Введение к работе
Актуальность проблемы. На обследованной в СССР территории природное очаги чумы занимают около 10 % площади. Интенсивная хозяйственная деятельность и освоение многих очаговых территорий определяют актуальность изучения биологии возбудителя чумы. Поскольку возможно заражение человека и животных, важна своевременная и надёжная оценка потенциальной эпидемической опасности природных очагов. Для решения этой задачи необходимо достоверное обнаружение возбудителя или биологических меток его присутствия в природе, что невозможно без надёжных методов диагностики (Ладный с соавт., 1977; Ротшильд, 1978; Кузнецова с соавт., 1980; Анисимов с соавт., 1986; Голубинский, 1987; Дятлов, 1987; Козлов, 1990).
Создание иммунопрофилактических и иммунодиагностических препаратов на основе известных антигенов чумного миг.рс'^ *э-ллется традиционным направлением в области разработк; „.юсо-бов эффективной защиты от чумной инфекции. Современные методы биохимии и молекулярной биологии позволяют проводить выделение и очистку ряда биологически активных компонентов возбудителя чумы, т&Егіх ;<ік пестацин 1, "мышиный" токсин, фракция I, и ряда ферментов: фосфолипазы, нейраминидазы, фибринолизина. На основе некоторых из низ созданы коммерческие и экспериментальные диагностические и профилактические препараты, успешно при-кзн.'емые в медицинской практике.
Однако в природе встречаются штаммы, не диагносцируеыые традиционными серологическими методами в связи с утратой или репрессией синтеза фракции I, токсина, элиминации плазмид.Поэтому злободневным остается поиск новых видоспецифическях антигенов.
Важная роль в этоа отводится исследованию поверхностных компонентов бактериальной клетки - ее мембранных структур представленных липополисахарид - белковыми комплексами.-
Актуальность исследования мембранных структур определяется их высокой функциональной значимостью в процессах взаимодействия с окружающей средой, г в случае патогенных бактерий - с клетками и тканями макроорганизма. Определяя процессы деления клеток, переноса генетического материала, рецепции бактерио-
фагов и бактериоцинов, наличие заряда клеточной поверхности и адгезивных свойств, мембранные структуры детерминируют широкий спектр иммунобиологических свойств, взаимодействуя с иммунной системой и вызывая значительные изменения в иммунном статусе животного.
Устойчивый интерес к мембранным белкам и липополисахариду со стороны исследователей разных специальностей обусловлен как многообразием функций этих структур, так и тем, что выяснение молекулярных основ их биологического действия связано с решением фундаментальных вопросов иммуногенеза и клеточной рецепции (Соловьева, 1990).
Важным для теории и практической медицины является изучение мембранных белков в связи с возможностью разработки на их основе новых перспективных профилактических и диагностических чумных препаратов. Решение этих задач обеспечит.и ится изучением структуры внешней мембраны, белков и полисахарида, входящих в её состав. Эти исследования возможны при наличии эффективных методов выделения как внешних мембран, так и способов разделения их на компоненты без значительного нардщ ;ния присущих им функций.
Современная биохимия чумного микроба достигла значительных успехов .в исследовании ряда важнейших компонентов клетки - ли-пополисахарида (ЛПС), основного соматического антигена (ОСА) и фракции І ($1). Изучены их иммунохимические и биологические свойства (Дальвадянц, 1968; Боровикова, 1972; Бахрак, 1972, 1973; Вейнблат, 1974; Тараненко, 1988). Эти успехи.стали возможными благодаря разработкам достаточно эффективных методов выделения и очистки гидрофильных белков и липополисахарида с помощью аналитической и препаративной хроматографии.
