Введение к работе
Актуальность проблемы. Специфическая профилактика коклюша продолжает оставаться актуальной проблемой (Fine,1988). Уровень заболеваемости коклюшем в последние 10-15 лет практически не имеет тенденции к снижению (М.П.Дубровина и др..1991). Одной из основных причин сложившейся ситуации является сокращение иммунной прослойки из-sa негативного отношения педиатров и .родителей к корпускулярной коклюшной вакцине (ККВ), что обусловлено ее реактогенностью, являющейся источником тяжелейших поствакцинальных местных и общих реакций (В.П.Брагинская, А.Ф.Соколова, 1990; Turner-Lo*e. 1991). В связи с этим усовершенствование коклюшного компонента АКДС-вакцины и создание новых вакцинных коклюшных препаратов с максимально сниженными рёактогенными свойствами при сохранении высокой шшуногенности является одной из актуальных задач профилактической медицины (Н.С.Захарова и др..1992). В настоящее время во многих странах проводятся интенсивные исследования по конструированию вакцинных препаратов нового типа, содержащих отдельные антигены и токсические компоненты коклюшного микроба, лишенные повреждающих, эффектов, но обладающие выраженными протективными свойствами (Р.П.Чупрынина и др.,1990; Р.М.Волга-рева и др., 1992; Munoz, Peacock,1989; P-reston е. а. ,1990; Savage е.а. ,1990). В этом плане большой, интерес представляет коклюшный диализатный антиген (КДА), содержащий иммуногенные іюм-доненты Bordetella pertussis (филаментозный гемагглютинин, агглютиногены, коклюшный токсин) (Е.П.Москаленко и др.,1980-1992). . Совершенствование существующих и создание новых коклюшных препаратов требует разработки надежных стандартов оценки их иммунологической'.эффективности и безопасности, что в свою очередь предполагает детальное изучение механизмов взаимодействия коклюшных препаратов с иммунокомпетентными клетками и выяснение роли такого взаимодействия в формировании резистентности к коклюшу. Известно, что напряженность иммунитета во многом зависит от реактивности системы моионуклеарных фагоцитов (СМФ), клетки которой благодаря антигенпредставляю-щей, иммуномодулирующей и оффекторной функциям участвуют во всех формах иммунного ответа, являясь одновременно участниками и регуляторами любой иммунной реакции (И.С.<Т<рейдлин,1М4;
В.А.Козлов,1980; В,М.Зємсков,1989). В связи с этим представляг ет интерес изучение и характеристика коклюшных препаратов на модели клеток СМФ. Несмотря на имеющиеся в настоящее время литературные данные о модулирующем действии ККВ и КДА на перито-неальные макрофаги в процессе формирования- противококлюшного иммунитета (И.А.Андреева,1990), расшифрованы далеко не все механизмы взаимодействия коклюшных препаратов с клетками СМФ и их роль в формировании противококлюшного иммунитета и иммунопатологических реакций, обусловливающих поствакцинальные осложнения. Отсутствуют, в частности, данные о дифференцировке и перераспределении клеток СМФ в процессе формирования противококлюшного иммунитета. Ограничены и противоречивы сведения об активации макрофагов, предшествующей усилению их киллерной способности и об иммунорегуляторной функции этих клеток. Отсутствуют данные о возможном цитотоксическом действии коклюшных препаратов на клетки СМФ, а также по ряду других вопросов. Кроме того,ранее не проводился корреляционный анализ взаимосвязи между способностью различных коклюшных препаратов модулировать свойства клеток СШ и другими особенностями этих препаратов. Вместе с тем решение перечисленных вопросов позволит выяснить значение отдельных механизмов взаимодействия коклюшных препаратов с клетками CMS .в "формировании противококлюшного иммунитета и даст возможность разработать адекватные экспериментальные модели с использованием- культуры макрофагов для оценки их иммунологической эффективности и безопасности.
Цель настоящего исследования - изучение механизмов взаимодействия коклюшных, препаратов с клетками СМФ In vitro и In vivo, выяснение роли отдельных механизмов такого взаимодействия в формировании противококлюшного иммунитета и иммунопатологических процессов, а также создание адекватных экспериментальных моделей для ускоренной оценки иммунологической эффективности и безопасности вакцинных коклюшных препаратов.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Получить очищенный препарат КДА с высокой протективной активностью и изучить его биологические свойства в сравнении с исходным КДА и ККВ.
-
Определить влияние исследуемых коклюшных препаратов на макрофагальную трансформацию моноцитов периферической крови в процессе формирования противококлюшного иммунитета.
-
Исследовать динамику изменения композиции суОполулнций перитонеальных макрофагов мышей, иммунизированных коклюшними препаратами.
-
Определить влияние коїслюшішх препаратов на активность 5'-нуклеотидазы и оксиднтивных процессов в макрофагах.
-
Изучить способность коклюшных препаратов индуцировать синтез ФИО-а и фактора, активирующего хемотаксис нейтрофилов.
-
Выявить возможность КДЛ и фракции 2 К-ЧЛ вызывать реакцию исчезновения макрофагов и исследовать ее ді<.,:;лмку при формировании противококлюшного иммунитета.
-
Определить цитотоксическое действие коклюшных препара тов на первичную культуру перитонеальных макрофагов и перевиваемую моноцитоподоОную линню клеток человека U 937.
-
Провести корреляционный анализ взаимозависимости между изменениями свойств клеток СМФ под влиянием коют.чвных препаратов и способностью отих препаратов вызывать формирование противококлюшного иммунитета и индуцировать иммунопатологические реакции.
