных и носителей, не представляется возможным сделать реальный прогноз о развитии осложнений, которые могут возникнуть после перенесения пневмококковой инфекции. Это не позволяет реально оценить болезненность (пораженность) населения и предпринять меры по ее снижению,что чрезвычайно актуально именно у лиц пожилого возраста как одной из многочисленных и социально активных групп.
Фактически индивидуальные нарушения иммунного статуса у больных из групп риска по пневмококковым инфекциям, требуют пересмотра стандартного подхода к диагностике и антибактериальной терапии пневмококковых инфекций у данных больных. Кроме того, отсутствуют данные многоцентровых эпидемиологических исследований в Российской Федерации, не позволяя оценить данные о преобладании того или иного серотипа пневмококков, вызывающих ннвазивные и неинвазивные формы инфекции тех или иных регионов. Особенно актуальными эти данные были бы, учитывая глобальное распространение эпидемически значимых клонов S.pneumoniae, для определения возможной эффективности имеющихся в настоящее время вакцинных препаратов против пневмококковой инфекции, что может сыграть чрезвычайно важную роль в профилактике инфекций нижних дыхательных путей у лиц пожилого возраста Другой немаловажной проблемой является появление устойчивых к различным классам антибактериальных препаратов штаммов пневмококка, что заметно осложняет терапию данной инфекции, особенно у больных пожилого возраста, что, естественно, требует коррекции общепринятого стандарта антибактериальной химиотерапии. Чрезвычайно быстрая способность пневмококка к развитию устойчивости к антибактериальным препаратам, приобретает дополнительную актуальность именно у носителей, имеющих в анамнезе различные хронические заболевания, а также заболевания, сопровождающиеся иммунодефицитами различной этиологии и требующих базисной антибактериальной химиотерапии.
Очевидно, что пластичность генома этого микроорганизма, обилие механизмов образования устойчивости к антимикробным химиопрепаратам будет обусловливать у данной категории населения появление полирезистентных и резистентных штаммов. Эпидемиологические особенности, к которым относится и колонизация пневмококком прежде всего детей до 5 лет, объясняют рост числа инвазивных форм данной инфекции в общей структуре населения.
Кроме того, чрезвычайно интересны были бы исследования популяционной биологии пневмококка, позволившие бы охарактеризовать популяцию микроорганизмов, выделенных, к примеру, в Дальневосточном регионе, с выделением родственных связей между клонами, что позволило бы спрогнозировать распространение эпидемического варианта возбудителя. Предложенные в настоящее время методы типирования, к сожалению, не могут быть применены в регулярных эпидемиологических исследованиях пневмококка по различным причинам. Это связано не только с организационно-экономическими причинами, но и с биологией возбудителя, так как при наличии свойства повышенной естественной компетентности, пневмококк при молекулярно-генетических исследованиях нередко дает перекрестные реакции с близкородственными видами, в частности, из семейства Streptococcaceae, что может привести к ложноположительным результатам. Особенностью генома S.pneumoniae является наличие большого количества различных повторяющихся последовательностей, которые иногда применяются в диагностике, однако их применение ограничено объективными причинами молекулярно-биологического характера: перекрестным реагированием праймеров и встречающихся участков палиндромов, неустойчивостью параметров реакции и т.д.
Не менее актуально и проведение не только многоцентровых, но и региональных эпидемиологических исследований пневмококковой инфекции с изучением молекулярно-биологических особенностей S.pneumoniae, которые позволили бы спрогнозировать появление эпидемически значимых клонов, характеризующихся не только повышенной устойчивостью к антибактериальным химиопрепаратам, но и особенностями в выработке факторов вирулентности. Подобная информация будет критически важной для решения таких задач как рационализация стандарта антимикробной химиотерапии, диагностического процесса и обсуждения перспектив профилактики пневмококковых инфекций нижних дыхательных путей у лиц пожилого возраста,чаще всего представленных внебольннчнон пневмонией, к которой относится быстро развивающаяся во всем мире вакцинация пневмококковыми вакцинами.
Результаты изучения носительства основных возбудителей внебольничных пневмоний у лиц пожилого возраста
Известно, что пожилой возраст характеризуется прежде всего такой особенностью как снижение выработки факторов местного и общего иммунитета, при этом, особое значение приобретает рациональная клиническая оценка такого фактора как формирование носительства штаммов пневмококка, который, по сути своей, является убиквитарным микроорганизмом и зачастую расценивается врачами как комменсал респираторного тракта человека. Темне менее, для того, чтобы оценить носительство штаммов S.pneumoniae и определить его роль в развитии инфекций респираторного тракта у пожилых, мы обследовали на носительство 100 пациентов, обратившихся в поликлинику Госпиталя ветеранов на плановую диспансеризацию, и не имевших в момент обследования инфекций респираторного тракта. Полученные данные представлены в Таблице 9.