Исследование другого важного компої ;нта внешней мембраны -её поверхностных белков - потребовало применение новых подходов. Гидрофобное» элементов внешней мембраны не позволяет проводить выделение значительного количества её структурных белков классическими методами и является ограничением использования их в целях создания профилактических и диагностических препаратов. Применение буферных растворов и органических растворителей приводит к освобожпению только слабо связанных белков. Успехи в исследовании гидрофобных структур клетки связаны
с применением детергентов - группы веществ, производящих разрывы гидрофобньпс связей. Известно, что условия обработки детергентами в значительной степени модифицируют' белковые молекулы, их биологические и имыунохимические активности. Нарушение гидрофобных свг'ей часто приводит к потере энзиматической и субстратной специфичности. Вторым важным момеатом, который необходимо учитывать, являются ограничения, связанные с анализом таких структур» так как в гелях для электрофоретического разделения присутствует детергент, а макромолекулы исследуются после их значительной модификации и деструкции. Методические трудности в изучении мембранных белков значительно снижают темпы развития наших знаний о структуре и функции этих полимеров. Тем не менее возрастает понимание конкретного важного значения макромолекулярного соединения мембранных белков и липополиса-харида при их взаимодейотвии с распознающими структурами И гуморальными факторами макроорганизма в процессе реализации их биологической активности.
Кэ вышесказанного следует, что изучение поверхностно.: структур кдзтки чумного микроба - её мембранных белков - представляется актуальной проблемой и их исследование позволит познать многие биологические и иммунохимические закономерности взаимодействуя макро- и микроорганизма, расширить представления о механизме патогенности чумного микроба, использовать их для" диагностики и иммунопрофилактики.
Цель работы- комплексное исследование физико-химической природы и биологической активности внешних мембран чумного микроба, гидрофобных белков и периплазмы, изучение их иммунохимических свойств и иммунобиологической активности. Теоретические и экспериментальное обоснование использования новых антигенов при конструировании препаратов для диагностики и профилактики чумы. '.
Задачи исследования. I/ Разработать оптимальную технологию ввделения внешних и цитоплазматических мембран из разных штаммов .чумного микроба и провести сравнительный анализ их полипептидного состава. 2/ Исследовать биологическую и энзиматическую активность фракций периплазмы, цитоплазмы и мембранных структур. 3/ Провести анализ полипептидного состава клеточных оболочек культур штаммов ахромогенных вариантов
чумного микроба, отличающихся по имыунохимическим свойствам. 4/ Исследовать иммунохимическую активность препаратов внешних мембран чумного микроба. 5/ Разработать на основе препарата мембранных белков и гомологичных антител новые диагностические препараты: диагностикума антигенного, эритроцитарного; диагностикума иммуноглобулинового, эритроцитарного; иммуноглобулинов люминесцирущих; коньпгата пероксидазного, иммуноглобулинового, испытывая их в соответствующих реакциях. 6/ Исследовать протективные свойства препарата мембранных белков. 7/ Провести иммунохимический анализ взаимодействия чумных и псевдотуберкулёзных сывороток с полипептидами препарата мембранных белков с цельв совершенствования новых диагностических препаратов. 8/ Установить закономерности антителогенеза к мембранным белкам у экспериментально зараженных возбудителем чумы лабораторных животных и диких грызунов для объективности оценки результатов полевых испытаний Новых диагностических препаратов.
Научная новизна. Впервые получены и охарактеризованы по физико-химическим показателям фракции внешних и цитоплазматических мембран чумного микроба. Показана их антигенная неоднородность. Выявлены пестициногенная, нейрамини-дазная, фибринолитическая, плазмокоагулазная активности во фракциях периплазмы и цитоплазмы. В периплазме чумного микроба обнаружены "мышиный" токсин и фосфолипаза.
