Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Метагеномика и ген 16S рРНК 9
1.1. Место метагеномики в научном знании 9
1.2. Ген 16S рРНК в метагеномике 11
ГЛАВА 2. Разнообразие почвенных микробиомов и способы его оценки 16
2.1. Почва как депозитарий микробного биоразнообразия 16
2.2. Альфа-разнообразие 17
2.3. Бета-разнообразие 21
ГЛАВА 3. Метагеномика почвенных микроорганизмов 24
3.1. Методические особенности почвенной метагеномики 24
3.2. Метагеномика и экология почвенных микроорганизмов 25
3.3. Профильный подход в почвенной метагеномике 34
ГЛАВА 4. Объекты и методы исследования 38
4.1. Объекты исследования 38
4.2. Методы исследований 4.2.1. Отбор образцов 54
4.2.2. Химические анализы 54
4.2.3. Приготовление препарата почвенной ДНК 54
4.2.4. Проведение количественной ПЦР 55
4.2.5. Секвенирование и обработка данных 56
ГЛАВА 5. Результаты и обсуждение 59
5.1. Характеристика первичных данных 59
5.2. Кислые профильно-дифференцированные почвы 59
5.3. Черноземы типичные разных систем землепользования 66
5.4. Коричневая карбонатная почва 78
5.5. Геохимически сопряженные почвы сухостепного почвенного комплекса
5.6. Общий анализ таксономического состава микробиомов 88
Заключение 91
Выводы 93
Список литературы 94
- Ген 16S рРНК в метагеномике
- Альфа-разнообразие
- Метагеномика и экология почвенных микроорганизмов
- Проведение количественной ПЦР
Введение к работе
Актуальность работы
Почва представляет собой сложную экологическую систему,
выполняющую множество незаменимых функций в биосфере Земли. Большинство этих функций, связанных с биогеохимическими циклами элементов, обеспечением питания растений, устойчивостью и гомеостазисом биоценозов, осуществляется при участии почвенных микроорганизмов. Благодаря ее уникальному устройству как полифазной системы с высокой внутренней удельной поверхностью в одном грамме почвы может содержаться порядка 10 млрд клеток микроорганизмов, относящихся к тысячам различных видов (Torsvik, vres, 2002). Крайняя гетерогенность почвы как среды обитания, высокая вариабельность экологических факторов и многообразие их сочетаний делают почвенную среду самым большим резервуаром микробного разнообразия на Земле (Звягинцев, 1987).
Лишь небольшую часть этого огромного микробного комплекса удается выделить в лабораторных условиях на искусственных питательных средах. Большую часть прокариот, населяющих почву (90–99 % всего состава сообществ) не удается культивировать в лаборатории, а значит, их биогеохимические и экологические функции недоступны для исследования классическими методами микробиологии (Aslam, 2010).
Приоритетными в обнаружении и изучении некультивируемого
большинства почвенных микроорганизмов являются молекулярно-
биологические методы, позволяющие исследовать свойства микроорганизмов in situ, без выделения в чистые культуры (Равин, Марданов, Скрябин, 2015). Особое место среди них занимает метагеномика – анализ суммарного генетического материала, выделяемого из целой биологической системы.
Метагеномный подход стал возможен благодаря развитию
высокопроизводительного секвенирования – современных технологий
«прочитывания» нуклеотидной последовательности ДНК, позволяющих анализировать крупные объемы генетической информации. Наиболее популярен в метагеномных исследованиях анализ гена 16S рРНК, на строении которого основана современная филогенетическая классификация прокариотических организмов.
На протяжении последних двух десятилетий при помощи метагеномики активно изучаются структура и разнообразие почвенных микробных сообществ и их связь с внешними факторами. Однако большинство метагеномных исследований касаются лишь тонкого поверхностного слоя почвы в 5, 10 или 20 см, хотя общеизвестно, что микроорганизмы населяют ее по всему профилю, от дневной поверхности до почвообразующей породы. Лишь немногие работы в области экологической генетики касаются глубоких слоев почвы, но и в них
исследователи, как правило, лишь грубо разделяют профиль на
«поверхностную» и «подповерхностную» части или на формальные слои по глубине. Между тем, школа генетического почвоведения, ведущая начало с трудов В.В. Докучаева, много лет назад сформировала представление о почвенном профиле как о системе генетических горизонтов – слоев почвы, различающихся по происхождению, физико-химическим свойствам и протекающим в них процессам и определяющих специфику почвы в целом. Для исследования экологических особенностей почвенных микробных сообществ и их взаимосвязи со свойствами почв представляется оправданным и перспективным рассмотрение почвенного профиля именно по генетическим горизонтам.