Таким образом, исходя из представленных данных, можно сделать вывод, что носительство пневмококка, особенно в тех случаях, когда его можно диагностировать классическим бактериологическим методом, остается основным фактором риска возникновения инфекций респираторного тракта у лиц пожилого возраста. Это подтверждается прежде всего тем, что и у мужчин и у женщин в соответствующих возрастных группах наблюдаются коррелирующие друг с другом изменения в динамике носительства S.pneumoniae. Дня оценки факторов, определяющих изменения в повозрастной структуре заболеваемости пневмококковыми инфекциями, исходя из доступных нам в анамнезе больных данных, мы посчитали необходимым выделить основные факторы риска по развитию пневмококковых инфекций, которые могут привести к манифестации инфекционного процесса (Таблица 10). Из приведенных результатов следует, что чаще всего в анамнезах больных инвазивнымн пневмококковыми инфекциями встречаются указания на наличие хронической сопутствующей патологии, чаще всего со снижением иммунного статуса (61,01%, ОШ 2,4), что зачастую сопровождается бесконтрольным приемом антибактериальных химиопрепаратов (66,06%, ОШ 1,9) [1, 3 -7, 9]. Из отмечаемой в анамнезе патологии наибольшее значение имеет перенесенный острый отит- его наличие отметили 39,83%, при этом ОШ по пневмококковой пневмонии составило 3,5, перенесенная пневмония была отмечена всего в 28,51% случаев, при этом ОШ составило 2,4 [1-5]. Острый бронхит перенесли 33% обследован- ных нами пациентов, при это риск развития пневмококковой пневмонии увеличивается (согласно полученным нами данным) в 2,1 раз [1-9]. Из бытовых привычек наибольшее значение имеет профессиональный риск по развитию заболеваний респираторного тракта - при том, что на наличие профессионального риска указали 45% риск развития пневмококковой пневмонии увеличивается у таких пациентов в 4,4 раза. При этом, такой фактор риска как курение, на наличие которого указали 49% обследованных пациентов, увеличивает риск развития пневмококковой пневмонии в 2,9 раз (надо отметить, что алкоголизм увеличивает риск развития пневмококковоых пневмоний в 4,7 раз, хотя указание на злоупотребление алкоголем было получено всего у 23,7%).
Тем не менее, следует признать, что до сих пор отсутствует комплексный подход к оценке роли факторов риска в развитии инвазивных пневмококковых инфекций: в анамнестических данных достаточно редки, практически отсутствуют указания на сопутствующие заболевания пациента, что не позволяет, в свою очередь индивидуализировать терапию пневмококковых инфекций для каждого больного.
В литературе отмечены основные хронические заболевания и состояния, в случае которых инвазивные пневмококковые инфекции имеют особенное течение, и требуют в свою очередь более детального подхода к рациональной антибактериальной химиотерапии. Это, прежде всего различные иммунодефицит-ные состояния, такие как хроническая патология сердечно-сосудистой системы, органов дыхания у лиц от 55 лет; лица с функциональной или анатомической астенией, хроническими заболеваниями печени, заболеваниями почек с выраженным нефротическим синдромом, лица с выраженным иммунодефицитом, вызванным лейкомой, ми ел о мой, онкологическими заболеваниями, а также лица, находящиеся на поддерживающей гормональной терапии кортикостероидами. Кроме того, немаловажную роль играет и возраст пациента. Учитывая значительную роль таких заболеваний в общей структуре заболеваемости жителей нашего города, можно предположить, что дальнейшая рационализация антибактериальной химиотерапии у больных с хроническими иммунодефицит-ными состояниями является действительно актуальной проблемой.
Одним из решений данной проблемы может является подход, предложенный Charleson М.Е. (1987), позволяющий учитывать влияние сопутствующих заболеваний, возраста и эпидемиологического анамнеза, включая факторы риска, на течение инфекционного процесса с использованием 19 категорий сопутствующих заболеваний. В каждой из них присваивается определенный коэффициент (или индекс) на основе расчета кумулятивного риска исходя из результатов заболеваемости и смертности при той или иной нозологии в течение одного года Дополнительно, при расчете коэффициента Чарльсона (Charleson) учитывался и возраст пациента, что позволило рассчитать данный показатель полностью. Полученные результаты представлены на Рисунке 7.
Из представленных данных, очевидно, что в исследуемой группе выражено преобладание лиц с сопутствующей патологией: лица с коэффициентом " 1" и "1" составляют 36,22% (108 случаев), тогда как лица с коэффициентом ко-морбидности более 1 составляют подавляющее большинство - 63,88% (190 случаев). Данные результаты подтверждают предположение о существующем риске развития пневмококковых инфекций прежде всего у пациентов с различной сопутствующей патологией в том числе и в тех случаях, когдане имеется клинически выраженного снижения иммунного статуса, а отмечается сочетание возрастного фактора и как минимум одного из широко распространенных хронических заболеваний, таких как сердечная недостаточность или ХОБЛ.
