Введение к работе
Актуальность темы. Биологические мембраны отделяют клетку от окружающей ее среды, следовательно, целостность их структурной организации является основным условием существования клетки как единого целого. Поэтому они являются исключительно полифункциональными структурами и сопричастны почти ко всем процессам, происходящим в клетке (Солтон, 1977).
Основными компонентами клеточных мембран являются белки и фосфолипнды, которые образуют сложные структуры, в основе строения которых лежит жидкостно-мозаичная модель их организации. Фосфолипнды образуют бислой, который является основной структурной единицей в организации бномембран. Белки, входящие в состав цитоплазматической мембраны бактериальной клетки, выполняют разнообразные функции, которые включают: транспорт веществ (Gronan, 1987), синтез ДНК (Чернова, Гази-сва, 1979; Firshein, 1989), РНК (Winsten, Huang, 1972), белка (Allen, Scott, 1979), липидов (Островский, Шакулов, 1973), ли-пополисахаридов (Kanegasaki, 1974), циклического АМФ (Poll, 1977). Кроме того, в мембранах осуществляются процессы, обеспечивающие клетку энергией (Скулачев, 1989).
Одной из фундаментальных проблем мембранологни является проблема участия мембран в биосинтезе и секреции экзобелков. Эти процессы осуществляются в основном на мембраносвязанных рибосомах.
Совершенно очевидно, что выяснение ассоциации рибосом с мембранными структурами бактерий позволит более глубоко понять особенности биосинтеза секретнруемых белков, а также ряд ключевых вопросов участия биологических мембран в остальных процессах клеточной биологии.
Изучение этих вопросов будет способствовать решению целого ряда практических задач современной биологии, связанных с расшифровкой механизмов: канцерогенеза, анабиоза, радиационного поражения клеток, регуляции активности работы мембранных
ферментов, механизма действия мембраноактивных антибиотиков и многих другие не менее актуальных проблем.
Таким образом, все рассмотренные выше аспекты мембрано-логии определяют актуальность исследований в этом направлении.
Цель исследования. Целью настоящего исследования было выявление роли мембранных структур в процессах компартментализацни и ассоциации рибосом у различных видов бактерий и связанных с этими процессами биосинтеза и секреции белков.
Основные задачи исследования Работа была направлена на решение следующих задач:
-
Изучение внутриклеточного размещения рибосом у различных штаммов кишечной палочки по основным субклеточным фракциям: гиалоплазменной, нуклеоидной и мембранной.
-
Сравнительное изучение стабильности рибосом к диссоциации при понижающихся концентрациях ионов магния как в отдельных субклеточных фракциях, так и тотальных рибосом из клеток, находящихся в различных физиологических состояниях.
-
Выявлена роль мембранных компонентов в ассоциации рибосом с мембранами.
-
Установление роли прокариотических рибосом и их компонентов в процессе секреции белков.
-
Изучению молекулярных механизмов участия мембран, лежащих в основе процессов компартментализацни и ассоциации с ними рибосом, а также возможной роли этих процессов в секреции белков.
Новизна исследования Впервые нами детально изучено распределение рибосом у кишечной палочки между основными субклеточными фракциями (гиалоплазменной, нуклеоидной и мембранной). В результате проведенных исследований мы показали, что остановка роста культуры кишечной палочки сопровождается перераспределением рибосом между указанными фракциями клеток: относительное содержание рибосом в гиалоплазме возрастает, а в мембранной фракции уменьшается. Такое перераспределение рибосом можно рассматривать как один из механизмов регулирования уровня биосинтеза цитоплазматических и сскретируемых белков в клетке адекватно условиям окружающей среды.
Используя сшивающие агенты и антитела к мембранным белкам, нам удалось показать, что связывание с мембранными структурами 70S рибосом, траспортирующих секреторные белки, осуществляется 505-рибосомной субъединицей за счет белок-белковых взаимодействий определенных белков 50S-pH6ocoMHoft субъединицы с мембранными белками. При исследовании белкового состава 508-рибосомных субъеднниц, выделенных из грамот-рицательных бактерий, нам впервые удалось обнаружить два ассоциированных белка в структуре 508-рибосомных субъединиц гиалоплазменной фракции. На основании полученных экспериментальных данных о корреляции АТФазной активности 50S субъединиц с уровнем содержания в структуре субъединиц белка с молекулярной массой 102 кД, а также четко выраженной реакции преципитации этого белка с антисывороткой, полученной против мембранных антигенов, мы предположили, что он является продуктом гена Sec А.
Кроме того, в структуре 505-рибосомных субъединиц мембранной фракции обнаружен ассоциированный рибосомный белок, образующий интенсивную полосу. Молекулярная масса этого белка 52 кД, почти соответствует расчетной молекулярной массе интегрального мембранного белка Sec Y. Этот белок играет важную роль в процессе секреции белков.
Научно-практическое значение работы Выявление роли мембранных структур в процессе компартмен-тализации и ассоциации рибосом с мембранными структурами позволит более глубоко понять особенности биосинтеза и механизмы секреции белков, синтез которых осуществляется мембра-носвязанными рибосомами. Эти данные могут быть использованы в качестве теоретических основ при разработке методов получения различных экзобелков бактериальных клеток и их промышленного производства, в том чисте белков эукариотических клеток, гены которых клонированы в прокариотические клетки.
Сформулировано новое представление о возможном механизме участия белков Sec А, триггерного фактора и белка Sec Y в процессах, лежащих в основе секреции белков.
Апробация работы Материалы диссертации доложены на 2-ом Всесоюзном совещании «Структурно-функциональная организация микробной клетки» — (Пушино, 28-30 декабря 1987 г.), на Всесоюзном
семинаре «Современные проблемы антнбиотикорезистентности» — (Москва, 23-24 марта 1988г.), на 3-м рабочем совещании «Секреция белков у микроорганизмов» — (Пушино, 19-21 апреля 1988 г.), на Всесоюзной конференции «Регуляция микробного метаболизма» — (Пущино, 12-14 июня 1989 г.), на Всесоюзной конференции «Физиология пищеварения и всасывания» — (Краснодар, 27-29 сентября 1990г.), на II Международном симпозиуме «Реабилитация иммунной системы» — (Дагомыс, 9-11 октября 1990).
Структура работы Диссертация изложена на 331 странице, состоит из введения, 2 глав литературного обзора, 4 глав собственных исследований с описанием методов, результатов исследований, заключения, выводов и библиографии. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 63 рисунками.