В рамках данной работы проведен сравнительный метагеномный анализ горизонтов, слагающих профили ряда почв европейской части России. Несмотря на то, что география работ по почвенной метагеномике охватывает почти все регионы Земли, огромная территория России изучена крайне слабо – в научной литературе данные по метагеномному анализу почвенного покрова Российской Федерации практически отсутствуют. В то же время, европейская территория России достаточно хорошо исследована с точки зрения генетического почвоведения, взаимосвязи почвенных свойств и факторов почвообразования. Особенно подробно изученный почвенный покров агробиологических станций, научных стационаров и некоторых природных резерватов может являться перспективной основой для решения многих экологических задач почвенной метагеномики. Почвы данных площадок, расположенных в разных биоклиматических и природно-географических условиях Европейской России, послужили объектами настоящего исследования.
Сочетание современных методов высокопроизводительного
секвенирования с классическим подходом генетического почвоведения представляется многообещающим способом решения глобальных вопросов экологии почвенных микроорганизмов, касающихся взаимосвязи структуры микробных сообществ и свойств почвы.
Цель исследования
Анализ филогенетической структуры микробиомов генетических горизонтов ряда почв европейской части России и выявление ее связи с физико-химическими факторами и особенностями почвенного генезиса.
Задачи исследования
-
Оценка общего филогенетического разнообразия микробиомов генетических горизонтов ряда почв, различных по генезису и типам землепользования.
-
Выявление доминирующих таксонов прокариот в генетических горизонтах почв различных типов.
-
Определение наиболее значимых факторов, определяющих структуру и разнообразие почвенных прокариотных сообществ.
-
Сравнительный анализ структуры микробиомов почвенных горизонтов в связи с генетическими особенностями почв.
Научная новизна
Впервые с использованием высокопроизводительного секвенирования
подробно изучены прокариотные сообщества полных профилей почв, от дневной
поверхности до почвообразующей породы. В рамках одного исследования
рассмотрен широкий спектр почвенных горизонтов генетически различных
почв, сформированных в различных биоклиматических и геоморфологических
условиях. Ряд почв и почвенных горизонтов впервые является объектом
изучения почвенного прокариотного сообщества методами метагеномики. На
данный момент настоящая работа, по всей видимости, является наиболее полным
исследованием, совмещающим методы метагеномики с подходом генетического
почвоведения. В работе впервые дана объемная характеристика
филогенетической структуры и разнообразия почв европейской части России на основе анализа гена 16S рРНК.
Практическая значимость
Выявленные особенности структуры прокариотных сообществ, связанные с почвенно-климатическими свойствами, могут быть использованы в качестве биоиндикаторов состояния почвы. Метагеномная характеристика горизонтов почв различного генезиса может быть востребована для оценки устойчивости почвенных экосистем при воздействии на них естественных и антропогенных факторов. Результаты работы были отмечены премией Правительства Российской Федерации в области науки и техники для молодых ученых 2015 г. «за разработку молекулярно-генетического подхода к микробиологической оценке здоровья и ресурсного потенциала почв России».
Выполнение работы было поддержано:
проектом Российского Научного Фонда № 14-26-00079 «Био-физико-химическая диагностика качества органического вещества почв для разработки
научно-теоретических основ агробиотехнологий», проектом Российского Фонда
Фундаментальных Исследований № 15-04-00918 А «Минералого-
микроморфологическая и микробиологическая диагностика почв солонцовых комплексов Северного Прикаспия».
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на конференциях: «Экология и биология почв» (Ростов-на-Дону, 2014); 13th symposium on bacterial genetics and ecology (Милан, Италия, 2015); XVIII Докучаевские молодежные чтения «Деградация почв и продовольственная безопасность России» (Санкт-Петербург, 2015); всероссийская конференция с международным участием «Современные методы исследований почв и почвенного покрова» (Москва, 2015); международная конференция «Генетическая интеграция про- и эукариот: фундаментальные исследования и современные агротехнологии» (Санкт-Петербург, 2015).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 16 работ: 8 статей в рецензируемых научных журналах и 8 тезисов докладов на российских и международных научных конференциях.
