Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Феномен биолюминесценции, его механизм и связь с общим метаболизмом клетки - основа люминесцентных микробиотестов. 15
1.2. Фенетико-популяционный анализ реципиента и возможных доноров /шг-оперона. Свечение в различных условиях обитания . 21
1.3. Возможные пути оптимизации сенсоров на основе люминесцентных бактерий. 29
1.4. Влияние критических условий на свечение люминесцентных бактерий
Глава 2. Материалы и методы 43
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Морфо-физиологическая характеристика популяции генно-инженерного штамма Escherichia coli 1шп+. 50
3.2. Динамика роста и свечения Escherichia coli 1шп+ на различных питательных средах . 60
3.3. Некоторые пути селекции культуры по признаку чувствительности люминесценции к токсикантам и попытка ее последующей стабилизации. 74
3.4. Воспроизведение ряда критических состояний для Escherichia coli lum+ и возможные пути расширения сферы применения реакции ингибирования биолюминесценции .
Заключение 119
Выводы
Список литературы
- Фенетико-популяционный анализ реципиента и возможных доноров /шг-оперона. Свечение в различных условиях обитания
- Влияние критических условий на свечение люминесцентных бактерий
- Динамика роста и свечения Escherichia coli 1шп+ на различных питательных средах
- Воспроизведение ряда критических состояний для Escherichia coli lum+ и возможные пути расширения сферы применения реакции ингибирования биолюминесценции
Введение к работе
Актуальность проблемы. Увеличение антропогенной нагрузки на окружающую среду выдвигает в число первоочередных задач разработку и применение простых, надежных, экспрессных и общедоступных способов контроля за состоянием природы (Леванова и др., 1999). Биотестирование с использованием в качестве микробиодетекторов люминесцентных бактерий позволяет по реакции ингибирования свечения автоматически и реально учитывать эффекты суммирования, взаимоусиления, ослабления действия отдельных токсикантов и их смесей. Сущность данного подхода определяется тем, что независимо от конкретной точки действия ксенобиотиков (метаболические пути, генетический аппарат, мембрана бактериальной клетки) стехиометрическое соответствие числа молей субстратов потребляемых в реакции люминесценции обусловливает изменение,интенсивности свечения клетки пропорционально токсичности образца (Постникова и др., 1992; Хрипач и др., 1998).
Интерпретация уровня люминесценции целых клеток более многогранна по сравнению с люциферазными ферментами клеточных экстрактов (Meighen, 1991). Широко представленные данные о влиянии индивидуальных омических соединений разных классов на люминесценцию бактерий в тесте «Microtox» (Kaizer et al., 1990) с высокой степенью коррелируют с биотестами на основе эукариот (цит. по Хрипач и др., 1998).
В России аналогом таких люминесцентных тест-систем выступает лиофилизированный генно-инженерный биосенсор «Эколюм», разработанный на кафедре микробиологии МГУ им. М.В.Ломоносова под руководством профессора В.С.Данилова. Возможности отечественного препарата и других подобных сенсоров исследованы значительно хуже, отмечается недостаточная чувствительность к малым концентрациям тяжелых металлов (Хрипач и лп 1998) и лютим классам соединений (Постникова и др 1992; Попою Калачева и др 1994) Среди субпопуляций штамма регулярно регистрируют ,так называемые темповые варианты частота возникновения и свойства которых влияют,на общий уровень свечения культур и сенсоров получаемых на их основе ТиГи 2честао питательных сред существенно определяют вышеназванные Гамшспецїїич^е хг^и^ш ^ мо^т c^cTna^Zl ^^(^3!но^^н^Кто^^Г
Это породило ряд вопросов, требующих дополнительного изучения ктамма и препарата, условий воспроизведения теста. Постоянная необходимость исследования воздействия разного рода физических, шмических и биологических агентов на микроорганизмы обусловили топытки использования реакции ингибирования биолюминесценции для зешения нового круга вопросов.
Цель работы. На основе углубленного фенетико-популяционного анализа оптимизировать условия культивирования и стабилизации генно-инженерного штамма Escherichia coli lum* для получения сенсора с улучшенными характеристиками и расширенной сферой его использования.
Основные задачи исследования
-
Морфо-физиологическая характеристика популяции генно-инженерного штамма Е. coli lum+ на примере его световых и темповых вариантов, изучение их биохимической активности и антибиотикорезистентности.
