Метаболизм азота и водорода у гетероцистных цианобактерий Трошина, Ольга Юрьевна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Гетероцистные цианобактерий -многоклеточные цианобактерий, способные к дифференцировке специализированных клеток - гетероцист, в которых осуществляется азотфиксация. Уникальный метаболизм этих бактерий характеризуется способностью осуществлять в одном организме два фундаментальных процесса - оксигенный фотосинтез и фиксацию азота, крайне чувствительную к 0₂. Цианобактерий широко используются как модельные объекты при исследовании фотосинтеза, азотфиксации, онтогенетической дифференциации и других биологически важных процессов. Благодаря простоте условий культивирования и высокой продуктивности эти микроорганизмы находят широкое практическое применение как источники белков, полисахаридов, связанного азота органических и физиологически активных соединений. Цианобактерий рассматриваются также как перспективные продуценты аммиака и молекулярного водорода - топлива будущего. Оба процесса -азотфиксации и образования Н₂ - происходят в гетероцистач при участии нитрогеназы за счет световой энергии. Однако в естественных условиях роста цианобактерий почти не образуют или образуют мало Н₂, что обусловлено функционированием в гетероцистах активной Н_:-поглощающей гидрогеназы.

Многие цианобактерий синтезируют уникальное запасное азотсодержащее вещество - цианофицин, представляющий собой полимер аргинина и аспартата. Недавно показано, что мутант-ауксотроф цианобактерий Nostoc ellipsosporum по аргинину не образует цианофицин, не проявляет дифференцировку гетероцист и, соответственно, азотфиксацию (Leganes et al., 1998). Это подтверждает важную роль аргинина в азотном метаболизме цианобактерий. Однако его биосинтез у цианобактерий практически не исследовался.

Практическому использованию цианобактерий как продуцентов аммиака и Нг препятствует слабая изученность ферментных систем метаболизма азота и водорода и их регуляции у этих микроорганизмов. Исходя из вышеизложенного и были сформулированы следующие цели и задачи данной работы.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было исследование регуляции синтеза основных ферментов азотного и водородного метаболизма гетероцистных цианобактерий, а именно: 1) нитрогеназы, катализирующей начальный этап ассимиляции молекулярного азота, 2) аргининосукцинат-лиазы, катализирующей конечный этап образования аргинина, и 3) водородпоглощающей гидрогеназы, рециклизирующей молекулярный водород, выделяемый нитрогеназой. Конкретные задачи работы состояли в следующем: 1. Выяснить факторы, влияющие на скорость фотообразования аммония у дикого штамма ЛпаЫи'па azollae и у его мутантов с дереирессированным синтезом нитрогеназы.

2. - Изучить взаимосвязь между синтезом нитрогеназы и

внутриклеточным соотношением C/N, а также особенности регуляции активности нитрогеназы ионами аммония у цианобактерии Anabaena variabilis.

1. Провести сравнительное исследование индукции синтеза нитрогеназы и Нг-поглощающей гидрогеназы у A. variabilis при лимитировании аммонием в присутствии молекулярного водорода и органического субстрата. Изучить распространение обратимой гидрогеназы у разных штаммов цианобактерии Anabaena spp. и Nostoc spp.

2. Показать наличие аргининосукцинат-лиазы (АС Л) в клетках цианобактерии Nostoc sp. РСС 73102, исследовать регуляцию синтеза АСЛ, клонировать и охарактеризовать argR, кодирующий АСЛ Nostoc sp. РСС 73102.

Новизна работы. Установлено, что мутанты A. azollae с дерепрессированным синтезом нитрогеназы способны к фотообразованию аммония со скоростью, определяемой активностью нитрогеназы и глутаминсинтетазы. Впервые показано, что у фотоавтотрофно растущих культур A. variabilis снижение содержания азота в клетках (увеличение отношения C/N) приводит к индукции синтеза нитрогеназы. Выяснено, что ингибирование нитрогеназной активности аммонием у цианобактерии обусловлено снижением транспорта органических соединений в гетероцисты вследствие ассимиляции аммония. Установлено, что синтез нитрогеназы и H₂-поглощающей гидрогеназы у A. variabilis происходит координирование, причем синтез последней не репрессируется органическими соединениями. Наличие обратимой гидрогеназы не является обязательным для гетероцистных цианобактерии. Показано наличие активной аргининосукцинат-лиазы в клетках Nostoc sp. РСС 73102 и установлено, что ее синтез не репрессируется аргинином. Впервые клонирован и охарактеризован цианобактериальный argU, кодирующий аргининосукцинат-лиазу, и получена его функциональная экспрессия в клетках Escherichia coli.

Научная и практическая значимость работы. Полученные в работе данные расширяют имеющиеся представления о метаболизме азота и водорода у гетероцистных цианобактерии и могут служить научной основой для создания разнообразных штаммов-продуцентов, в частности Н₂ и NH₃. Совокупность полученных данных о фотообразовании NH₃ мутантами A. azollae позволяет рекомендовать их для использования в качестве биоудобрения.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VII Международном симпозиуме по фотосинтезирующим прокариотам (США, Amherst, 1991), на VIII симпозиуме стран восточной Европы по биологической азотфиксации (Саратов, 1992), на всесоюзной

конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пушино, 1992), на X международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995), на V международной конференции по молекулярной биологии гидрогеназ (Франция, Albertville, 1997), на международной конференции по биологическому образованию Н₂ (США, Hawaii, 1997), на XI конференции северных стран по азотфиксации (Швеция, Стокгольм, 2000).

Публикации. По материалам диссертации представлено в печати 8 публикаций.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, описания объектов и методов, изложения
экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и списка
цитируемой литературы. Текст диссертации занимает страниц,