Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на достигнутые успехи в области биологии и медицины, прогресса в молекулярной биологии и генетике, брюшной тиф остается серьезной проблемой для здравоохранения всего мира. По данным ВОЗ, только в развивающих странах ежегодно регистрируются более 33 млн. случаев этой инфекции, из которых около 500 тыс. заканчиваются смертельно. Эти же страны представляют эпидемиологическую опасность и для экономически развитых государств, так как являются потенциальными источниками "завоза" возбудителя заболеваний через туристов и эмигрантов (Guckel С, 1995).
Высокие показатели заболеваемости в экономически отсталых странах обусловлены осложненными социально-экономическими, экологическими и санитарно-эпидемиологическими факторами, оказывающими отрицательное воздействие на организм людей. К таким факторам относятся неудовлетворительные бытовые условия, широкое использование недоброкачественных в санитарном отношении продуктов и воды, содержащих многообразные химические соединения - нитраты и пестициды. Химические соединения, используемые в сельском хозяйстве, попадая во внешнюю среду, накапливаются в воде, почве, растениях, в организме человека и животных. Объектом их воздействия, наряду с микрофлорой почвы и воды, становятся и патогенные для человека микроорганизмы, в том числе возбудители кишечных инфекций. В этой связи практически важным является оценка действия на микробы химических соединений, оказывающих наибольшее влияние на экологическую обстановку в данной местности (Schoen S.R., at. al., 1987). Известно, что в защите энтеропатогенных бактерии от отрицательного воздействия неблагоприятных факторов участвуют многочисленные специфические белки. Например, устойчивость некоторых представителей семейства Enterobacteriacea к алкилирующим агентам обеспечивается двумя гуанин метилтрансферазами, кодируемыми генами ada и ogt, а устойчивость к УФ и большинству химически мутагенных факторов регулируется продуктами генов umuD и штшС (Perry K.L., at. al., 1985; Yamada M., at. al., 1995). Показано, что значение специфических белков, кодируемых вышеперечисленными генами, для бактерий конкретного вида или серотипа неодинаково. В этом плане из представителей семейства Enterobacteriacea наиболее изученными являются S.typhimurium и E.coli (Abril N., at., 1995). Вместе с тем, несмотря на широкое распространение возбудителей тифо-паратифозных заболеваний в окружающей среде, генетические механизмы, обеспечивающие их длительную жизнеспособность вне организма человека, практически не изучены.
Широкое распространение брюшного тифа в значительной мере связано и с низкой эффективностью существующих микробиологических методов лабораторной идентификация сальмонелл, которые не всегда позволяют выявлять различные измененные варианты возбудителя. Измененные варианты число которых постоянно увеличивается затрудняют не только микробиологическую диагностику, но и вызывают клинически атипичные формы брюшного тифа, что осложняет постановку предварительного диагноза, своевременность выявления и изоляцию источника инфекции (Морозова Н.С., 1982; Hofer Е., at. а!., 1990). В последнее время отмечено накопление в человеческой популяции штаммов S.typhi, резистентных к различным химиотерапевтическим препаратам. До недавнего времени, считалось, что брюшнотифозные сальмонеллы менее устойчивы к антибактериальным препаратам, чем другие представігтели семейства Enteriobacteriaceae, а главным препаратом для лечения брюшного тифа являлся хлорамфеникол. Однако, в последнее время сообщается о нарастании удельного веса полирезистентных, в том числе, устойчивых к хлорамфениколу штаммов S.typhi (Sheorey H.S., at al„ 1993;RathoreM.N., at. al., 1996).
Особенно остро на сегодня эта проблема стоит в Таджикистане. По данным Таджикского госсанэпндцентра, начиная с 1992 года в этом государстве наблюдается ежегодное повышение показателя заболеваемости, причем с большим количеством летальных исходов. Последняя эпидемия длится более 2-х лет, и показатели заболеваемости стабильно сохраняются на одном уровне.
Вышеизложенное повышает социальное и общемедицинское значение исследований S.typhi, как в плане необходимости улучшения диагностики тифо-паратифозных заболеваний, так и с точки зрения исследования молекулярных механизмов регуляции свойств данного паразита. Следовательно, комплексное изучение S.typhi актуально не только с научной, но экономической и социальной точек зрения.
