Содержание к диссертации
Введение
Глава I Биология и физиология люминесцентных бактерий 8
1. Таксономия люминесцентных бактерий и основные характеристики Photorhabdus luminescens
2. Биологические особенности Photorhabdus luminescens 10
3. Физиологические свойства Photorhabdus luminescens 13
4. Контроль синтеза и активности люминесцентной системы 16
Глава II Люминесцентные системы бактерий 19
1. Реакция бактериальной люциферазы. 19
2. Связь люминесцентной системы с электрон-транспортными цепями бактерий 19
3. Структура бактериальной люциферазы 21
4. Механизмы бактериальной люминесценции 24
Глава III Генетическая организация /їа-оперона люминесцентных бактерий 26
Глава IV Аналитическое применение микроорганизмов, содержащих /га-опероны
1. Использование диких типов люминесцентных бактерий в мониторинге объектов окружающей среды 33
2. Биосенсоры на основе генно-инженерных микроорганизмов, содержащих /г/х-опероны з Экспериментальная часть
Глава V Объекты и методы исследования 49
Результаты исследования
Глава VI Клонирование и определение нуклеотидной последовательности /га-оперона Photorhabdus luminescens ZM1 57
1. Рестрикционное картирование /га-оперона Photorhabdus luminescens ZM1 57
2. Экспрессия /их-генов Photorhabdus luminescens ZM1 59
3. Определение нуклеотидной последовательности генов ІихА и ШхВ Photorhabdus luminescens ZM1 61
Глава VII Изучение температурных зависимостей интенсивности биолюминесценции генно-инженерных бактерий Escherichia coli, содержащих /га-гены Photorhabdus luminescens ZM1 65
Глава VIII Определение токсичности с использованием биосенсора на основе /их-генов Photorhabdus luminescens ZM1 69
Обсуждение результатов 79
Выводы 87
Список цитируемой литературы
- Биологические особенности Photorhabdus luminescens
- Связь люминесцентной системы с электрон-транспортными цепями бактерий
- Биосенсоры на основе генно-инженерных микроорганизмов, содержащих /г/х-опероны
- Определение нуклеотидной последовательности генов ІихА и ШхВ Photorhabdus luminescens ZM1
Биологические особенности Photorhabdus luminescens
Ph. luminescens являются симбионтами кишечного тракта свободноживу-щей третьей ювенильной стадии энтомопатогенных нематод рода Heterorhabditis, принадлежащего к семейству Heterorhabditidae, и паразитами широкого ряда насекомых и их личинок. В личинках нематод бактерии находятся в пищеварительном тракте. На этой стадии личинки не питаются, их пищеварительный тракт замкнут и бактерии находятся в нем в чистой культуре. Нематоды, несущие эти микроорганизмы, находят в почве насекомое и проникают в него через естественные отверстия: рот, анус, дыхальца или межсегментные мембраны (Hosseini, Nealson, 1995; Ни, Webster, 1998).
После внедрения в насекомое нематода выделяет в гемоцель специальный токсин - ингибитор иммунной системы насекомого (Brehelin, Boemare, 1988), а также бактерий-симбионтов (Fischer-Le et al., 1998). Бактерии проникают в гемолимфу насекомого и, быстро размножаясь там, приводят к его гибели через 1-3 суток (Thomas, Poinar, 1979). Во время стационарной фазы роста бактерии синтезируют целый ряд метаболитов, способствуя развитию нематод в процессе паразитизма. Трупы погибших насекомых окрашиваются бактериальным пигментом, идентифицированным как 1,6-дигидрокси-4-метокси-9,10-антрахинон, в красный цвет и люминесцируют за счёт функционирования бактериальной люминесцентной системы (Richardson et al., 1988). Нематоды также светятся, но слабее, так как концентрация бактерий в их кишечнике (где они, по-видимому, не размножаются) много ниже. Кроме этого, бактерии Ph. luminescens в насекомом образуют антибиотические вещества (гидроксистилбеновые антибиотики) (Paul et al., 1981; Akhurst, 1982; Richardson et al., 1988), внеклеточные протеазы и липазы (Schmidt et al., 1988; Wee et al., 2000), внутриклеточные белковые кристаллы (Boemare et al., 1983), бактериоцины (Baghdiguian et al, 1993). В погибшем насекомом нематоды активно размножаются, питаясь бактериальной биомассой и тканями насекомого, подвергшимися воздействию внеклеточных липаз и протеаз бактерий-симбионтов, проходят последующие стадии развития и вновь достигают инфекционной стадии. Перед тем как покинуть труп насекомого, личинки Heterorhabditis накапливают клетки бактерий-симбионтов Photorhabdus в своем кишечнике, обеспечивая сохранность симбиотической ассоциации в следующих поколениях (Fisher-Le et al., 1998).