Привлекает внимание тот факт, что все случаи пневмонии возникают у пожилых лиц с коморбидностью в пределах 1 до 9, и затем с коморбидностью от 15 до 28. Это позволяет предполагать наличие определенных факторов, детерминирующих развитие инфекционного процесса, приводящего к развитию внебольничной пневмонии пневмококковой этиологии у лиц пожилого возраста Таким образом, очевидным является тот факт, что внебольничные пневмонии пневмококковой этиологии у лиц пожилого возраста являются актуальной проблемой современного здравоохранения, что требует особенно детального отношения в плане организации микробиологической диагностики с целью рационализации идентификации штаммов S.pneumoniae, что позволит своевременно диагностировать пневмококковые пневмонии у лиц пожилого возраста, и, соответственно, рационализировать терапию и меры специфической профилактики.
Мультилокусное сиквенстипирование штаммов S.pneumoniae, выделенных у лиц пожилого возраста Результаты молекулярно генетического мониторинга
Основным методом, позволяющим обеспечить решение задач эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями, является, прежде всего, микробиологический мониторинг за формированием устойчивости к антибактериальным химнопрепаратам и динамики выработки основных факторов вирулентности выделенных штаммов. Это в полной мере, по нашему мнению, позволяет не только изучить внутрипопуляционные процессы данного вида микроорганизмов, но и оценить возможность появления эпидемического варианта, что особенно важно при увеличении в структуре заболеваемости инвазивных форм пневмококковых инфекций.
Итак, по мнению современных исследователей, одной из основных проблем профилактических мероприятий в отношении штаммов S.pneumoniae является организация мониторинга за антибиотикоустойчивыми штаммами. Особого внимания при этом, требуют штаммы с полирезистентностью.
В связи с отмечаемой в данном случае сложностью проведения эпидемиологического мониторинга за распространением пневмококковой инфекции появляется и другая проблема, актуальная как в эпидемиологическом, так и в клиническом плане: осложняется надзор за распространением полирезистентных штаммов S.pneumoniae, что ведет к применению нерациональной антибактериальной химиотерапии и осложнению эпидемиологической ситуации по пневмококковой инфекции.
Основным методом для решения данной задачи является молекулярно-эпидемиологический мониторинг, наиболее приемлемый вариант, которого в отношении пневмококковой инфекции остается дискутабельным [48,201,202].
Для изучения возможности формирования госпитального полирезистентного штамма S.pneumoniae, имеющего происхождением единый клон, мы провели мультилокусное сиквенстипирование популяций штаммов пневмококков, выделенных в различных биотопах и обладающих различной антибактериальной резистентностью. Для этого мы сравнили популяции полирезистентных и в равном количестве взятых изолятов, выделенных при внебольничных пневмониях (всего 14 штаммов: 7 штаммов, устойчивых к пенициллину и эритромицину, а также 7 штаммов, чувствительных к антибактериальным химиопрепаратам), штаммов, выделенных у пациенов с хроническим обструктивным бронхитом (всего 8 штаммов: 4 штамма, устойчивых к пенициллину и эритромицину и 4 штамма, чувствительных к антибактериальным химиопрепаратам), штаммов, выделенных у носителей (2 штамма, чувствительных к антибактериальным химиопрепаратам и 2 штамма, нечувствительных к антибактериальным химиопрепаратам). Всего в исследование нами было взято 26 штаммов.
Таким образом, при анализе изучаемой нами популяции микроорганизмов, возбудителей пневмококковых инфекций, выделенных от больных 1-й группы (штаммы, выделенные от пациентов с внебольничными пневмониями), 2-й группы (штаммы, выделенные от пациентов с хроническим обструктивным бронхитом) и 3-й группы (штаммы, выделенные от носителей)— методом мультилокусного сиквенстипирования было выявлено, что все штаммы, выделенные во всех трех популяциях, представляют собой родственные изоляты вида Streptococcus pneumoniae, большинство из которых (18 из 26) обладают уникальным генотипом, определяющим наличие одного сиквенс-типа для каждого штамма. При этом можно выделить б кластерных групп, которые содержат штаммы, выделенные от разных больных, обладающие различными молекулярно-эпидемиологическими характеристиками (серотип, устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам), и которые являлись генетически близкородственными
Исходя из результатов, представленных на Рисунке 13, можно сделать вывод, что полирезистентные штаммы формируются при внебольничных пневмониях путем горизонтального переноса генетического материала: это подтверждается наличием двух клональных комплексов, в одном из которых присутствует один полирезистентный штамм, а в другом два. Все это показывает возможность формирования полирезистентности у штаммов пневмококка, выделенных у пациентов с внебольничной пневмонией.