-
Сравнительная характеристика и подбор питательных сред, условий, оптимальных для развития культур, накопления биомассы и максимального свечения. Проведение направленной клоновой селекции вариантов с высоким и стабильным уровнем люминесценции,
3. Исследование факторов, способствующих повышению
чувствительности люминесценции Е. coli lum+ к токсикантам. Определение
температурного оптимума воспроизведения микробиолюмипесцентного
теста.
4. Расширение сферы применения реакции ингибирования свечения для
оценки критических ситуаций при температурном и алкогольном шоке, а
также для испытания антимикробных препаратов, в том числе антибиотиков,
фаговой инфекции.
Научная новизна работы
Сравнительно исследованы динамика накопления биомассы, уровни общего и удельного свечения и чувствительность люминесценции к стандартным токсикантам Е. coli lum* в условиях различных питательных сред и режимов выращивания. Показано, что клоновая селекция колоний на однотипной среде способствует получению культур с более стабильной общей и удельной люминесценцией. Определены факторы, влияющие на чувствительность Е. coli lum в соответствии со степенью ингибирования свечения.
Лиофилизация препарата проведена с использованием оригинального стабилизатора и режима сушки «Колибактерина». Разработаны подходы определения рабочей концеетрации готового препарата, учитывающие уровень свечения и дозозависимость степени ингибирования биолюминесценции токсикантами в диапазоне средних значений шкалы «Биотокса-6». Основные положения включены в заявку на патент «СпосоЕ изготовления Микробиолюмипесцентного Индикатора Токсичности (МИТ для определения загрязнения окружающей среды» (Приоритетнш справка № 2000302199 от 21 января 2000 г).
Показано, что биолюминесценция может быть дополнительны!* критерием при оценке критических состояний культуры. Существус адекватное реагирование люминесцентной системы в ответ на физические химические (этанол, антибиотики) и биологические (фаговая инфекция воздействия.
Практическая значимость работы
Предложена схема оптимизации сенсора на основе люминесцентных бактерий и разработана технология получения препарата с лучшими индикационными свойствами.
Составлены технические условия на модифицированный сенсор «Микробиолюминесцентный индикатор токсичности» (ТУ 846-001-04538050-00) и утверждены рекомендации по его применению «Наставления по применению препарата Микробиогаоминесцентного Индикатора Токсичности - МИТ».
Проведенные исследования способствуют расширению сферы использования реакции ингибирования биолюминесценции.
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертационной работы доложены на конференции молодых ученых-экологов Уральского региона «Современные проблемы популяционной, исторической и прикладной экологии», Екатеринбург, 1998; Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды - 98», Москва, 1998; Региональной конференции «Проблемы экологии Уральского региона», Оренбург, 1998; Региональной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии микробиологии и иммунологии», Пермь, 1999.
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Объем и структура диссертации
Фенетико-популяционный анализ реципиента и возможных доноров /шг-оперона. Свечение в различных условиях обитания
Перенос генов свечения, по-видимому, оказывает влияние на морфо-функциональные характеристики популяции штамма-реципиента, а также и на особенности экспрессии /ш;-оперона .
В последние годы показано, что при естественном развитии популяции бактерий наблюдается гетероморфный рост. Причем имеются общие закономерности в разнообразии морфологических проявлений у различных микроорганизмов (Павлова и др., 1990).
Так, в популяции светящихся бактерий возникают «спонтанные» тусклые и темновые (К) варианты, частота которых увеличивается в стационарной фазе роста, в анаэробных условиях (Nealson et al., 1970), при высоких температурах (Nealson, 1977). Они стабильно наследуют эти признаки на твердой средіе (Гительзон и др., 1984). Причем К-варианты не полностью утрачивают способность излучать свет, т.к. обнаруживается слабая эмиссия и низкая активность самой люциферазы (Meighen et al., 1971).
К-варианты морских бактерий генетически стабильны и имеют несколько других диагностических признаков: они отличаются от дикого типа морфологией колоний, типом жгутикования, различной фаговой чувствительностью. Колонии дикого типа выпуклые, «жирные» и полупрозрачные, тогда как колонии К-вариантов плоские и более прозрачные (Nealson, 1978; Makiguchi et al., 1979).
До сих пор нет ясного понимания причин возникновения столь распространенного среди светящихся бактерий явления колебания свечения. Возможно, эти свойства определяются мигрирующими векторными генетическими молекулами, а также влиянием ингибиторных или токсических факторов (Nealson, 1977), в том числе аутометаболитов.