Симбиоз нематоды и бактерий носит мутуалистический характер, но до конца взаимоотношения этих двух партнеров еще не установлены. Результаты исследований позволили сделать заключения о сложности и многокомпонентности факторов вирулентности комплекса микроорганизмы -нематода, которые приводят к гибели насекомых. Эти факторы - токсины нематод и бактерий, экзоферменты, антибиотики. Если нематоды не имеют бактериальных симбионтов, то инвазия редко ведет к гибели насекомого-хозяина, что приводит к нарушению жизненного цикла нематоды (Hosseini, Nealson, 1995).
За исключение единственного штамма Human Wound (Hw), выделенного из загрязненных почвой ран человека и способствующего их заживлению (Hastings, Nealson, 1981; Farmer et al., 1989; Colepicolo et al, 1989), все известные представители рода Photorhabdus являются симбионтами нематод. Однако в настоящее время интенсивно обсуждается возможность существования свободноживущих форм таких бактерий. Так, были проведены работы по изучению способности выживать в почве различных штаммов Ph. luminescens, выделенных как из энтомопатогенных нематод, так и из ран человека. Существует мнение, что Ph. luminescens не способны жить в почве, и, следовательно, являются высокоспециализированными паразитами, вся жизнь которого протекает внутри тела хозяев без контакта с внешней средой. Способность к свечению, по-видимому, способствует циркуляции этих бактерий между хозяевами, для одного из которых они являются полезным симбионтом, для другого - паразитом. Другие исследователи утверждают, что штаммы этих бактерий способны выживать и расти в первоначально простерилизованной почве (Гительзон, 1984; Bleakley, Chen, 1999).
В связи с особенностями жизненного цикла было предложено использовать энтомопатогенные нематоды с их бактериальными симбионтами для биологического контроля над насекомыми. Было показано, что бактерии рода Photorhabdus не представляют опасности для теплокровных позвоночных (Boemare et al., 1996). Однако к массовому разведению энтомопатогенных нематод для биологического контроля над насекомыми следует все же относиться с большой долей осторожности (Babic et al., 2000).
При изучении роста и люминесценции бактерий Ph. luminescens штамма Hb in situ в инфицированных бактериями личинках большой восковой моли Galleria mellonella L. (на одну личинку вводили 20 мкл суспензии бактерий с 105 кл/мл) было установлено, что скорость роста бактерий в личинке была достаточно высокая: при 24С бактерии удваивались за 2,5 - 3 часа. К 40 часам после инфицирования бактериями личинок насекомого число бактерий на одну личинку (при измерении в гомогенате личинки) составляло не менее 10 кл/мл, но точное число бактерий методически установить было трудно. Через 16-48 часов после инфицирования бактериями личинки G. mellonella L. погибали. Видимое (после адаптации глаза к темноте) свечение личинок наблюдается уже через 20 часов после инъекции бактерий. Интенсивность свечения личинки нарастает, достигая максимума через 24 часа и медленно снижается, оставаясь слабой, но определяемой люминометром более 23-х суток (Poinar et al, 1980).