Впервые доказана иммунохимическая активность белков внешней мембраны и солюбилизированных в детергентах мембранных белков. Антитела к мембранным белкам выявлены как в антись'во-ротках к препаратам мембранных белков, так и в чумных коммерческих сыворотках, полученных от лошадей, иммунизированных живой культурой чумного микроба ЕВ. В -...ісперименгах на белых мышах и морских свинках установлена протективная активность препаратов гидрофобных мембранных белков. На основе препарата мембранных белков создан новый эритроцитарный антигеннцй дие^ностикум с высокой активностью (титр в РИГА с антисывороткой превышает 1:250 тыс.), что позволяет использопть его в серологическом анализе при полевых и лабораторных исследованиях материала, подозрительного на чуму. На основе антиси-вороток к препарату мембранных белков впервые сконструирован
иммуноглобулиновый эритроцитарнкЛ диагностикум, способный выявлять штаммы чумного микроба, лишенные фракции I, и штаммы, выращенные при 28 С. Новыми является данные о создании и изучении препаратов люминесцируищпс иммуноглобулинов к мембранным белкам: or-т обнаруживали в люмииесцентно-серологическом анализе культуры чумного микроба вне зависимости от температуры выращивания,.а также при наличии или отсутствии в них собственных плазмид.
Требованиям научной новизны отвечают данные о получении коньюгата "иммуноглобулинов с пероксидазой к мембранным белкам чумного микроба, используемых в иммуноферментном анализе, с помощью которого по схеме двойного антительного сэндвича удаётся определять до 50 нг/мл препарата мембранных белков, что в 50-100 раз ниже концентраций, выявляемой экспериментальным иммуноглобулиновым эритроцитарным- диагностикумом. Методом им-муноблота установлено, что препарат мембранных белков седеп-жит группы полипепгидов, один из которых обладает высока аффинитетом к иммуноглобулинам чумных сывороток, а другие икевт групповую специфичность к иммуноглобулинам из псевдотуберкулёзных сывороток II и У сероваров.
Впервые г.ри эпизоотологическом обследовании с помощью разработанных на основе мембранных белков новых диагностических 'препаратов в сыворотках диких грызунов выявлены положительно реагирующие антитела, не обнаруживаемые коммерческими диагностическими препаратами, диапазон действия которых обусловлен присутствием фракции I чумного микроба.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты, полученные в исследованиях позволяют глубже понять.структурную Организацию и функцию элементов внешней мембраны клеток чумного микроба. Изучение иммунохимических свойств мембранных белков имеет важное значение для разработки вопросов иммунодиагностики и профилактики чумной инфекции.
Результаты иммунохимических исследований явились методической основой для разработки диагностических препаратов и рыхода части исследований в практику обнаружения возбудителя или его маркеров в природе. Установленный факт протективной активности гидрофобных белков открывает новые перспективы для исследований,
направленных на конструирование химических вакцин.
Разработанные нами методы: получение "мышиного" токсина способом аффинной хроматографии, получение периплазматической фракции возбудителя чумы, выделение фосфолипазы и фибринолизи-на из периплазматической фракции вошли в "Методическое пособие по биохимии, генетике и молекулярной биологии возбудителя ЧУМЫ и псевдотуберкулёза", утверждённое ПУКИ Минздрава СССР 12 декабря 1985 г., и "Методические рекомендации по получению из клеток чумного микроба периплазматической фракции и использованию её для выделения фосфолипазы и фибринолизина", одобренные решением Ученого совета ВНИПЧИ "Микроб" 12 января 1981 г. Получено авторское свидетельство на "Способ получения "мышиного" токсина чумного микроба", зарегистрированное в Государственном реестре изобретений СССР за № II52II4 от 22 декабря 1984 г. Данные, дополняющие антигенную характеристику возбудителя чумы включены в программу лекций по биохимии и генетике чумного микроба на курсах специализации по особо опасным инфекциям при ВНИПЧИ "Микроб". На экспериментально разработанные препараты составлены временная фармакопейная статья (ВЮ, экспериментально-производственный регдамент (ЭПР), инструкция по применению препарата, пояснительная записка, техническое задание на диагностикум эритроцитарный чумной витительный на основе мембранных белков, одобренные Ученым советом ВНИПЧИ "Микроб" 20 марта 1990 г. Техническое задание на научно-техническую разработку препарата утверждено Главным эпидемиологическим управлением Минздрава СССР 22 ноября 1990 г., ЭПР - директором ВНИПЧИ "Микроб". Комитетом МИБП разрешены государственные испытания препарата.
