Введение к работе
Актуальность проблемы. В структура возбудителей стафилококковых инфекций золотистей стафилококк (з.еигеиа ) остается лиди-рущнм этиояогическтаа фаетороа. Спектр проявлений клинических фору, связанные со стафнлокохковшж заболеваниями, широк и многообразен. Это обусловлено способностью s.aureus продуцировать во знешниэ среду большое количество эЕзонродукгсв - токсинов и ферментов, ЕграяЕих ведущув роль в патогенезе стафилококковых инфекций.
Сравнительно недавно установлено, что некоторые штакаы S.auraus способны цродуцкровать особое вещество белковой природа, обладащее гокскчєсзеїін'свойствами ( a.s.Bergdoil at ai ., 1981; P.M.Schlie-vert et al' .. 1981). Ьию воказано, что данный белок отличается от ззвесшк токсинов и играет главную роль в патогенезе синдром токсического шока (M.s.Bergdoll , P.M.Sohiie-vert , 1984), вследствие чего новий токсин получил название ~
ЭКЗОТОКСИН ЯОКСНЧеСКОГО ЕОЕЭ (ЭТИ).
Синдром токсического шока (СТШ), этиологически связанный со шгакиагщ золотистого стафилококка, 'впервне был зарегистрирован в США. в 1978 г. (J.K.Todd at al';, 1978) как новое инфекционное заболевание, пораяащее преЕмущественко молодых ненщин, детей и лиц с Еослеодерапдоннв'лн ослозне-шизгаа стафилококкового генеза. В настоящее время СП встречается во многих странах (H.s.Bergdoil , P.J.Chstsney , 1991).
Значительный интерес к отому заболевают обусловлен крайне тягеяка течением, высокой частотой летальных всходов в сочетании с отсутствием ввдезных методов лабораторной диагностики, профилактики я лечения.
Установлено, что ЭТИ цродуцарувдие штамкы s.aureus широко распространены я выявляются с частотой от 15,6 % да 52,2 % (U.s.Bergdoil , p.j.Chesnoy , 1991; П.Ф.Пс-кар а др., 1989).
Для эбваруаення штамиов S.aureus , ответственных за развитие синдрома токспческого пока, предложены различные кетсды тестирования ( игаунофермектннн аналіз, радаоЕшуннкй анализ, реакция пассивной латекс ытлзтинащи & др.). В нашей стране проводятся экспериментальные разработки диагностических препаратов в ИЗМ ЕМ.Г&калеа (А.К.Акатов и др., I96S; Ф.С.&туер и др., 1989, 1990), но, і: созаленка, ни один из шгх пока не доведен до прснз-
Бедственного выпуска в не-доступен практическому здравоохранению. Ввиду этого в России синдроы токсического иока не выделен в самостоятельную нозэологгчесхув единицу и до настоящего времени не регистрируется. В то яе время /спектр проявлений клинических форм при стафилококковых заболеваниях свидетельствует о тоы, что случаи СШ имепт место, но проходят из-за отсутствия диагностики под другими диагнозами. Ввиду этого вопросы разработки и производственного изготовления препаратов для иадикадзш ЭТИ продупдрувдих штаммов 3.aureus являются актуальными и открывают перспективы диагностики и профилактики СЯН.
В настоящее врем при изучении закономерностей циркуляции внутрибольшпшых ж внебольничшх штаммов s.aureus отмечается увеличение частоты нетшгяруешх культур Международным набором стафи-лофагов (от 33 до 65 %) ( A.vindel et єі., 1987; С.Петровский, 1988). В связи с этил потребности клинической к эпидемиологической практики ставят задачи расширения возмокностей альтернативного внутривидового дифференцирования. штампов s. aureus , швышавщих уровень диагностики и профилактики стафилококковых инфекций.
Учитывая, что около 30 % иташов s.eureua', продуцирующих ЭЩ не тзшируются фагами Международного набора, для эпидемиологических исследовании возникает необходимость разработки новых методов дифференцирования культур - возбудителей CTJD.
Целью настоящего исследования явилось экспериментальное обоснование и разработка методов индакацаи штаммов s.aureus продуцентов экзотоксина токсического шока и использование метода внутривидового дифференцирования культур на основании антигенной идентичности для идентификации нетЕпируедах ЗИП продуцирушщх штаммов.
В соответствии с поставленной целью исследования были определены следукщие экспериментальные задачи;
-
Определить оптимальные условия и разработать технологию культивирования штаммов s. aureus , хфодуцирувдих экзотоксин токсического шока.
-
Разработать методы выделения и очистки .ЭШ из эталонного штамма s.aureus РМ - 1169 я получить специфическую антитоксическую Ешунную сыворотку к ЗИП.
-
Отработать тест-систему для индикации; штаммов s.aureus , продупдруадих ЭШ.
-
Определить частоту распространекия ЭШ продуцирующих
штаымов s.aureus , выделенных от разных категорий большое'и бактерионосителей и охарактеризовать их биологические свойства.