-
Разработать экспериментальные модели с использованием клеток СМФ для характеристики иммунологической эффективности и безопасности коклюшных препаратов.
Научная новизна:
Получена фракция КДА, в которой концентрируются биологически активные компоненты исходного препарата, обеспечивающие ее високую про'іектишг/ю активность.
Установлена способность коклюшных препаратов модулировать показатель макрофагалыюй трансформации моноцит".!» периферической крови, активность Ь'-нуклоотидалы и оксидатилных процессов в макрофагах. Вшижта динамика этих показателей и прл-цессе формирования протипокооюшного иммунитета її зависимости от характера и дозы препаратов.
Показано, что иммунизация коклюшными препаратами вк'зч-вает перераспределение суСпопуляций перитонеалын:/. макрофзгев.
интенсивность которого коррелирует с резистентностью экспериментальных животных к коклюшу.
Выявлена способность коклюшных препаратов индуцировать синтез и секрецию ФНО-а и фактора, активирующего хемотаксис нейтрофилов, и зависимость этих процессов от характера и дозы препарата.
Показана динамика реакции исчезновения макрофагов в процессе формирования противококлюшного иммунитета и ее корреляция с протективной активностью коклюшных препаратов.
Обнаружено цитотоксичёское действие ККВ на первичную культуру перитонеальных макрофагов и перевиваемую моноцитопо-добную линию клеток человека U 937 in vitro, носящее дозоза-висимый характер и коррелирующее с токсическими свойствами ККВ, выявляемыми в тестах in vivo. Показано отсутствие цито-токсического эффекта на клетки CN№ у КДА и фр.2 КДА.
Теоретическая и практическая значимость работы.:
Установлено значение отдельных механизмов взаимодействия коклюшных препаратов с клетками СМФ в формировании противококлюшного иммунитета и в развитии иммунопатологических процессов поствакцинального периода. '
Выявлен однотипный характер влияния коклюшных препаратов, на те свойства макрофагов, модуляция которых опосредует их участие в формировании резистентности к возбудителю коклюша,. и разнонаправленный - в отношении свойств этих клеток, опосредующих их значение в развитии иммунопатологических процессов поствакцинального периода.
Разработаны и внедрены в практику научных исследований новые патогенетически обоснованные экспериментальные модели, использующие культуру макрофагов для ускоренной оценки иммунологической эффективности и безопасности коклюшных препаратов.
Разработанные модели могут также применяться в производстве коклюшных препаратов для оценки их иммуногенности и токсичности. С помощью предложенных тестов подтверждена целесообразность использования КДА при конструировании коклюшных вакцин нового типа и установлена перспективность дальнейшего изучения фр.2 КДА как потенциального компонента таїсих препаратов
Материалы исследований легли в основу методических рекомендаций по оценке протективной активности коклюшных препаратов с помощью индекса перераспределения субпопуляций макрофагов (утверждены Ученым Советом РМИ, 1994) и заявки на предполагаемое изобретение "Способ оценки токсичности коклюшных препаратов"..
Основные научные положения» выносимые на защиту:
1. В процессе формирования противококлюшного иммунитета под влиянием ККВ и бесклеточных коклюшных препаратов усиливается макрофагальная трансформация моноцитов крови, происходит перераспределение субпопуляций в суммарном пуле перитонеальных макрофагов, снижается уровень 5'-нуклеотидазы и активируется кислородзависимый метаболизм в этих клетках.
2.Коклюшные антигенные препараты стимулируют синтез ФНО-а и фактора, активирующего хемотаксис нейтрофилов, интенсивность которого зависит от характера и дозы препарата.
-
ККВ, в отличие от КДА и фр.2 КДА, обладает цитотокси-ческим эффектом при взаимодействии In vitro с первичной культурой перитонеальных макрофагов и перевиваемой моноцитоподобной линией клеток человека U 937, носящим дозозависимый характер и коррелирующим с токсическими свойствами этого препарата, выявляемыми в тестах In vivo.
-
Модуляция свойств макрофагов, опосредующих их участие в формировании резистентности к возбудителю коклюша, носит однотипный характер ' для всех изученных коклюшных препаратов, а изменение свойств этих клеток, определяющих их значение в развитии иммунопатологических процессов, - разнонаправленный. КДА и фр.2 КДА, в отличие от ККВ, не индуцируют участие макрофагов в побочных реакциях.
/'..' 5. Новые экспериментальные модели с использованием клеток СМФ, разработанные на основе выявленных корреляционных связей между отдельными свойствами коклюшных препаратов, могут применяться для . характеристики иммунологической эффективности и безопасности коклюшных антигенов.
Апробация работы;
Материалы, изложенные в диссертации, доложены и обсуждены
т 8 -
на конференциях молодых ученых и специалистов РМИ (Ростов-на-Дону,1989,1990,1994), на юбилейной конференции РОДНМИ (1990), на областной научной конференции "Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций" (Ростов-на-Дону,1989), на VI Всесоюзном съезде микробиологов , эпидемиологов и паразитологов (Нижний Новгород, 1991), IV Пущинском Совещании "Культивирование клеток животных и человека"(1994).
Публикации:
Основные материалы диссертации опубликованы в 9 научных работах.
Структура и объем диссертации Работа изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 16 таблицами и 14 рисунками. Библиография включает 243 источника, в том числе 153 зарубежных.