Не исключен процесс спонтанного мутирования регуляторных или структурных генов оперона свечения (Стейниер и др., 1979).
Отмечается, что процесс возникновения темновых вариантов, плейотропно изменяющий метаболизм клетки, происходит с большей частотой, чем только «спонтанные» мутации. Вероятно, происходит изменение каких-то ключевых регуляторов метаболизма клетки, переключающих ее с одной программы экспрессии генов на другую. Может нарушаться регуляция синтеза компонентов люминесцентной системы. Возможные регуляторы - это сигма-факторы РНК-полимеразы (Шендеров, Виделец и др., 1989).
Исходя из гипотезы, что люцифераза представляет собой мультиферментный комплекс: флавопротеид, люмиредоксин, цитохром Р-450, снижение интенсивности свечения «тусклых» клеток может быть обусловлено и дефицитом субстратов свечения (FMN-H2, RCHO), и связано с изменениями в составе или активности люминесцентной цепи (Баранова и др., 1980). j Анализ активностей существенных ферментов, в том числе системы образования альдегидов, говорит со всей очевидностью в пользу того, что люминесцентная система «тусклого» штамма содержит все необходимые компоненты и в «безызлучательном» варианте работает не менее эффективно (Баранова и др., 1980; Егорова и др., 1998).
Низкая интенсивность свечения штамма объясняется дефектом в эмиттере свечения - флавопротеиде (низкая константа связывания FMN-H2) (Баранова и др., 1980). У светящегося штамма люминесценция возможна лишь при окислении свободного флавина, т.к. связанный флавин не флуоресцирует (Baldwin et al., 1975). Лабильность флавопротеида и апофермента Р-450, вероятно, определяет появление спонтанных темновых мутантов люминесцентных бактерий (Данилов и др., 1990).
Пониженный уровень свечения может быть связан с недостаточной концентрацией внутриклеточного индуктора для /их-оперона (Максимова и др., 1998).
У темновых вариантов P. phosphoreum наблюдается «разобщение» цепи переноса электронов между люциферазой и восстанавливающей системой (отмечен Na-K контроль по конкурирующим цепям) (Егорова и др., 1998).
Потеря способности излучать свет происходит у темновых мутантов параллельно с уменьшением активности обменных процессов (Медведева, Медведев и др., 1982) и изменениями в липидном и углеводном обмене (Шендеров, Виделец и др., 1989).
У темновых вариантов светящихся бактерий отмечено свойство спонтанного появления клеток с исходным фенотипом (Гительзон и др., 1984).
Обнаружена зависимость направления процесса микроэволюции популяций бактерий по интенсивности свечения от характера синтеза люциферазы у разных штаммов. При культивировании штамма с конститутивным синтезом фермента потеря люминесценции происходит медленно, причем наблюдается диссоциация штамма на яркую и тусклую линии. При культивировании 1 штамма, синтез люциферазы у которого регулируется механизмом аутоиндукции, наблюдается быстрое ослабление свечения (Высоцкий и др., 1982). Что касается реципиента lux генов, Е. coli, то установлено, что структура бактериальных суспензий существенно зависит от концентрации бактериальных клеток. Степень их агрегации определяется физиологическим состоянием (Какорин и др., 1991).
При сравнении морфологических особенностей роста разных видов светящихся бактерий на твердой питательной среде не найдено существенных различий. В полужидкой - штаммы рода Vibrio характеризовались гомогенным обширным ростом без четко выраженной границы, штаммы рода Photobacterium - компактным ростом в виде микроколоний (Медведева и др., 1993).
Изучение ультраструктуры светящихся бактерий показало, что клеточная стенка К-вариантов по строению не отличается от стенки светящихся бактерий (Гительзон и др., 1984). Отмечается, что величина электронно-прозрачной периплазматической зоны меняется в процессе развития клеток, причем в период очень слабого свечения она наименьшая, как и у несветящихся клеток (Сальников и др., 1984). В связи с этим было высказано предположение о локализации люциферазы в периплазматическом пространстве, что находит подтверждение в современных экспериментальных работах (Кудрявцева и др., 1993). У части клеток в старых культурах светящихся бактерий также можно обнаружить увеличение периплазматического пространства, что в этом случае скорее вызвано их аутолизом (Гительзон и др., 1984).