Связь люминесцентной системы с электрон-транспортными цепями бактерий
Для оценки степени загрязнения почвенных вод алканами со средней длиной цепи был создан люминесцентный сенсор на основе Е. coli DH5 alpha(pGEc74, pJAMA7), несущий на двух различных плазмидах регуляторний ген alkS из Pseudomonas oleovorans и ген PalkB P. oleovorans, слитый с генами luxAB V. harveyi. Такой биосенсор успешно индуцировался типичным индуктором -системы октаном. Эмиссия света после 15 минут индукции линейно коррелировала с концентрацией октана в интервале от 0,025 до 0,1 микромолей (Sticher et al., 1997).
Присутствие полициклических ароматических углеводородных соединений может быть обнаружено при использовании /шс-генов под контролем промоторов, контролирующих экспрессию белков деградации этих соединений. Так, бактерии P. putida штамма RB1353, содержащие две плазмиды: NAH7 и pUTK9, использовали для детекции нафталина (Neilson et al., 1999). Плазмида NAH7 (83 тыс. н.п.) содержит два различных оперона катаболизма нафталина, один из которых деградирует нафталин в салицилат, тогда как другой отвечает за метаболизм салицилата (Yen, Serdar, 1988). Плазмида pUTK9 несет гены luxCDABE V. fischeri под контролем промотора Vnah. Ген nahR транскрибируется конститутивно, но белок NahR активируется только при связывании с индуктором - салицилатом. Сравнение деградационной активности двух штаммов P. putida RBI353 (NAH7, pUTK9) и RBI353 (NAH7) не показало существенного влияния экспрессии pUTK9 на эффективность утилизации салицилата (3,1 и 2,7 мг/л в час соответственно). Однако, некоторые особенности, такие как фаза роста P. putida RBI353 (NAH7, pUTK9) и концентрация субстрата могут осложнить их использование в качестве биосенсора. Так, максимальная чувствительность к низким концентрациям салицилата, наблюдаемая у клеток ранней стационарной фазы P. putida RBI353 (NAH7, pUTK9) была на два порядка выше, чем у клеток логарифмической фазы роста, тогда как деградационная активность была наибольшей в логарифмической фазе. При добавлении к культуре P. putida RB1353 (NAH7, pUTK9), содержащей 4,5x10 клеток/мл, 20 мг/л салицилата свечение достигало максимума за 3 часа, тогда как при внесении 1 мг/л интенсивность люминесценции достигала большего максимума за 40 минут (Neilson et al., 1999). Вероятно, подобный подход, направленный на создание специфичных промоторов, имеет большое будущее.
В настоящее время /га-система является одной из наиболее распространенных репортерных систем, используемых в различных живых организмах для поиска промоторов, изучения экспрессии генов и мониторинга роста. Так, например, челночные вектора pJE205 и рВВ128 с /га-генами V. fischeri и V. harveyi соответственно, способные реплицироваться как в Е. coli штамма НВ101, так и в штаммах Anabaena spp., были использованы для поиска промоторов, вовлеченных в процесс дифференциации клеток нити Anabaena spp. в гетероцисты. Плазмиды, несущие ген неомицинтрансферазы из Тп5, были мобилизованы в АпаЪагпа spp. с участием RP4 в качестве конъюгативной плазмиды. Колонии клеток, содержащих плазмиды с /шг-генами под контролем промотора рибулозобисфосфаткарбоксилазы или нитрогеназы Anabaena spp., были идентифицированы в темной комнате, когда фильтр, смоченный 0,1% раствором н-деканаля, был прикреплен к чашке Петри. Для количественного определения световой эмиссии генно-инженерных цианобактерий при плотности 4x105 клеток/мл был использован Lai Line АТФ-фотометр 9140. Уровень экспрессии люциферазы в цианобактериях (выше 7000 квантов/клетку в секунду), показал, что гены ІглхА и ЫхВ являются хорошим репортером для поиска промоторов (Schmetterer et al., 1986).