При анализе штаммов, выделенных у пациетов с хронической обструктивной болезнью, можно увидеть уже клонаттьный комплекс, СОСТОЯЩИЙ из трех близкородственных штаммов пневмококка, что позволяет считать вероятность появления полирезистентных и высоковирулентных штаммов у пациентов с хроническим обструктивным бронхитом выше (Рисунок 14).
Анализ распространения близкородственных в генетическом отношении штаммов показывает, что из 4-х полирезистентных, выделенных нами изолятов пневмококка у носителей, 2 являются представителями единого клонального комплекса, что позволяет говорить о том, что и у носителей, в обычных условиях протекают процессы внутрнгеномнои перестройки штаммов, что может привести к формированию госпитального изолята, и, что, соответственно, предполагает планирование профилактических мероприятий.
Сопоставив результаты мультилокусного сиквенсипирования всех полирезистентных штаммов, мы пришли к выводу, что наиболее высока вероятность к осуществлению событий горизонтального переноса в полирезистентных штаммах, выделяющихся у лиц пожилого возраста с хроническим обструктнвным бронхитом, а также в штаммах, выделенных у пациентов с внебольничнои пневмонией (Рисунок 16).
Очевидно, что существующие фенотипические различия в устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам обусловлены различиями в геноме изучаемых штаммов. Данные о чувствительности к антибактериальным химиопрепаратам и результаты мультилокусного снквенстнпнровання приведены в Таблице 16.
Таким образом, анализ генетического разнообразия штаммов S. pneumoniae показал, что среди изученных нами 26 чувствительных и нечувствительных (т.е. умеренно-устойчивых и устойчивых) к пенициллину и эритромицину штаммов было выделено 22 различных сиквенс-типа и 4 клональных комплекса. При этом» 2 комплекса были представлены более, чем одним изолятом
Необходимо отметить, что из 14 штаммов, выделенных у лиц пожилого возраста с внебольничнои пневмонией, б относились к профилю Taiwan-19F, из них 4 обладали одинаковым профилем резистентности: бьілиустойчивьшитіро-межеточными к пенициллину, эритромицину, тетрациклину и клиндамицину. До настоящего времени известно, что штаммы пневмококка этого профиля являются достаточно распространенными в странах Азии (особенно Дальнего Востока), Южной Африки и средиземноморских стран Европы, в последних, впрочем, они идентифицируются сравнительно нечасто. Как правило, распространение штаммов этого профиля связано с интенсивной миграцией населения, а также скученностью проживания, равно как и с возможным действием пока не определенных селективных факторов. Очевидно однако, что преобладание этих штаммов в группе, выделенной от пациентов пожилого возраста с внебольничнои пневмонией, говорит об уникальности фенотипических свойств в изучаемой нами группе, так как по данным литературы, штаммы S.pneumoniae профиля Taiwan-19F чаще всего все же идентифицируются у пациентов с носительством или с заболеваниями верхних дахытельных путей [170,175,180].
Среди штаммов, вызвавших у лиц пожилого возраста ХОБЛ, методом мультилокусного сиквенстипирования было идентифицировано 3 идентичных сиквенстипа (из 8 штаммов), которые, тем не менее, принадлежали к одному профипю Taiwan-23 F и характеризовались единственным отличием от штаммов профиля 19F наличием различий в гене ddl (Таблице 16). Во многом это подтверждает роль штаммов профиля Taiwan у пациентов пожилого возраста в г.Владивостоке: действие селективных факторов и определяет, скорее всего, нуклеотидную замену, ведущую в том числе, и к смене серотипа, а также изменению фенотипических свойств (в частности, адгезивной способности микроорганизма), что напрямую связано с возможностью реализации инфекционного процесса при обструктивной болезнилегких.
Несмотря на небольшую выборку, штаммы, выделенные от носителей, оказались фенотипически неоднородными: 2 штамма были умеренно-устойчивы к пенициллину и 2 штаммы чувствительны. При этом, все 4 штамма были нечувствительными к эритромицину. Мультилокусное сиквенстипирование показало идентичность нуклеотидного состава штаммов данной группы с сиквенстипом штамма R6.
Таким образом, MLST в настоящее время рассматривается как наиболее точный метод дифференцировки стрептококков и идентификации S. pneumoniae и один из важнейших инструментов микробиологического мониторинга штаммов этого микроорганизма, что позволяет провести типирование и дать прогноз относительно появления штаммов с новыми свойствами, которые в перспективе могут стать госпитальными нзолятамн и потребовать совершенно новых мероприятий в отношении эпидемиологического надзора