Метаболиты нормальной микрофлоры человека в экспресс-диагностике и контроле лечения дисбиоза толстой кишки Митрохин, Сергей Дмитриевич

Введение к работе

Актуальность темы. Сегодня в условиях все возрастающего экологического неблагополучия, широкого применения различных ксенобиотиков, зключая химиотерапевтические препараты, воздействия химических, физических и биологических факторов наблюдаются существенные микрозкологи-ческие нарушения в организме человека, ииеюцие серьезные последствия как для отдельных индивидуумов, так и для общества в целом. Перечис-тенные факторы могут быть ответственны и за селекции и распространение в природе штаммов микрорганизмов с атипическими свойствами, и за формирование в организме хозяина новых микробных сообществ. К важным пос-педствиям воздействия ксенобиотиков на нормальную микрофлору человека следует отнести и формирование контингентоз с врожденной сниженной резистентностью к условно-патогенным микроорганизмам. Изменение этиологической структуры известных инфекционных заболеваний с заменой тради-дионных патогенов на антибиотикорезистентные условно-патогенные микро-фганизмы также в определенней степени обусловлено повреждением той jacTH микрофлоры хозяина, которая ответственна за сохранение индивиду-ільной стабильности микробиоцекозов и колонизационную резистентность. Спектр клинических синдромов и патологических состояний, этиопатогенез ;оторых, как полагает, может быть связан с изменением состава и функций нормальной микрофлоры, населяющей организм хозяина, в настоящее іремя достаточно широк и инеет тенденцию к увепичению(Пинегин Б.В.1984. (расноголовец В.Н.,1989..тендеров Б.А.,1994..Воробьев А.А., 1995 997.,Hentges D.J.,1983, Henderson В.,,1996).

Предложены разнообразные приемы для оценки состояния микрофлоры ;епудочно-киаечного тракта (ЖКТ), среди которых бактериологический ме-"од имеет наибольшее распространение. Однако, он обладает рядом су-&ественных недостатков к которым можно отнести его трудоемкость и дли-ельность проведения бактериологических тестов, необходимость создания словий анаэробиоза, невозможность оценить роль многих до настоящего іремени некультивируемых микроорганизмов ЖКТ.

В тоже время существуют и другие, косвенные, методы исследования шкрофлоры организма человека и животных. Одним из них является опре-еление количества и спектра образующихся и элиминирующихся из орга-іизма микробных метаболитов или веществ, связанных с обменов веществ актерий - представителей нормальной микрофлоры человека (Hill I.J.,1986 ). К достоинствам этого метода лабораторной диагностики мож-

~ 4 -

но отнести быстроту получения ответа (20 - 30 минут).относительную несложность и относительно минимальную трудоемкость проведения анализа. Возможность проведения повторных, даже ежедневных анализов, также имеет немаловажное значение Следовательно, этот метод является экспресс- методом диагностики дисбактериоза кишечника (Тамм.А.О.,1989).

Однако, в настоящее время четкой методологии биохимической оценки эубиоза или дисбиоза ЖКТ (аналогичной бактериологическому анализу), практически не существует. Отдельные иетодические приемы выявления тех или иных химических соединений - метаболитов микрофлоры ЖКТ разработаны в обьеме недостаточном для использования их в рутинной лабораторной практике.

Отсутствие также целостных, законченных представлений о значимости физиолого-биохимического функционирования нормальной микрофлоры организма человека в норме и при патологических состояниях последнего не позволяет обьективно оценивать публикующиеся данные о влиянии различных ксенобиотиков на микробную экологию ЖКТ.

Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы являлось подобрать и апробировать приемлемый для лабораторной практики комплекс хроматографических методик определения различных метаболитов нормофло-ры человека и установить их значимость для диагностики и оценки эффективности коррекции микроэкологического дисбаланса (дисбиоза) толстой кишки, обусловленного различной патологией человека.

3 соответствии с поставленой целью были определены следующие задачи исследования:

1. С использованием методов ионной хроматографии (ИХ) отработать методики определения в фекалиях различных химических соединений - метаболитов нормальной к«а«чной микрофлоры человека;

2. В кале доноров крови (практически здоровых людей) определить содержание и спектр карбоновых кислот, ароматических соединений и биогенных аминов, имеющих микробное и смешанное происхождение в организме человека. Разработать микробный метаболитный паспорт микробной экологии толстой кишки в норме;

3. Определить содержание и спектр тех же самых иетаболитов в кале больных с высоким риском развития дисбиоза кишечника: с заболеваниями желудочно-кишечного тракта, получающих массивные дозы антибиотиков ( пульмонологические больные), с аллергозами (изменненой иммунобиологической реактивностью организма);

4. Установить связь между состоянием микробной экологии толстой

кишки у пациентов с вышеуказанными патологиями и пулом и спектром микробных метаболитов, экскретируемых у них с калом. Разработать микробный метаболитный паспорт микробной экологии толстой кишки для каждой из этих патологий;

5. Сопоставить информативность, скорость получения, воспроизводимость, сходимость и достоверность результатов бактериологического и хроматографического методов анализа;

6. Разработать комплексную, поэтапную схему диагностики дисбиоза толстой кишки в клинике внутренних болезней,а так же мониторинга за эффективностью проводимой терапии в плане его коррекции.