5. Отработать йетод внутривидового дифференцирования для идентификации ЭТШ продувдрупдйх штаммов s. aureus не типирующпхоя Меж-дуяародЕКм набором стафаяофагов, основанный на использовании принципа антигенной идентичности.
Научная новизна и теоретическая значимость работы.
В результате проведенных исследований разработана рациональная технология культивирования штат-мов S.aureus , продуцирущих ЭТШ :
разработана тест^истема для выявления ЗШ продуцирущих итакмов s.aureus , выделенных от больных и носителей; . -
впервые продемонстрирована возможность применения хемилши-несцентного метода исследования биологической активности ЭТШ, основанного на свойстве ингибйрования токсином уровня свечения био-люкинесцентных бактерий. Лйказана специфичность действия ЭТШ на биосенсоры путеы нейтрализации специфической антитоксической сывороткой влияния ЭГШ;
йбтйена частота распространения ЭТШ продуцирущих штаммов s.aureue среди культур, изолированных от разных групп людей и показано их преимущественное выделение от детей с клиническими проявлениями синдрома токсического шока;
обоснована возможность использования метода внутривидового дифференцирования ЭШ продупдр'увдах штаммов s.aureus . не титрующихся фагйля Меядународдого набора, с целью выявления источников СТШ инфекпии.
Практическая значимость работы. По результатам выполненной работы были разработаны: I) науч- но-техническая документация ("Эксперимонталько-производственный регламент" и "Временная фармакопейная статья") ка сыворотку диагностическую к стафилококковому экзотоксину токсического шока, кроличью, жидкую для реакций прецшпггации в геле, которая с положительным результатом прошла лабораторные испытания в ГИСКе ем. Тара-севлча; 2) методические рекомендации для практических врачей "Способ индикации штаммов золотистого стафилококка, продуцирующих экзотоксин токсического шока", одобренные и утвержденные Уче-ныа Советом Ростовского ШШ микробиология а паразитологии 28 января 1992 г., протокол й I; 3) со результатам исследований подана заявка на изобретение "Экспресс-способ определения активности
бактериальные экзотоксинов" ( в соавторстве с В.Ы.Поляковым, И.Т.Андрусенко, А.П.Шепелевьы, А.Ю.Антиговнм; приоритетная справка * 5063179/14 ). Показали основные преимущества применения хеми-лдаинесцентного метода для оценки активности бактериальных токсинов - простота в исполнении, необходимость значительно меньших затрат времени для получения ответа, а также дешевизна в сравнении с приняташ обычньш методами; А) на основании обработанных методов внутривидового дифференцирования стафилококков нетншруемьес Международным набором стафилофагов, разработаны, опубликованы и внедренн методические рекомендации "Ветод определения антигенной идентичности стафилококков и его использование в лабораторной практике и эпидемиологическом анализе", ИЗ РСФСР, Москва, 1989 г.
Основные положения, внносимне на заарту і
- для получения экзотоксина токсического шока в больших коли
чествах рационально использовать культивирование шташа-продуцента
PRI - IIS9 в модифицированной среде Касыана (А.К.Акатов и др., I98S) с последущей очисткой, включающей осаждение ЭТШ из кулъту-ралъной жидкости сульфатом аммония, катионообменную хроматографию я гель-филь тратт;
полученная специфическая иммунная сыворотка к очищенному препарату ЗЛИ идентична референс-сыворотке (полученной от профессора K.S.Bergdoll -Wisconsin, Hadison, USA- США) а" является основой конструирования тест-систем для индикации ЭТШ продуцирующих штаммов S.aureus ;
специфичность, чувствительность тест-системы на основе диагностической сыворотки к ЭШ позволяет использовать ее для диагностики іі идентификации штаммов s. aureus , продуцирующих экзотоксин токсического шока;
впервые показано, что хешшшинесцепгннй метод может быть применен для выявления биологической активности ЭТШ," который ин-гибярует свечение биолшинесцентных бактерий. Специфичность действия ЗПВ на биосенсоры доказана путем нейтрализащш специфической антитоксической сывороткой токсического действия ЗИЛ ;
разработанный метод внутривидового дифференцирования штаммов s.aureus негшшруемнх Международным набором стафилофагов, основанный на реакции иммунодиффузионной преципитации в агаре, может быть использован для выявления источников СТШ инфекции.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на конференции молодых ученых "Эпидемиология, микробиология и иыму-
нобнология бактериальных и вирусных инфекций" в 1989 г., Ростов-на-Дону; на 2-й Всесоюзной научной конференции с Международным участием "Бактериальные токсины", Врмала, 1989 г.; на Всесоюзной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы эпидемиологии, диагностики и клиники инфекционных заболеваний", Москва, 1991 г.
Публикация материалов исследования. Основные положения диссертации отражены в 10 опубликованных научных работах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов я методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 188 работ, из которых 17 отечественных и І71 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 рисунками, 19 таблицами и 7 фотографиями.