Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Краткая характеристика бактерий рода Azospirillum 13
1.2 Биологическое разрушение лигнина 17
1.3 Биологическое разрушение азокрасителей 21
1.4 Характеристика фенолокисляющих ферментов 26
1.4.1 Фенолокисляющие ферменты грибов 26
1.4.2 Фенолокисляющие ферменты бактерий 29
1.4.2.1 Фенолоксидазная активность азоспирилл 30
1.4.3 Основные свойства фермента лигнин-пероксидазы 32
1.4.3.1 Способы выделения и очистки лигнин-пероксидазы 35
1.4.3.2 Модельные cубстраты лигнин-пероксидазы 35
Глава 2. Объекты, материалы и методы исследования 38
2.1 Микроорганизмы и условия их культивирования 38
2.2 Обнаружение лигнин-деградирующей способности азоспирилл и исследование участия лигнин-пероксидазы в разрушении модельных препаратов лигнина 39
2.3 Обнаружение способности азоспирилл к деградации азокрасителя и исследование участия лигнин-пероксидазы в обесцвечивании метилового оранжевого 41
2.4 Определение лигнин-пероксидазной активности 42
2.5 Влияние условий культивирования на лигнин-пероксидазную активность A. brasilense Sp245 43
2.6 Выделение, очистка и описание препарата лигнин-пероксидазы A. brasilense Sp245 43
2.7 Определение концентрации белка 45
2.8 Статистическая обработка результатов 46
Глава 3. Результаты и их обсуждение 47
3.1 Обнаружение лигнинолитической активности бактерий рода Azospirillum 47
3.2 Выявление способности бактерий рода Azospirillum к разрушению азокрасителя 53
3.3 Открытие внеклеточной лигнин-пероксидазной активности штаммов бактерий рода Azospirillum 68
3.4 Влияние условий культивирования на лигнин-пероксидазную активность A. brasilense Sp245 73
3.4.1 Изучение влияния внесения фенольных соединений и медиатора в среду культивирования на лигнин-пероксидазную активность A. brasilense Sp245 84
3.5 Выделение и очистка лигнин-пероксидазы A. brasilense Sp245 96
3.5.1 Краткая характеристика лигнин-пероксидазы, полученной из A. brasilense Sp245 102
3.6 Обнаружение способности лигнин-пероксидазы A. brasilense Sp245 к деградации модельных соединений лигнина 107
3.7 Открытие способности лигнин-пероксидазы A. brasilense Sp245 к деградации азокрасителя 110
4. Заключение 119
4.1 Результаты и их обсуждение 119
4.2 Выводы 127
Список сокращений и условных обозначений 129
Список литературы 130
- Биологическое разрушение лигнина
- Обнаружение лигнинолитической активности бактерий рода Azospirillum
- Изучение влияния внесения фенольных соединений и медиатора в среду культивирования на лигнин-пероксидазную активность A. brasilense Sp245
- Открытие способности лигнин-пероксидазы A. brasilense Sp245 к деградации азокрасителя
Биологическое разрушение лигнина
Метаболическая активность многочисленных микроорганизмов играет значительную роль в глобальном превращении органического углерода в углекислый газ. Самым распространенным источником углерода является растительная биомасса, состоящая в основном из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина (Cullen D., Kersten P., 2004).
Лигнин представляет собой сложный гетерогенный полимер (рис. 1), занимающий долю в 10-35 % от лигноцеллюлозы. Он является неотъемлемой частью клеточной стенки растений, придает ей жесткость, формируя в ней матрицу, защищая куда более легко разлагаемую целлюлозу от атак патогенов (Donna C.R. et al., 2000; Prasongsuk S. et al., 2009; Bugg T.D.H. et al., 2011a; de Gonzalo G. et al., 2016).
Исследователями отмечается, что потенциал применения лигнин-деградирующих организмов для разрушения лигнина весьма высок, так как они предоставляют возможность внедрения экологически чистых технологий во многих отраслях промышленности, в том числе и целлюлозно-бумажной (Cullen D., Kersten P., 2004).
Биологическое разрушение лигнина микроорганизмами является общеизвестным фактом (Crawford D.L., Crawford R.L., 1980; Zimmermann W., 1990). Необходимо отметить, что на протяжении достаточно длительного отрезка времени способность к биодеструкции лигнина и его производных активно изучалась только у грибов (Tien M., Kirk T.K., 1984; Gold M.H. et al., 1984).