Другим большим направлением использования /га-системы является мониторинг роста бактерий. Недавно подобные исследования были проведены на периодических культурах Е. coli. Биолюминесценция и колониеобразование культуры увеличивались и уменьшались пропорционально и хорошо коррелировали во время всех фаз роста при температуре 28-40С. В поздней логарифмической фазе биолюминесценция и колониеобразование резко увеличивались, тогда как в стационарной фазе эти характеристики уменьшались. В конце культивирования люминесценция не наблюдалась, а способность к колониеобразованию все-таки оставалась. Это показывает, что метаболизм в клетках может сохраняться на очень низком уровне (Marines, 2000). Изучение закономерностей старения рекомбинантного штамма Е. coli Z905(Apr Lux+), содержащего плазмиду pPHL7 (Illarionov и др., 1990) с полным /шг-опероном P. leiognathi под контролем /ас-промотора, в водных микроэкосистемах показало, что клетки Е. coli более года выживают и сохраняют способность к экспрессии клонированных /шг-генов (Попова и др., 1998; Каргатова и др., 2001; Попова и др., 2001).
Описан метод мониторинга адгезии потенциального пищевого патогена человека на поверхности тканей крупного рогатого скота на основе биолюминесцентного репортера-бактерии Е. coli 0157:Н7, трансформированных плазмидой pCGLSl, содержащий полный /шс-оперон Ph. luminescens. Штамм-репортер был суспендирован в буфере и инокулирован на поверхность тканей крупного рогатого скота; адсорбированные бактерии наблюдали in situ с помощью чувствительной камеры. Использование полного /га-оперона устраняет необходимость добавления экзогенного субстрата и позволяет следить за динамикой развития популяции бактерий на поверхности животных тканей. Биолюминесценция хорошо коррелировала с числом бактериальных клеток (ґЧ),98) (Siragusa et al., 1999).
Было также изучено выживание бактерий Bordetella bronchiseptica в фагоцитах мыши. Использование полного /ш:-оперона Ph. luminescens под контролем промотора мини-Тп5 позволило измерять люминесценцию без добавления экзогенного субстрата. Внутриклеточные люминесцентные клетки В. bronchiseptica в фагоцитах мыши наблюдали через 24 и 48 часов после ее внутрибрюшинного заражения при помощи люминометра и электронного микроскопа (Forde et al., 1998). Бактерии Yersinia pseudotuberculosis, несущие гены ІихАВ V. harveyi, слитые с генами устойчивости к фагоцитозу, были использованы для изучения вирулентного действия этих патогенов на селезенку мышей (Forsberg, Rosqvist, 1993).
Недавно были проведены исследования по люминесцентному мониторингу Staphylococcus aureus в живых мышах. Штаммы S. aureus были трансформированы с использованием челночной плазмиды рМК14, содержащей полный /wx-оперон luxCDABE из Ph. luminescens. Клетки S. aureus, содержащие эту конструкцию под подходящей промоторной последовательностью, имели высокий уровень биолюминесценции, позволяющий выявлять менее 100 колониеобразующих единиц (КОЕ) при прямом подсчете клеток в экспоненциальной фазе роста в жидкой среде. Эти бактерии стабильно люминесцировали при 37С, не требуя добавления экзогенного альдегидного субстрата.