Научная новизна работы- Впервые на моделях безяикробных, конвенциональных лабораторных животных, здоровых волонтеров и лиц с патологией ЖКТ, респираторного тракта и аллергическими заболеваниями отработан комплекс методик ИХ, позволяющий с высокой информативностью и экс-прессно оценивать состояние микробной экологии толстой кишки. В содержимом толстой кишки людей впервые обнаружены щавелевоуксусная.Я-кетог-лутаровая и фениляропионовая кислоты, а также магяламич, отсутствующие в выделениях безмикробных животных. Это позволило расматривать эти соединения как новые микрсорганизм-ассоциированные характеристики. Возможность определения более 20 показателей одним методом позволило разработать микробный метаболитный паспорт фекалий (ЫМП*) здорового человека и аналогичные паспорта для лиц с желудочно-кишечной патологией, заболеваниями нижних дыхательных путей и аллергичесхими заболеваниями.

Все отмеченые положения установлены впервые в стране.

Практическая значимость работы. Разработаны методические подходы и комплекс стандартизированных методик хроматографического исследования фекалий людей (протокол биохимического исследования ) на основе метода ИХ. Этот метод достаточно прост в применении и приемлем для использования в рутинной лабораторной практике. Экспериментально доказана возможность его использования для экспресс-оценки состояния микробной экологии кишечника лиц, относящихся к группам риска па возникновению и развитию микроэкологического дисбаланса пищеварительного тракта. Разработанные »><ПФ человека иогут быть использованы в клинической практике для быстрого выявления нарушений в нормальной микрофлоре организма хозяйка с цє/їьи как своевременной коррекции этого явления, так и контроля за эффективностью проводимой химиотерапии и профилактики эсложнений, связанных с кикроэкологическим дисбалансом организма чело-

человека. На основе данных ММПФ разработана и предложена оригинальная биохимическая классификация степеней тяжести микроэкологического дисбаланса, позволяющая оценить фазы и формы данного патологического процесса в ЖКТ. Предложена оптимизированная схема проведения лабораторной диагностики и оценки эффективности коррекции микроэкологического дисбаланса толстой К.КЩХИ.

Внедрение результатов исследования в практику.

Результаты проведенных исследований навши отражение в :

методических рекомендациях " Комплексная диагностика, лечение t профилактика дисбактермоза{дисбиоза) кишечника в клинике внутренних болезней", (Москва,1997 г.);

методических рекомендациях "Правила забора и доставки биоматериала для лабораторных исследований", (Москва, 1997 г.);

методических указаниях "Бактериологическая диагностика и терапия дисбактериоза кишечника на современном этапе", (Москва,1997 г.);

информационном письме "Новые подходы к оценке микроэкологических нарушений ЖКТ с использованием биохимических методов", (Москва,1993 г.);

информационном письме "Кабинет по экспресс-диагностика иммуногс статуса и состояния кишечника", (Москва, 1993 г.);

информационном письме "Влияние ионизирующей радиации на показатели иммунологического и микроэкологического статуса организма хозяи на", (Москва,1934 г.)

Все методические материалы используются практическими врачами н< местах для повседневной работы.

Теоретические положения исследования и основанные на нем практические рекомендации используются в учебном процессе на факультете фун даментальной медицины Московского государственного университет! им.М.В.Ломоносова, учебном процессе при подготовке врачей-ординаторо на базе Учебко-научиого центра Медицинского центра Управления делам; Президента Российской Федерации.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и об суждены на:

УІ Всероссийской сьезде микробиологоз, эпидемиологов и паразитологов (Н.Новгород, 1991);

Y Российском съезде специалистов по лабораторной диагностике Москва,1995);

международном симпозиуме по проблемам лабораторной диагности-ки'АТВ 95" (Милан, Италия,1S95);

Всероссийской научно-практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики"(Ы5осква,1996);

Научно-практической конференции ""Клиническая лабораторная ди-агностика:состояние,перспективы" (Санкт-Петербург,1996);

III Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство' (Москва.1996);

Научно-практической конференции "Актуальные вопросы клинической медицины" (Москва,1996);

IY Российском национальной конгрессе "Человек и лекарство" (Москва,1997).

В завершенном виде диссертационная работа обсуждена и одобрена на заседании Проблемной комиссии по гастроэнтерологии Медицинского центра Управления делаии Президента Российской Федерации 18.12-1997 г.

Публикации результатов исследования. Основные положения диссертации отражены в ЗО опубликованных и 1 принятой в печать работах.

Положения выносимые на защиту.

1. Разработаны методические подходы и комплекс хроматографическнх методик (на базе метода ИХ) для определения спектра и количества в фе-<алиях людей карбоноеых кислот с разной длиной углеродной цепи, ароматических соединений и аминов - протокол биохимического исследования [рекалий.

2. Разработан ШПФ здорового человека.

3. Разработаны ММПФ больных с заболеваниями толстой кишки, нижних дыхательных путей и аллергическими заболеваниями.

4. Обоснована возможность использования показателей ММПФ в ка-іестве биохимических критериев эу-и(нли) дисбиоза кишечника.

5. Разработана оптимизированная схема проведения лабораторной ди-ігностики и оценки эффективности коррекции микрозкологического дисба-іанса толстой кишки с использованием биохимического экспресс-метода.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, 7 глав с опи-:анием материала и методов исследования, собственных результатов и их бсуждения, выводов, приложения, а также указателя литературы, включа-іщего 258 источников (из них 108 отечественных и 152 иностранных авто-ов). Содержание работы излажено ка?».4?страницах машинописного текста включает 45 таблиц и 10 рисунков.