Влияние критических условий на свечение люминесцентных бактерий
Если исходить из того, что возникновение К-вариантов связано с нарушениями метаболизма клетки, то культуры с высоким и стабильным свечением, вероятно, можно получать и поддерживать путем постоянного пассирования на однотипной среде. И действительно, наименьший процент на среде Эндо, возможно, объясняется ее предварительным использованием для пассирования микроорганизмов, в ходе которого произошли адаптивные перестройки.
В случае пересева микроорганизмов на иную среду соответственно возрастала частота темновых колоний. Возможно, происходит изменение метаболизма, его ключевых регуляторов, переключающих обмен веществ клетки с одной программы экспрессии генов на другую. Может нарушаться регуляция синтеза компонентов люминесцентной системы (Шендеров, В и делец и др., 1989), инактивация фермента люциферазы, его каталитического центра, неправильная ассоциация субъединиц. Исследование тусклых вариантов светящихся бактерий свидетельствует, что их слабое свечение обусловлено либо низким содержанием люциферазы и всех или нескольких субстратов люциферазной системы, либо дефектом в эмиттере свечения - флавопротеиде (с большей константой связывания OMN-H2). У светящегося штамма люминесценция возможна лишь при окислении свободного флавина, т.к. связанный DMN-H2 не флуоресцирует (Гительзон и др., 1984). Все это, может быть причиной возникновения темновых вариантов в культуре Е. coli lum+. В опытах отмечено, что плотность колоний на среде может определять частоту темновых вариантов (соответственно и удельное свечение культуры). На всех исследованных средах (Эндо, РПА, МПА) с увеличением разреженности колоний на чашках уменьшался процент КОЕ, потерявших способность к свечению.
Хотя авторами отмечается, что в случае рекомбинантных штаммов через 10 генераций в непрерывной культуре устанавливается примерно равное соотношение темновых и светящихся вариантов, с последующим его колебанием (50-80% светящихся клеток) при неизменной плотности культуры (Попова, Луцкая и др., 1992), но в условиях периодического культивирования, возможно, предположить влияние ингибирующих, токсических веществ или продуктов метаболизма, особенно при повышенной плотности (Гительзон и др., 1984).
Также, вероятно, происходит исчерпание кислорода, что оказывает влияние на свечение бактерий. Во-первых, E.coli 1шп+, проявляя видовые признаки (факультативный анаэроб), нуждается в его присутствии. Во-вторых, известно, что около 20% потребляемого кислорода расходуется люминесцентной системой светящихся бактерий при росте на богатой среде (Гительзон и др., 1984). Люцифераза имеет высокое сродство к кислороду, который может лимитировать аэробный рост люминесцентных бактерий при концентрациях вполне достаточных для высокой активности люциферазы (Данилов и др., 1984).
Чтобы исследовать возможность влияния вышеуказанных факторов на свечение, и в некоторой степени исключить их неблагоприятное действие, мы помещали культуру в жидкую среду в условия интенсивного перемешивания при соотношении жидкой и воздушной фаз 1:5.
В ходе экспериментов было показано, что культура при интенсивном массообмене развивалась быстрее, достигала больших значений биомассы
Динамика накопления биомассы E.coli lum+ на среде МПБ при различных скоростях перемешивания: 1-0 оборотов/мин; 2 - 120 оборотов/мин. 20 30 40 В озраст культуры, ч Рис. 13. Влияние массообменных характеристик на динамику свечения культуры E.coli 1шп+ при росте на МПБ: скорость перемешивания 1-0 оборотов/мин, 2 - 120 оборотов/мин. по сравнению с культурой в микроаэрофильных условиях (рис. 12). Это согласуется с данными Марквичева и др. (1991), что при уменьшении концентрации растворенного кислорода в среде снижается максимальное накопление биомассы генно-инженерного штамма E.coli (lum).
Условия перемешивания, с одной стороны, позволяют обеспечить клетки кислородом за счет лучшего его перехода в растворенное состояние и доступа к бактериям, учитывая, что в прибактериальном слое его концентрация меньше средней в суспензии. Возможно, происходит предохранение клеток от избытка продуктов метаболизма, которые могут ингибировать потребление кислорода (участника люциферазной реакции), снижая уровень люминесценции культур (Гительзон и др., 1984).