Биосенсоры на основе генно-инженерных микроорганизмов, содержащих /г/х-опероны
Динамика отклика, как правило, зависела от времени экспозиции токсикантов с бактериями. В таблице 5 представлен динамический отклик биолюминесценции биосенсора Эколюм-8, измеренный по величине остаточного свечения (в % от интенсивности биолюминесценции бактерий до внесения токсического вещества) через 5, 15 и 30 минут экспозиции с поллютантами. В качестве веществ, способных оказывать токсическое действие на бактериальный биосенсор, использовали ионы металлов (Cd , Сг , Си , Hg и Zn" ) и органические соединения - анилин, ацетон, бензол, дихлорэтан, мочевину, а-нафтол, фенилэтанол, формальдегид, толуол и три (2-, 3- и 4-) хлорпроизводных фенола. Для большинства веществ видно, что наибольшие изменения в интенсивности биолюминесценции происходили в течение Таблица 5
Динамика тушения биолюминесценции биосенсора Эколюм-8 в зависимости от времени его экспозиции с поллютантами. Поллютант Концентрация,мг/л Остаточное свечение, % минут 15 минут 30 минут Cd2+ 0,5 0,4 0,3 0,2 22 31 42 44 818 29 29 2 13 24 23 Cu2+ 0,125 0,100 0,075 0,050 61 687477 21 38 41 51 721 23 34 Hg 0,0025 0,0020 0,0015 0,0010 83 93 93 95 20 48 50 64 112 20 39 Zn2+ 0,275 0,250 0,225 0,200 43 51 5874 3952 57 69 40 54 5873 Анилин 10 8 6 4 33 38 47 55 23 30 4052 1927 38 56 Ацетон 15800 7900 3950 1975 626 5873 320 57 67 2 18 69 88 Дихлорэтан 2506 1253 626 313 5163147 5152637 415 24 32 Мочевина 40000 35000 30000 25000 33 4147 47 1929 2933 12 24 2125 а-нафтол 40 30 20 10 23 31 46 51 2027 42 47 18 25 43 48 продолжение Таблицы Поллютант Концентрация,мг/л Остаточное свечение, % минут 15 минут 30 минут Толуол 693520347 173 7 11 16 31 691530 5 8 1837 Фенилэтанол 1514757 378 189 10 28 43 60 720 31 45 516 26 40 Формальдегид 40 30 20 10 59 59 6878 45 49 58 67 37 46 56 68 Метахлорфенол 70 60 50 40 15 17 19 24 12 1517 22 10 14 1621 Парахлорфенол 70 60 50 40 11 15 19 21 11 14 17 21 13 15 18 24 первых пяти минут экспозиции и после 30 минут практически отсутствовали, поэтому время экспозиции биосенсора с токсикантами было ограничено 30 минутами. Отклик биосенсора в зависимости от времени его экспозиции с различными концентрациями анилина представлен на рис. 15.
Однако реакция на бензол отличалась от реакции на другие исследованные вещества, но была схожей для всех трех биосенсоров. Так, если для ионов Си2+ с увеличением времени экспозиции наблюдается возрастание величины токсичности, то для бензола, вслед за резким увеличением индекса токсичности в течение первых 5 минут, следует его дальнейшее постепенное снижение. Такое "анормальное" поведение бензола и некоторых других органических веществ уже отмечалось рядом исследователей, применявших в качестве тест-объектов морские люминесцентные бактерии V. fischeri (Wagner О І і і і і і і і
Отклик биосенсора Эколюм-8 в зависимости от времени его экспозиции с различными концентрациями анилина. Концентрации анилина: 1- 10 мг/л; 2- 8 мг/л; 3- 6 мг/л; 4- 4 мг/л. Температура измерения 37 С. По оси абсцисс отложено время экспозиции бактерий с анилином, по оси ординат - интенсивность биолюминесценции (I) бактериальной суспензии в процентах. et al., 1989). Механизм такого поведения до конца не ясен, однако подобная тенденция, обнаруженная ранее рядом исследователей, работавших с природными люминесцентными бактериями, подтверждается и нашими данными, полученными при использовании генно-инженерных штаммов Е. coli K-12TG1.