Объем и структура диссертации
Ген 16S рРНК в метагеномике
Техническое развитие последних десятилетий предоставило в распоряжение фундаментальной науки широкий спектр методов исследования природных систем на молекулярном уровне. Частью этого спектра является ряд научных подходов, объектами изучения которых являются «пулы», т.е. общие совокупности, каких-либо однородных веществ в биологической системе. В качестве подобных пулов могут рассматриваться протеом (пул белков), транскриптом (пул РНК), липидом (пул липидов) и т.д. Исследующие их области науки (соответственно, протеомика, транскриптомика, липидомика) в общем виде носят ставшее уже практически официальным название «омики» («omics»). Широко распространен синтез данных различных «омик» в виде сопряженного анализа нескольких пулов веществ, с 1996 года выходит журнал «OMICS: A Journal of Integrative Biology», посвященный подобным подходам. Существует (однако, не слишком распространен) термин «паномика» («panomics») под которым понимается комбинированное использование всех возможных «омик» для конкретной биосистемы – подобный подход развивается, например, в онкологических исследованиях, где востребована как можно более полная характеристика внутри- и межклеточного молекулярного состава (Accelerating progress against Cancer…, 2011).
Отдельное направление исследований представляют «омики», изучающие молекулярное пулы не отдельных клеток или организмов, а целых сообществ. Как правило, в их названии имеется приставка «мета». Так, например, метапротеомика и метатранскриптомика занимаются анализом соответственно белков и РНК, принадлежащих всем организмам (как правило – микроорганизмам), обитающим в изучаемой системе. Исключением не является даже метаболомика, изучающая пул низкомолекулярных продуктов биологического обмена веществ – метаболитов: хотя в ее названии уже содержится приставка «мета», для обозначения данного подхода в изучении сообществ иногда используют термин «метаметаболомика» (Gotelliemail, Ellison, Ballif, 2012). К такому направлению «мета-омик» относится и метагеномика, объектом которой является совокупность ДНК различных организмов в изучаемой среде.
В технологической сфере главным шагом вперед для молекулярно генетического анализа микробных сообществ стало появление технологий высокопроизводительного секвенирования (т.е. «прочитывания» последовательности нуклеотидов в ДНК), или методов секвенирования нового поколения (Next-Generation Sequencing - NGS). Эти методы позволяют секвенировать значительные объемы генетической информации с гораздо меньшими временными и материальными затратами, чем стандартный метод секвенирования по Сэнджеру. Удешевление и совершенствование методов NGS продолжается, наиболее совершенные из них на данный момент позволяют секвенировать в сумме около 108 - 109 нуклеотидов за один запуск, и нет оснований считать, что это предел развития технологических возможностей (Quail et al., 2012; Caporaso et al., 2012). Помимо увеличения числа и длины «прочитываемых» последовательностей ДНК, существуют различные технические приемы для получения дополнительной информации. Например, секвенирование «методом дробовика» (shotgun sequencing), позволяющее получать множество случайных отрезков ДНК, впоследствии «сшиваемых» в одну последовательность необходимой длины (вплоть до полного генома) при помощи специального программного обеспечения (Venter, 2004). Развитие всех этих методов стимулировало становление метагеномики как мощного инструмента анализа микробных сообществ местообитаний самой разной природы.
Первоначально под «метагеномикой» подразумевался такой подход к анализу микробных сообществ, при котором коллекция генов, выделенных из изучаемого субстрата, анализировалась бы подобно единичному геному (Handelsman et al., 1998). Данный термин подразумевал уподобление конкретной среды со всеми ее биологическими свойствами одному организму; совокупность всех геномов обитателей среды, таким образом, предлагалась как объект изучения для воссоздания функциональных свойств всей системы. Очевидно, подобный подход трудноосуществим, если понимать его буквально – как полномасштабное полногеномное секвенирование тотальной ДНК в природных образцах. Так, например, для анализа полных геномов всего прокариотного сообщества одного грамма почвы понадобилось бы секвенирование порядка 1015 пар нуклеотидов (Vogel et al., 2009), что значительно превышает доступные исследовательские мощности даже с учетом продолжающегося совершенствования технологий секвенирования. В настоящее время термин «метагеномика» чаще используют в более широком смысле, для обозначения любых исследований, связанных с секвенированием генетического (как правило, микробного) материала, выделенного из какого-либо субстрата. В данном значении термин «метагеномика» будет использоваться далее.