В отношении свечения следует отметить, что нарастание биолюминесценции в обоих случаях происходило при достижении культурой одних и тех же значений количества биомассы. Это связывают с синтезом какого-то минимального количества субстрата, зависящего от плотности растущей культуры клеток (Чиркова и др., 1991), или наличием видоспецифичного индуктора люциферазной реакции (Meighen, 1999).
Из рис.13 видно, что в условиях интенсивного перемешивания, культура характеризовалась более высоким уровнем люминесценции, чем в микроаэрофильных условиях. Предполагается, что при низкой концентрации кислорода происходит инактивация люциферазы за счет адсорбции молекул субстрата на специфических участках поверхности фермента, и при недостатке кислорода в среде эти изменения являются необратимыми (Hastings, 1952).
Таким образом, применение разреженных и более молодых культур и колоний является целесообразным для получения большего числа световых вариантов с продолжительным и устойчивым свечением.
Следует отметить, что в культуре темновых вариантов светящихся бактерий спонтанно появляются колонии, способные светиться (Гительзон и др., 1984), что было отмечено и у генно-инженерного штамма. На рис. 14 показано, что наибольшая частота колоний с исходным фенотипом характерна для бактерий на среде Эндо, меньшая на РПА, минимальная на МПА, что свидетельствует о более благоприятных условиях для микроорганизмов, которые пассируются на однотипных средах (адаптации и формирование оптимального фенотипа для среды).
Механизмы активации и ингибирования люминесцентной ісистемьі обсуждаются в литературе. Высказана гипотеза о гене, кодирующем репрессию синтеза люциферазы. Возможно, определенные ингибиторы инактивируют некоторые репрессоры люминесцентной системы, увеличивая свечение клеток (Гительзон и др., 1984).
Динамика роста и свечения Escherichia coli 1шп+ на различных питательных средах
Исследования влияния этанола на реакцию биолюминесценции культуры Е. coli lum+ показали, что уже при добавлении его в малых концентрациях (6%) наблюдалась задержка развития культуры. Но после часового контакта с данным агентом в диапазоне концентраций 6-10% с последующим его отмыванием не происходило значительной гибели клеток (количество КОЕ/мл сохранялось в пределах 10 ). Бактериостатическое действие спирта, вероятно, связано с ингибированием системы транспорта различных питательных веществ, изменением проницаемости цитоплазматической мембраны (Jones, 1989), воздействием на разные стороны белкового синтеза (So et al., 1964; Halegona et al., 1979).
Результаты проведенных исследований позволили выявить, что у генно-инженерного штамма падение общего свечения происходило в соответствии с концентрацией этанола (рис. 24), т.е. имело градиентную природу развития подобно ТШ. Но после алкогольного шока (АШ) происходило возрастание люминесценции до или выше уровня контрольного.
Известно, что выращивание клеток в присутствии этанола приводит к образованию мембранных липидов, содержащих повышенное содержание ненасыщенных углеводородных цепей (Berger et al., 1980). Промежуточными продуктами их пероксидации выступают алифатические альдегиды с длиной цепи 6-12 атомов углерода (Владимиров и др., 1972; Esterbauer, 1982), которые могут выступать субстратами люциферазной реакции (Данилов и др., 1990). Согласно Исмаилову и др. (1994), этим может вызываться индукция люминесценции, что, вероятно, и обусловило стимуляцию свечения в опытных пробах после АШ в наших экспериментах.
Результаты экспериментов показали неодинаковую чувствительность культуры к спирту на разных этапах развития. Так, действие 6% этанола на культуру Е. coli lum+ в стадии логарифмического роста снижало свечение медленнее и в меньшей степени, чем у той же культуры в стационарной фазе роста. Выявлены отличия в свечении бактерий, подвергнутых действию 6 и 8% этонола спустя 7-8 ч после первичного АШ. Это проявлялось в более раннем, глубоком гашении свечения. В общем, для вышеуказанных случаев характерен отрицательный синергический эффект этанола на культуру, которая уже находится в сравнительно неблагоприятных условиях.
Проведенные опыты по воспроизведению этанолового шока у Е. coli 1шп+ убеждают в том, что, как и в случае ТШ, реакция ингибирования биолюминесценции может быть использована как дополнительный, объективный, прижизненный экспресс-тест для изучения этанолового шока у светящихся бактерий. Наблюдения еще раз подтвердили, что АШ имеет не пороговый, а градиентный характер. Быстрота и степень ингибирования биолюминесценции находятся в соответствии с испытанными концентрациями этанола. Более раннее и глубокое гашение биолюминесценции при повторном АШ, вероятно, свидетельствуют об отсутствии выраженных адаптивных реакций на это воздействие. Можно предположить, что на первом этапе при воздействии малых концентраций, этанол оказывает на клетки бактериостатическое действие, которое переходит в цидное при увеличении концентраций и срока контакта клеток со спиртом.