Основными параметрами широко распространенных тест-систем на основе бактериальной биолюминесценции являются величина 50%-го ингибирования свечения бактерий ЕС5о, коррелирующая с ответной реакцией высших организмов LD50 и выражающаяся в виде концентрации известного вещества или объема, и установленная нижняя граница острой токсичности ЕС20, вызывающая 20%-ное тушение свечение бактерий в опыте по сравнению с контролем и выражающаяся также в виде концентрации известного вещества или объема.
Вычисление величин ЕС20 и ЕС50 Для выбранных веществ проводили с использованием гамма-функции. Гамма-функция (Г) представляет собой зависимость отношения потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и описывается формулой: Г=(1о-1)Л, где 1о-интенсивность биолюминесценции контрольного образца, 1-интенсивность биолюминесценции опытного образца. По полученным данным при выбранном времени экспозиции биосенсора с токсикантом строили график зависимости величины lgr от различных концентраций вещества в образце. Этот график теоретически является прямой линией и отражает молекулярность взаимодействия токсического вещества с одной или несколькими мишенями тест-объекта.
Функция Г очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая или, наоборот, когда образец сильно токсичен. Данная операция предназначена для быстрого выяснения вопроса, при каких объемах (в модельных опытах - концентрациях) исходного слабо токсического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или ЕС50) или при каких разведениях сильно токсический образец станет безопасным. Затем искали точку пересечения прямой со значением lgr = 0(T= 1, Т = 50) и lgT = - 0,6 (Г = 0,25, Т = 20) и рассчитывали величины ЕС2о и ЕС5о по каждому из тестируемых веществ. Численно величины ЕС выражали в виде концентраций или объемов (рис. 16).
Для исследованных поллютантов проведен корреляционный анализ значений ЕС50, полученных на биосенсоре Эколюм-8 (Е. coli К-12 TG1 (рХеп7)), с величинами ЕС50, полученными на биосенсоре Microtox на основе морских люминесцентных бактерий V.fischery (Kaiser, Ribo, 1988) (табл. 6).
Выявлено, что созданная нами аналитическая система Эколюм-8 на основе люминесцентной системы Ph. luminescens ZM1 чувствительна к широкому ряду токсических веществ, величина тушения свечения ЕС50 коррелирует с таковой у биосенсора Microtox, а, следовательно, с величиной LD50 для высших животных (Steinberg et al., 1995; Kaiser, 1998) и позволяет в отличие от других систем проводить анализ при более высоких температурах.
Определение нуклеотидной последовательности генов ІихА и ШхВ Photorhabdus luminescens ZM1
Таким образом, рассмотрев вопросы состава и локализации люминесцентной системы, структуры люциферазы и механизма действия фермента и наши данные о составе /мх-оперона Ph. luminescens штамма ZMl, можно сделать вывод о большом сходстве между ферментами морских люминесцентных бактерий и почвенных Ph. luminescens. Существенное отличие, на наш взгляд, видно в экологической нише, занимаемой этими бактериями, и, как следствие, возможной роли биолюминесценции в процессе их жизнедеятельности. Этот вопрос дискуссионно можно рассмотреть в рамках двух гипотез: экологической (как приспособление к среде обитания) и метаболической (или ферментативной). Кажется весьма вероятным, что люминесценция Ph. luminescens, вызывающая свечение трупов насекомых, как и красный пигмент, выделяемый бактериями и окрашивающий трупы насекомых, привлекает к себе других животных. Слабой стороной этой гипотезы является тот факт, что при развитии нематод ко времени образования свободноживущей третьей стадии личинок, которая переносит симбиотические бактерии, труп насекомого уже становится достаточно темным. Неизвестно также, привлекает ли в почве насекомых-хозяев слабый свет, излучаемый бактериями-симбионтами личинки нематоды. Кроме того, неизвестно, как долго эти личинки нематод могут находиться в почве, хотя в лаборатории они могут храниться в течение года при 7С в 2,5 % растворе NaCl (Milstead, Poinar, 1978). Приспособительная роль люминесцентной системы для Ph. luminescens штамма Hw, изолированного из раны человека, кажется уж совсем невероятной (Colepicolo et al, 1989; Nealson, Hastings, 1992). По другой гипотезе люминесцентная система в клетках бактерий играет совершенно иную роль, выполняя специфическую метаболическую функцию, не связанную непосредственно со светоиспусканием (Nealson, Hastings, 1992). Функция люциферазы может быть связана с окислением разных гидрофобных соединений, но только в случае взаимодействия люциферазы с алифатическим альдегидом продуктом реакции может быть квант света (Данилов, Егоров, 1990). Поэтому однозначного ответа о роли интенсивного свечения бактерий Ph. luminescens до сих пор нет.