Многие современные метагеномные исследования проводятся в рамках больших международных проектов, среди которых стоит назвать сконцентрированный на микробиомах человеческого организма Human Microbiome Project, общебиосферные MEP (Microbial Earth Project) и ЕМР (Earth Microbiome Project), посвященный почвенному метагеному TerraGenome и другие, в задачи которых входит аккумуляция, хранение и интегральный анализ метагеномных данных, а также выработка международных стандартов по проведению исследований в области молекулярной экологии (Vogel et al., 2009; Yilmaz et al., 2011).
Альфа-разнообразие
Профиль №1 на пашне – агрочернозем миграционно-мицелярный. PU1, 0–8см. Черный (10YR 2/1, здесь и далее – окраска по шкале Манселла, при обозначении x/y, x – value от 0 до 10, а y – color, «цветность», насыщенность), сухой, рыхлый, глинистый. Мелко-зернисто-порошистая структура. Присутствуют корни озимой пшеницы. Переход резкий по структуре и сложению, граница ровная. PU2, 8–22 см. Отличается от вышележащего структурным состоянием. Структура 1-го порядка – глыбистая. Глыбы распадаются в одних местах на плитки, в других – угловатые, неправильной формы агрегаты с острыми ребрами, шероховатыми гранями диаметром 2–4см. Внутри агрегаты представлены мелкозернистыми порошистыми агрегатами слабо сцепленными между собой. Местами встречаются подобные агрегаты с матовыми гранями 1–1,5см. Встречаются мелкие корни. Переход заметный по структуре, граница ровная. PU3, 22–30(31) см. Отличается от вышележащего горизонта структурным состоянием, сочетаются морфоны 2-х типов: агрегаты неправильной формы из PU2 и зернистые агрегаты из AU (из-за глубокой обработки). Переход заметный по структуре, граница ровная. AU, 30(31)–40 см. Зернистая структура с копролитами, местами встречаются кротовины, мелкие корешки. Переход постепенный по бурению окраски (появляется буроватый оттенок). AUBCA, 40–65(68) см. Темно-серый с буроватыми пятнами (10YR 2/1 и 3/1, в нижней части до 4/1). Свежий, глинистый, рыхлый. Структура зернистая. Есть копролиты и кротовины 5–7 % площади. Некоторые кротовины вскипают от HCl, заполнены желто-бурым и смешанным с серым материалом. Имеются трещины с засыпанным темным материалом, в нижней части зернистые агрегаты собраны в призмовидные непрочные образования. Переход заметный по цвету, резкий по вскипанию от HCl, граница слабоволнистая.
BCAmc, 65(68)–95 см. Очень светлый, желто-бурый (10YR 6/4–7/4), черно-серые кротовины 5–7 % площади. Глинистый, структура призматическая 4–6 см., легко распадающаяся на более мелкие призмы порядка 1–2 см. Бурно вскипает от HCl, на вертикальных гранях встречаются буроватые глинистые кутаны, вертикально-цилиндрические. Скважность d = 0,5–1 мм, тонкие корни, очень редкий карбонатный мицелий в виде прожилок. Переход постепенный по появлению бурых железисто-марганцовых примазок, граница ровная. BCAmc,q, 95–150 см. Отличия от BCAmc: лучше выражены карбонатные прожилки d = 0,5–1 мм, длиной 5–15 мм, в некоторых случаях выстилают стенки пор. Буро-черные пленки на вертикальных гранях образуют пятна диаметром от 2–3 до 18 мм. (железисто-марганцовые примазки), имеются бурые конкреции d = 0,25–0,5 мм. Структура призматическая, встречаются кутаны и кротовины.
BCAmc,q,i, 150–180 см. Характерны глинистые кутаны, более коричневые чем предыдущие. Профиль №2 на косимой залежи – постагрогенный чернозем миграционно-мицеллярный: AU1, 0–14(15) см. Дернина. Черный (10YR 2/1), сухой, легкоглинистый. Зернистая структура. Плотно сцеплен корнями травянистых растений. Переход заметный по количеству корней. Граница почти ровная.