Диагностикум чумной антигенный на основе мембранных белков изготовляется в малых сериях по экспери. ентально-производст-венному регламенту и используется в экспериментальной работе. Он внедрен как' дополнительный метод при серологическом анализе материала, подозрительного на чуму. Его применение позволяет обнртэуживать в крови лабораторных животных, зараженных микробом чумы, антитела, отличные от антител к фракции г, выявляемых с помочью коммерческих препаратов в системе серологических реакций. Экспериментальный диагностикум эффективен при анализе сыворотик животных, инфицированных типичными и бескапсульными
штаммами чумного микроба, а также возбудителями чумы, лишеним-*» собственных плаэмид.
Использование нового диагностикума, сконструированного на основе мембранных белков, позволяет повышать эффективность эпизотологического обследования и тем самым будет способствовать своевременному проведении профилактических мероприятий в природных очагих чумы-
Методы выделения периплазматической,фракции используются в работе лабораторий ЕНИПЧИ "Микроб" для получения исходного материала при очистке ряда биологически активных препаратов и ферментов.
На за щи ту выносятся следующие
положения: *
-
Новые данные по биохимическому, электронно-микроскопическому и эдектрофоретическому исследованию препарата внешних мембран различных штаммов чумного микроба.
-
Роль белков внешних мембран в иммунном ответе мак, организма. Изучение антителогенеэа при иммунизации животных культурами чумного микроба и препаратами мембранных белков.
-
Научная аргументация и принципы совершенствования серологического анализа при использовании, новых диагностических препаратов.
-
Диагностическая значимость антителогенеэа к мембранным белкам у диких грызунов и лабораторных яшвотн : при их контакте с возбудитзлем чумы. /
-
Рекомендации по внедрению в лабораторную практику новых диагностических препаратов, созданных на основе мембранных белков и гомологичных антител:
антигенного эритроцитарного диагностикума;
имкуноглобулинового эритроцитарного диагностикума;-
иммуноглобулинов люминесцирущих;
коньюгата пероксидазного иммуноглоб.улинового. Апробация. Материалы диссертации были представлены
л доложены на Всесоюзном симпозиуме "Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов" Шущино, 1978), 4-м Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1979), Всесоюзной конференции "Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры" (Саратов, I960), рабочем совещании "Биохимия клеточной поверхности
грамотрицательных микроорганизмов"(Саратов, 1984), Всесоюзной научно-практической конференции "Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций" (Ставрополь, 1986),Всесоюзной конференции "Биология возбудителей инфекционных болезней и их экспреседиагностика" (Горький, 1987), Всесоюзной кон-ферепция по химии и биохимии углеводов (Тбилиси, 1987), П-й Всесоюзной конференции "Актуальные попроси теоретической и прикладной инфекционной иммунологии. Механизмы противоинфекционного иммунитета" (Саратов, 1987), 1-м Всесоюзном симпозиуме по препаративной хроматографии физиологически активных веществ (Ленинград, 1988), XII Всесоюзной конференции по. природной очаговости болезней (Новосибирск, 1989), Всесоюзной конференции "Регуляция микробного мекіГіолнімі" (Пущино, 1989), Всесоюзной ьду-чно-практичеекчй конференции (Владивосток, 1989), научно-производственном совете работников противочумных учреждений (Ташкент, I9CJ9), Всесоюзной конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, 1.990), Всесоюзном симпозиуме по химии белков (Тбилиси, 1990), традиционных ежегодных научных конференциях ВНИГНИ "Микрсб".
Материалы диссертации оформлены на основе 5 научных отчетов (1975-1990 гг.) по законченным НИР, выполняпшимся в соответствии с планами Министерства здравоохранения СГОР.
Публикация. Основное содержание предложенного материала опубликовано в 30 научных статьях и авторском свидетельстве "на изобретение.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения.главы обзора литературы, 5 глав, отражающих результаты собственных исследований по теме, заключения и выводов, иллюстрирована 30 таблицами и 30 рисунками. Указатель литературы содержит ?8'" отечестве.шых и If"^ иностранных источников.