Помимо вышеуказанных экспериментов нами были проведены исследования иного рода. Современное развитие, медицины характеризуется широким использованием антибиотиков для лечения и профилактики инфекционных заболеваний. Учитывая возможность привыкания микроорганизмов к их действию, существует постоянная необходимость выявления, синтеза, испытания и отбора новых, более эффективных препаратов, обладающих антимикробным действием. Общепринятый метод их оценки регламентируется Государственной Фармакопеей и приказом Минздрава СССР №250 (13.03.75) и предусматривает визуальные наблюдения с использованием тестовых организмов (в их числе Е. coli) при внесении градиента испытуемых антибиотиков в МПБ с последующей (в течение 2-х суток) дифференциацией их бактерицидного и бактериостатического действия.
Исходя из общей способности токсикантов, подавлять люминесценцию бактерий, что регистрируется приборно, нами исследована возможность применения реакции ингибирования биолюминесценции для выявления и оценки степени антибактериального, а именно цидного и статического действий антибиотиков на типичного представителя грамотрицательных бактерий - Е. coli. Тем более, что использование в качестве показателя свечение, которое отражает протекание биохимических процессов внутри живых бактериальных клеток, в частности, синтеза биолюминесцентных белков, является новым подходом к изучению клеточного метаболизма (Дементьева и др., 1996).
Исходя из данных о приоритетном бактерицидном, бактериостатическом действии антибиотиков или об отсутствии их влияния на микроорганизмы, из указанных трех групп ; были выбраны по одному представителю антибактериальных агентов.
Исследования динамики роста Е. coli 1шп+ при действии канамицина показали соответствие между его концентрацией и замедлением роста, гибелью клеток (рис. 25, а; табл. 6). В пробах с 10, 1000 мг/л антибиотика зарегистрировано бактерицидное действие.
Все это сопровождалось соответствующим ингибированием люминесценции Е. coli lum+. Так, из рис. 25 (б) видно, что при действии 0,1 мг/л канамицина, удельное свечение падало незначительно. Более высокие концентрации 10 и 1000 мг/л вызывали заметное гашение биолюминесценции через 5 ч без последующего восстановления.
Ингибирующее действие канамицина как бактерицидного агента на свечение, вероятно, связано с подавлением синтеза нуклеиновых кислот (Егоров, 1986), а также его воздействием на синтез системы люциферазного комплекса (люциферазы и ее субстратов), т.к. известно, что он влияет и на синтез белка. Канамицин связывается с 70S рибосомами и приводит к ошибкам при считывании мРНК (Маниатис и др., 1984). Указываются 3 концентрационно зависимых воздействия антибиотика на рибисомы микробной клетки, которые укладываются в диапазон выбранных нами концентраций в эксперименте: 1. 2 мг/л вызывает сильное ингибирование синтеза белка без значительного увеличения ошибочного считывания РНК, 2. 5-50 мг/л -накопление аномально длинных полипептидов из-за ошибочного считывания,
Воспроизведение ряда критических состояний для Escherichia coli lum+ и возможные пути расширения сферы применения реакции ингибирования биолюминесценции
Вторая фаза характеризовалась ингибированием удельного свечения Е. coli lum+ через 2,5 ч совместного культивирования с фагом (рис. 31). В данный период число бактериофагов в фильтрате увеличивалось на порядок через каждые 30-40 мин. Число БОЕ через 2,5 ч превышало 10 (рис. 32). По всей видимости, гашение свечения объясняется инфицированием почти всех клеток в культуре, т.к. это коррелировало с падением оптической плотности, что косвенно свидетельствует о преобладающем прохождении процессов лизиса в опытной культуре за счет размягчения их клеточной стенки под действием фагового лизоцима (Шлегель, 1987).
Таким образом, в ходе экспериментов показано ингибированйе развития Е. coli lum+ фаговой инфекцией, что свидетельствует о сохранении видовых специфических фаговых рецепторов клеточной мембраны, свойственных Е. coli. Некоторая вариабельность свечения в начале опыта, в конечном счете, отражала поражение клеток в ходе фаговой инфекции (через 2,5 ч).