AUpa, 14(15)–30 см. Меньше корней, чем в вышележащем горизонте. Структура, сочетающая зернистые агрегаты и округленные агрегаты с острыми ребрами и матовыми гранями d = 5–8 мм. Много копролитов, горизонт рыхлый. Переход заметный по сложению, граница ровная.
AU2, 30–50 см. Зернистая структура, собранная в призмовидные непрочные отдельности. Встречаются корни, ходы.
AU3, 50–65(67) см. По окраске на срезе приобретает буроватый оттенок (10YR 3/1, внешние грани 2/1). Встречаются редкие кротовины, корни, ходы, в том числе вертикальные (d = 3–7 мм.). Переход резкий по вскипанию, граница слабоволнистая.
AUBCAzoo, 65(67)–84 см. Неоднородный по окраске за счет ходов землероев, заполнен разным материалом: черным, желто-бурым, бурым и смешанным. Индекс zoo, отсутствующий в используемой классификации, в данном случае означает высокую степень зоогенной обработки. Бурно вскипает от HCl. Морфологического выделения карбонатов практически нет, за исключением лабильных прожилок в кротовинах.
BCAmc, 84–100(105) см. Во влажном состоянии 7,5YR 5/4, в сухом – 10,5YR 7/4. Глинистый, свежий, структура призматическая. Редко встречаются карбонаты в виде прожилок, вертикальная цилиндрическая скважность d = 0,5–1 мм. Кротовины с серым материалом. Открытые вертикальные ходы d = 6–8 мм. Стенки ходов покрыты темным материалом, по ним проходят корни. Встречаются трещины, заполнены темным материалом. Переход постепенный по обилию карбонатного мицелия и появлению примазок. BCAmc,q, 100(105)–155 см. Отличия от BCAmc: чаще встречается карбонатный мицелий, мелкие бурые примазки 0,25–0,5 мм, ходы кротовины.
Профиль №3 в лесополосе – чернозем миграционно-мицелярный: На поверхности почвы – лесная подстилка из листвы и желудей дуба черешчатого (Quercus robur), листвы клёна остролистного (cer platanodes) и коры деревьев. AU1, 0–9(13) см. Очень рыхлый, большая водопроницаемость. Черный, (10YR 2/1), свежий, легкая глина. Пронизан мелкими корнями деревьев, переработан дождевыми червями. Структура зернистая, размер агрегатов около 3–5 мм, отдельные – 1–1,5 мм, много копролитов. Переход резкий по обилию корней и сложению. Граница слабоволнистая.
AU2, 9(13)–45(50) см. Черный, однородный, свежий, глинистый, чуть уплотнен по сравнению с AU1. Структура зернистая с копролитами. Вертикальные ходы червей диаметром 4–6 мм, обилие корней на порядок меньше, больше редкие крупные корни. Переход постепенный по цвету. Граница неровная.
AUBCA, 45(50)–75(83) см. Неоднородный по окраске: на общем темно-сером фоне (10YR 3/1) буроватые пятна преимущественно вертикальной ориентации (10YR 3/2 и отдельные – 4/2). Свежий, глинистый, чуть плотнее AU2. Структура призмовидная, непрочные отдельности, собранные из непрочных агрегатов диаметром 2–5 мм. Обилие корней как в AU2. Есть редкие кротовины, заполненные черным или серо-бурым материалом, в некоторых местах по кротовинам внедряется карбонатный материал. Переход местами резкий по вскипанию и заметный по цвету. Граница неровная, слабоволнистая, местами языковатая по ходам землероев.
BCAmc, 75(83)–125(130) см. Неоднородный по окраске. Общий фон – желтовато-бурый (10YR5/4, мозаичные темно-серые пятна с вкраплением бурого материала и вертикальные полосы того же цвета, доля пятен примерно 10 % от площади среза. Свежий, глинистый, плотный. Структура непрочно-призмовидная, 4–5 см, легко распадается на ореховатые мелкопризматические отдельности 5–10 мм. Горизонт бурно вскипает от HCl, карбонатные выделения крайне редкие в виде очень тонких прожилок. Трещины с засыпами темного материала шириной 2–7мм. Встречаются замкнутые камеры, заполненные черными или бурыми копролитами. Граница ровная.