Исследования генетической организации Ph. luminescens создали предпосылки к возможности конструирования аналитической системы на основе их /ш:-оперона. Большинство аналитических применений бактериальной биолюминесценции, описанных до сих пор, основываются на использовании препаратов очищенной люциферазной системы (Danilov, Ismailov, 1989). Тем не менее в главе 4 обзора литературы мы рассмотрели примеры применения непосредственно живых клеток (как диких, так и генно-инженерных штаммов) для создания биосенсоров различной направленности. Результаты наших экспериментов по конструированию и испытанию биолюминесцентного фенотипа Е. coli со встроенным /га-опероном liaCDABE из Ph. luminescens ZM1 подтверждают перспективность такого подхода.
Основной практической задачей было получение биосенсора, который в отличие от тест-системы Microtox, способен функционировать при повышенных температурах измеряемой пробы или окружающей среды. Была показана высокая устойчивость к температурной инактивации интенсивности биолюминесценции генно-инженерного штамма Е. coli РК202 AdnaKJ, содержащего гены ІихА и luxB Ph. luminescens ZM1. При выдерживании бактерий Е. coli РК202 AdnaKJ, содержащих люциферазу Ph. luminescens ZM1, интенсивность биолюминесценции снижалась на порядок при температуре 44 С за 30 минут, в то время как клетки Е. coli РК202 AdnaKJ с люциферазами морских люминесцентных бактерий V. fischeri и V. harveyi уменьшали свечение в 10 раз при той же температуре за 1 и 7-8 минут соответственно.
Помимо этого новый биосенсор не должен требовать обязательного наличия в системе ионов С1 . Широко используемый в развитых странах люминесцентный бактериальный тест на основе морских бактерий подвергается справедливой критике за то, что находящиеся в среде активные ионы хлора могут существенно искажать истинные результаты токсикологического анализа. Нами получен генно-инженерный биосенсор Эколюм-8 с биолюминесцентным выводом информации, который суммирует свойства хозина Е. coli (и поэтому не требует добавления NaCl) и термостабилен в силу свойств люциферазы Ph. luminescens.
В работе при исследовании действия различных поллютантов на биосенсор Е. coli с клонированными генами luxCDABE из Ph. luminescens ZM1 были вычислены параметры ECso- Оказалось, что эти величины несколько отличаются от подобных параметров для тест-системы Microtox. Так, для металлов Эколюм-8 более чувствителен, тогда как для ряда органических соединений (например, бензола) несколько менее. На наш взгляд это в первую очередь обусловлено различием в температуре, при котором проводился анализ (15С и 37С соответственно). Подтверждением этому служат наши эксперименты по определению индекса токсичности модельных соединений на одном биосенсоре, но при разных температурах. Важно отметить, что, несмотря на эти отличия, коэффициент корреляции двух биотестов весьма велик.
Таким образом, выявлено, что созданная нами аналитическая система Эколюм-8 может быть использована для быстрой оценки токсичности различных химических соединений и обладает большим преимуществом перед другими сенсорами на основе люминесцентных бактерий, позволяя проводить анализ при более высоких температурах. Дальнейшие применение разработанного нами биосенсора мы видим не только в мониторинге окружающей среды, но, может быть, даже в большей степени в медицине при исследовании биологических жидкостей.