Данные результаты о влиянии фагов на биолюминесценцию могут быть использованы в стандартных методиках титрования фага. Генно-инженерный штамм входит в группу E.coli - тестовых организмов. Проведение титрования по методу Апельмана показало, что люминесценция четко регистрировала ингибирующее действие фага. При массовой фаговой инфекции с лизисом подавляющего числа клеток культуры Е. coli lum+ свечение падало на 44-99%. В остальных случаях ингибированйе свечения не превышало 26%. Следует отметить, что подобные оценки исключают неправильное толкование результатов в случае загрязнения проб.
Помимо вышеуказанных случаев, возможно, использование теста люминесценции и для исследования антибактериальных свойств биологических жидкостей (желчи). Последняя выполняет барьерные функции при воспалительных заболеваниях желчевыводящих путей (Лохвицкий и др., 1989).
Снижение местной противоинфекционной защиты может повлечь за собой развитие в желчи грамотрицательной микрофлоры, в том числе представителей сем: Enterobacteriaceae, что утяжеляет течение воспалительного процесса.
Исходя из многочисленных данных, о том, что биолюминесценция может отражать разного рода неблагоприятные воздействия на клетку, было сделано предположение об использовании реакции гашения свечения для оценки бактерицидных свойств желчи. Необходимость подобных исследований вытекает и. из того, что осуществление бактериологического контроля за динамикой течения воспалительного процесса в желчевыводящих путях достаточно сложно (Зубарева, 1999). Это обусловило поиск методов, позволяющих проводить экспересс-диагностику. Тем более, что используемый нами генно-инженерный штамм является типичным представителем рода Escherichia.
В ходе исследований различные образцы желчи были разделены на две группы в зависимости от характера изменения биолюминесценции. На рис. 33, 34 показано, что часть образцов стимулировала свечение, другая часть - ингибировала. Это коррелировало с относительно высоким (более 78,9 мкмоль/мл мин) и низким (менее 56,8 мкмоль/мл мин) содержанием в них каталазы, соответственно. ...... Определение активности каталазы в желчи является признаком, который диагностирует и прогнозирует гнойные холангиты. Ее содержание более 3,5 мкмоль/мл мин отмечают при воспалении билиарной системы (Зубарева др., 1998).
Удалось в некоторой мере дифференцировать бактерицидные свойства желчи при обостренных и хронических холециститах, холангитах. В частности, в первом случае наблюдалось явное отсутствие подавления метаболизма и свечения бактерий Е. coli lum .
Возможно, это связано с содержанием в желчи антибактериальных факторов. Известно, что наиболее информативным тестом, отражающим состояние местной противоинфекционной защиты клетки, является лизоцим. Его содержание в ткани печени связывают с клетками Купфера, или звездчатыми ретикулоэндотелиоцитами, которые, наряду с выполнением органоспецифических функций (участие в обмене билирубина, липидов, гемоглобина, желчных пигментов), активизируясь бактерийными эндотоксинами и сложными липополисихаридами, обусловливают противоинфекционную тканевую резистентность - защиту органа путем усиления продукции и выделения во внеклеточную среду факторов противоинфекционной защиты: лизоцима, интерферона и других (Маянский, 1981). Лизоцим - низкомолекулярный белок (14000), обладает гидролитической активностью к гликолипидам стенки бактерий, вызывая лизис, бактериостаз, пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, антителообразование (Лохвицкий и др., 1989).
Есть данные, что при гнойном холангите наблюдается стойкое и длительное угнетение лизоцимообразовательной функции печени (Лохвицкий и др., 1989). Это может объяснить отсутствие ингибирующего эффекта желчи при обостренном холецистите (рис. 34) на биолюминесценцию Е. coli 1шп+, что, вероятно, распространяется и на поступающие из ЖКТ энтеробактерии.
Вышеизложенные результаты согласуются с данными авторов, что низкая концентрация лизоцима на фоне высокой активности каталазы является признаком неблагоприятного течения заболевания с возможной генерализацией инфекции и развитием билиарного сепсиса. Одновременно в желчи находили Е. coli в ассоциации с другими микроорганизмами (Зубарева, 1999).
В случае хронического, а не обостренного холецистита (рис. 33), судя по ингибированию реакции свечения, желчь все же обладает бактерицидными свойствами, но по содержанию каталазы все еще регистрируется воспалительный процесс в билиарной системе.