Метагеномика и экология почвенных микроорганизмов
По результатам realime PCR прослеживается значительное (почти на порядок) уменьшение общего количества прокариотных генов при переходе от гумусовых (A) к минеральным (B) горизонтам: если в A горизонтах общее количество копий гена 16S рРНК достигает 1 1010 – 5 1010, то в B горизонтах оно варьирует в пределах 1,7 109 – 6 109 (рис. 11). Причиной снижения численности прокариот в минеральных горизонтах, очевидно, является низкое содержание органических веществ.
Наибольшее количество копий гена 16S рРНК (4.8 1010) в черноземе на пашне приходится на верхний восьмисантиметровый горизонт, после чего до глубины 40 см численность прокариот выравнивается на уровне 3 1010. Для черноземов лесополосы и залежи в поверхностных горизонтах число копий гена 16S рРНК, наоборот, было меньше, чем в нижележащей части гумусового слоя (рис 11).
В некоторых почвах численность прокариот, оцениваемая по количеству копий гена 16S рРНК может в разы превышать оценки на основе других методов. Так, на основе прямого учета под микроскопом численность прокариот в верхнем слое черноземных почв оценивается примерно в 3–4 109 клеток/г (Полянская и др., 1995; Манучарова и др., 2011, Лукачева и др., 2013) – на порядок меньше, чем численность генов 16S рРНК в нашем исследовании. Объяснением этого расхождения является специфика методов: микроскопический метод может занижать результаты за счет потерь клеток при приготовлении препаратов и человеческой ошибки, а realime PCR – завышать, за счет включения в анализ экзоцеллюлярной (внеклеточной) ДНК. Кроме того, есть данные, что некоторые прокариоты имеют больше одной копии гена 16S рРНК в геноме, что также должно завышать результаты оценки общего количества этих генов по сравнению с численностью клеток прокариот. Рис. 11. Характеристики профилей черноземов: pH водной вытяжки, содержание углерода органического вещества и азота, разнообразие прокариотного сообщества по индексу Шеннона и число копий гена 16S рРНК по данным количественной ПЦР. Оценка таксономического разнообразия микробных сообществ (альфа-разнообразия) не показала однозначного изменения по профилю индексов Шеннона, количества обнаруженных ОТЕ и индекса Chao1. Так индекс Шеннона для всех горизонтов исследованных почв варьирует в нешироких пределах от 5,5 до 7,5, причем в некоторых B горизонтах наблюдаются более высокие значения, чем в гумусовой части профиля (рис. 11). В схожем исследовании микробиомов луговых почв Германии (Will et al, 2010) отмечается более высокое разнообразие прокариот в А горизонтах по сравнению с B горизонтами. Отсутствие подобной разницы в настоящем исследовании может быть связано со спецификой объекта - в работе Will и соавторов объектами исследования являлись стагносоли (stagnosol) – луговые почвы, характеризующиеся длительным застойным переувлажнением B горизонтов. Хотя авторы связывают более низкое биоразнообразие в B горизонтах с низким содержанием органического вещества, причиной также могут быть создающиеся в результате застойного переувлажнения анаэробные условия, неблагоприятные для большинства почвенных микроорганизмов. В метагеномном исследовании поверхностных (аэробных) и подповерхностных (анаэробных) слоев сфагнового болота также показано существенное падение прокариотного разнообразия в слоях почвы с застоем влаги (Serkebaeva et al., 2013). Минеральные горизонты черноземов – объектов настоящего исследования – не подвержены подобному переувлажнению.
По изменению прокариотного разнообразия и агрохимических показателей хорошо прослеживается переход от пахотного слоя (горизонты PU) к подпахотному (AU) в профиле чернозема на пашне (рис. 11). Содержание азота и углерода органического вещества несколько повышается в нижней части пахотного слоя (горизонт PU3) и довольно резкое снижается в подпахотном горизонте AU (например, углерода – с 4,0 до 2,9 %). Микробное разнообразие (на основе индекса Шеннона, количества ОТЕ и индекса Chao1) в подпахотном AU существенно ниже, чем в выше- и нижележащих (рис. 11). Известно, что в результате воздействия ходовых частей сельскохозяйственной техники, давления плуга и других процессов, сопутствующих вспашке, происходит образование так называемой «плужной подошвы», обладающей более высокой плотностью, низкой водопроницаемостью и другими неблагоприятными физическими свойствами (Витязев, Макаров, 1991). В почвах Каменной Степи подпахотный горизонт незначительно отличается по плотности, однако водопроницаемость в нем в 4–10 раз ниже, чем в пахотном слое (Тихонравова, Перевалов, 2007). Возможно, именно это приводит к уменьшению содержания углерода органического вещества и сравнительно низкому разнообразию микроорганизмов.