ЦЕЛЬ настоящей работы состояла в сравнительном анализе микробиологических и молекулярно-генетических методов идентификации штаммов S.typhi, а также осуществлении генетического анализа хромосомной ДНК и отдельных генов сальмонелл, принадлежащих к различным серотипам и вариантам .
1. Провести эпидемиологический и микробиологический анализ штаммов S.typhi, выделенных от больных брюшным тифом и бактерионосителей, изолированных из различных материалов: кровь, желчь, испражнения, моча.
2. Определить биологические особенности штаммов S.typhi, циркулировавших в разных
экологических и климатических регионах. Провести дифференциацию штаммов S.typhi по
комбинации их фенотипических признаков.
-
Подвергнуть молекулярно - генетическому анализу представителей различных ферментоваров, фаговаров, а также морфологически и биохимически измененных вариантов S.typhi, используя для этой цели полимеразную цепную реакцию и риботипирование
-
Сконструировать штамм S.typhi, мутантный по ogt - гену. Провести молекулярно-эпидемиологическое исследование распространенности ogt гена в штаммах сальмонелл, принадлежащих к различным серотипам и вариантам. Изучить воздействие на сконструированный мутантный штамм различных физических и химических факторов, а также антибактериальных препаратов.
-
Разработать современный ускоренный способ идентификации штаммов сальмонелл с использованием молекулярно-генетических методов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА работы состоит в том, что:
1. Впервые дана комплексная сравнительная характеристика биологических
свойств возбудителей брюшного тифа, циркулировавших у людей, проживающих на территориях
с различными природно-климатическими условиями. Предложен набор субстратов для тонкой
дифференцировки ферментативной активности штаммов S.typhi.
-
Впервые проведен сравнительный молекулярно-генетический анализ хромосомных ДНК штаммов S.typhi, выделенных в разные годы, от больных и бактерионосителей, из различных материалов (кровь, желчь, моча, испражнения) в разных природно-климатических территориях.
-
Впервые разработан ускоренный молекулярно-генетический способ индикации и идентификации морфологически, биохимически и серологически типичных, а также измененных вариантов сальмонелл - возбудителей сальмонеллезных и тифо- паратифозных заболеваний посредством полимеразной цепной реакции.
4. Впервые сконструирован штамм S.typhi, мутантный по ogt -гену и показано, что ген
ogt регулирует не только адаптивный ответ на алкильное повреждение, но и участвует в
формировании устойчивости к другим физическим и химическим мутагенным агентам, а также
к различным аіггибактериальньш препаратам.
Путем интегративного мутагенеза создание штамма S.typhi, мутантного по ogt -гену позволило выяснить генетические механизмы, обеспечивающие резистентность данных бактерий к различным факторам окружающей среды. Показано, что штаммы S.typhi, дефектные по ogt - гену, приобретают гиперчувствительность к различным физическим и химическим факторам, в том числе к различным противомикробным препаратам. Установлено, что некоторые пестициды в субингибирующих концентрациях влияют на процесс взаимодействия штамма S.typhi, дефектного по ogt-гену с антибиотиками. Ключевая роль белка, кодируемого ogt - геном, в репарационных процессах S.typhi указывает на перспективность создания новых лекарственных препаратов, специфически ингибирующих данный бактериальный белок.
Разработана ускоренная идентификация сальмонелл методом экспресс-ПЦР, который позволяет за достаточно короткий срок (3-4 часа) выявлять и дифференцировать как типичные, так и морфологически и биохимически измененные варианты сальмонелл. Ценность данного метода заключается в том, что наряду с типовой или внутрисеротиповой дифференцировкой, он дает возможность сравнения различных штаммов с целью выяснения их эпидемических и эволюционных связей. Усовершенствована схема биотипирования брюшнотифозных сальмонелл, в результате чего повышено качество внутрисеротиповой дифференцировки S.typhi. Полученные результаты могут быть использованы как в бактериологической, так и в эпидемиологической практике.