Схожесть прокариотных сообществ A и B горизонтов была проанализирована по методу weighted UniFrac и метрике Брея-Кертиса при разных критериях формирования ОТЕ, от 79 % сходства (условно считается уровнем различия бактериальных филумов) до 99 % сходства (уровень штаммов, внутривидовых генетических вариаций). На диаграммах по методу главных компонент (рис. 12 и 13) по обеим использованным метрикам наблюдается разделение микробиомов A и B горизонтов на непересекающиеся кластеры при формировании ОТЕ на основе 91 % и более сходства гена 16S рРНК (т.е. примерно на уровне семейств и таксонов более низкого уровня). Микробные сообщества AB (переходных) почвенных горизонтов при этом занимают промежуточное положение между сообществами горизонтов A и B. Подобная отдельная кластеризация органических и минеральных горизонтов была получена в метагеномном исследовании микробиомов лесных почв Канады, причем как для прокариотного, так и для грибного комплекса (Hartmann et al., 2012).
Также представляется заслуживающим внимание тот факт, что сообщества A горизонтов значительно сильнее отличаются друг от друга, чем сообщества минеральных горизонтов, формирующие на диаграммах по методу главных компонент небольшой узкий кластер. Схожие результаты были продемонстрированы некоторыми исследователями, однако, не для генетических горизонтов, а для формального разделения профиля на «поверхностные» и «глубинные» горизонты (Eilers et al., 2012). Результаты, полученные в настоящем исследовании, демонстрируют, что большая однородность микробиомов свойственна не просто «глубоким слоям почвы», а именно минеральным (B) горизонтам. Это хорошо согласуется с общими представлениями о разнообразии экологических условий для микроорганизмов в этих горизонтах и с данными агрохимического анализа – А горизонты более разнообразны по значениям pH, содержанию углерода и азота, чем B горизонты. На микробиомы А горизонтов гораздо большее влияние оказывает состав растительности, сельскохозяйственная деятельность человека, смена климатических условий и т.д. Таким образом, можно заключить, что экологические различия минеральных и органо-минеральных почвенных горизонтов являются для данных почв главным фактором профильной дифференциации прокариотных сообществ.
Проведение количественной ПЦР
Бактериальный комплекс исследованных почвенных микробиомов по полученным данным сформирован преимущественно представителями девяти филумов: Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes, Gemmatimonadetes, Planctomycetes, Proteobacteria и Verrucomicrobia, причем доминирующими филумами практически во всех микробиомах являются Proteobacteria и Actinobacteria. В ряде сообществ к перечисленным выше филумам прибавляются некоторые другие, например, Nitrospirae – бактерии, часто присутствующие в небольших количествах (десятых долей процента от общего состава сообщества) в большинстве почвенных микробиомов. В некоторых микробиомах определенной представленностью обладают Cyanobacteria, однако, подробный анализ показывает, что это, как правило, сиквенсы, относящиеся к хлоропластам эукариотических клеток, которые эволюционно близки к цианобактериям. Собственно цианобактерии, очевидно, могут быть встречены преимущественно на поверхности почвы в определенных условиях, и крайне маловероятно их обнаружение в почвенной толще, изолированной от солнечного света. Также достаточно высокой представленностью (до 7,1 %) в некоторых микробиомах горизонтов дерново-подзолистой почвы обладали бактерии группы AD3 – группы, не имеющей культивированных представителей, которая, по-видимому, тяготеет к прохладным и влажным почвенным местообитаниям.
Археи во всех исследованных образцах были представлены преимущественно группой Thaumarchaeota. Другие метагеномные исследованиямия также обнаруживают таумархеот в самых разных почвах и подтверждают их высокую распространенность (Pester, 2011). Однако, как правило, в почвах присутствуют и другие представители домена Archaea, например, метаногенные археи, относящиеся к филуму Euryarchaeota. Так как метаногены – облигатные анаэробы, обычно они встречаются в переувлажненных почвах с восстановительными условиями, однако, они обнаруживаются (вероятно, в покоящихся формах) и в хорошо аэрируемых почвах (Angel, Claus, Conrad, 2012). В настоящем исследовании Euryarchaeota демонстрировали крайне небольшую представленность (не больше десятых долей процента от общего состава микробиомов), что кажется плохо соответствующим идее о всеобщей распространенности эвриархеот. С другой стороны, в данной работе не рассматривались действительно переувлажненные почвы, а образцы из почв влажного климата – дерново-подзолистой и темно-серой – отбирались в период, когда данные почвы обладали достаточно небольшой влажностью. Вероятно, эвриархеоты присутствуют в сухих почвах в настолько небольших количествах, что при анализе тотальной ДНК «затеняются» обилием генов других прокариот.
Некоторые экологические закономерности структуры прокариотных сообществ, выявленные в данном исследовании для почвенного метагенома, продемонстрированы ранее другими методами почвенной микробиологии. Так, приуроченность Acidobacteria к местообитаниям с более низким pH показана для ряда культивируемых представителей этой группы (Kishimoto, 1991; Панкратов, 2012); приспособленность Actinobacteria к сухим условиям подтверждается культуральными методами, люминесцентной микроскопией и исследованиями физиологии данных микроорганизмов (Звягинцев, Зенова, 2001; Ярославцев, 2010; Зенова, Звягинцев, Судницын, 2014; Манучарова, 2014); зависимость общего разнообразия микробных сообществ от гетерогенности почвы, связанной с оструктуренностью, влажностью и другими почвенными характеристиками, также является концепцией, сформированной на основе классических методов почвенной микробиологии (Добровольская, 2002; Марфенина, 2005; Чернов, 2013). Исследования тотального прокариотного метагенома подтверждают многие классические представления о структуре почвенных микробных сообществ, основанные на исследованиях лишь культивируемых микроорганизмов.
Структура почвенных микробиомов, описанная в настоящей работе, хорошо согласуется с данными других метагеномных исследований (Janssen, 2006; Hansel et al., 2008) но в то же время по ряду особенностей отличается от данных, полученных другими методами. Так, например, методом FISH (учитывающего физиологически-активные клетки при помощи рРНК-маркеров) в почвенных микробиомах наравне с группами Proteobacteria и Actinobacteria отмечаются высокие доли группы Firmicutes (Манучарова, 2011; Лукачева, 2013; Манучарова, 2016), однако, по результатам секвенирования гена 16S рРНК Firmicutes занимают лишь несколько процентов от общего состава сообщества. Некоторые характерные представители культивируемой части микробных сообществ почвы – роды Bacillus, Pseudomonas, Serratia – в исследованных микробиомах обнаруживали достаточно высокую представленность по анализу гена 16S рРНК, однако другие – Arthrobacter, Cellulomonas, Rhodococcus, Nocardia, Streptomices – по результатам данной работы в почве, как правило, либо не обнаруживались вообще, или имели крайне небольшие доли в сообществе.
Объяснением расхождений в оценке структуры микробного сообщества при помощи секвенирования общей ДНК, метода FISH и классической культуральной микробиологии, очевидно, являются особенности и ограничения каждого метода. Для культуральных методов это ограниченность лишь небольшим срезом микробного сообщества, выделяемым на питательных средах, для FISH – анализ лишь физиологически активных (имеющими РНК) клеток и, часто, специфичность используемых олигонуклеотидных зондов. Использованный в данной работе метагеномный анализ, в свою очередь, имеет свои особенности – в общие результаты вносят вклад активные, покоящиеся и мертвые формы прокариот, одноклеточные и мицелиальные формы, а также экзоцеллюлярная ДНК. Несмотря на то, что в метагеномном подходе за счет вышеописанных особенностей могут несколько искажаться соотношения между разными группами микроорганизмов, несомненно основное его достоинство в изучении микробных сообществ – выявление групп, которые недоступны для обнаружения другими методами, но, вероятно, способны играть важную роль в функционировании экосистем.