Однако, применение грибов в промышленном разрушении лигнина представляется достаточно сложным и низкоэффективным (Crawford D.L., Muralidhara R., 1993). Это связано с особыми условиями влажности, аэрации, температуры и показателя pH, необходимыми для культивирования грибов и тяжело совместимыми с промышленным применением, а также из-за длительной лаг-фазы грибов и, как следствие, медленно разрушаемого лигнина, при этом на практике отмечается низкая стабильность грибов в сложных условиях окружающей среды и при избытке лигнина (Crawford D.L., Muralidhara R., 1993).
С другой стороны, в настоящее время отмечается активное накопление данных о бактериях, обладающих лигнинолитической активностью. Бактерии являются высокоперспективным объектом изучения на предмет лигнинолитического потенциала в связи с их огромной экологической адаптивностью и биохимической универсальностью. Это позволяет говорить об огромном значении идентификации бактерий, имеющих лигнин-разрушающие ферменты (Li J. et al., 2009; Bugg T.D.H. et al., 2011b).
На сегодняшний день лигнин-деградирующая способность обнаружена у многих видов актиномицетов (Watanabe Y. et al., 2003; Ahmad M. et al., 2010).
Относительно недавно у бактерий Rhodococcus jostii RHA1, Nocardia и Pseudomonas putida mt-2 обнаружена способность к деградации модельных соединений лигнина (Zimmermann W., 1990; Ahmad M. et al., 2011). Также у бактерий родов Bacillus, Sphingomonas, Burkholderia, Rhodococcus, Pseudomonas, Comamonas, Ralstonia, Acinetobacter и Achromobacter было открыто разрушение бифенила, представляющего собой типичный ароматический углеводород (Pieper D.H., 2005). Механизм бактериального разложения лигнина, однако, в сравнении с подобным механизмом у грибов, изучен недостаточно хорошо.
Согласно данным, представленным в литературе, обобщенная текущая модель деградации лигнина представляет собой сильную экзотермическую реакцию окисления лигнина, опосредованную широким спектром молекулярных окислителей, создаваемых ферментами лигнин-деградирующего комплекса грибов, например, такими как катион-радикал ветратрилового спирта (Khindaria A. et al., 1995) и различные координационные комплексы Mn (III) (Glenn K.K., Gold M.H., 1985; Kuan I.C. et al., 1993) или теми, которые получены во вторичных радикальных каскадах (Ten Have R., Teunissen P.J., 2001, Hofrichter M., 2002) (рис. 2 а). Рисунок 2 – Разрушение модельного соединения лигнина (вератрилового спирта) лигнин-пероксидазой (Ten Have R., Teunissen P.J., 2001; Brown E.M., Chang C.Y.M., 2014)
Примечания: (a) – Различные низкомолекулярные окислители, образующиеся непосредственно при участии лигнин-пероксидазы, Mn-пероксидазы и лакказы, а также вторичные окислители, полученные радикальными каскадами. Окисляющие вещества представлены красным цветом. (b) – Текущая модель деградации лигнина включает в себя ферментативную генерацию радикального медиатора, который затем может диффундировать в субстрат (лигнин) и переносить окислительный эквивалент на полимер. После образования лигнинсодержащего радикала возникают реакции разрыва связи, которые приводят к деполимеризации вещества. (c) – Предлагаемые реакции модельных димеров, приводящих к образованию наблюдаемых продуктов под воздействием ферментов грибного лигнинолитического комплекса (Brown E.M., Chang C.Y.M., 2014). Generation of oxidant – генерация окислителя (радикального медиатора), diffusion – диффузия, lignin oxidation – оксисление лигнина, bond scission – разрушение связей, LiP – лигнин-пероксидаза, VA – вератриловый спирт
Считается, что именно эти диффундирующие медиаторы, а не сами ферменты, непосредственно взаимодействуют с лигнином для образования радикальных сайтов в субстрате и инициируют каскад реакций разрыва связи, что в конечном итоге приводит к разложению субстрата до более простых ароматических соединений, углекислого газа и воды (рис. 2 b, с) (Brown E.M., Chang C.Y.M., 2014).
Относительно недавно были обнаружены изоляты SHC1 (Bacillus sp.), SHC2 (Ochrobacterum sp.) и SHC3 (Leucobacter sp.), у которых была отмечена лигнинолитическая активность и способность к продукции лигнин-пероксидазы, Mn-пероксидазы и лакказы (Rahman N.H.A. et al., 2013). Однако наличие лигнин-пероксидазы, сходной по своим характеристикам с грибной было подтверждено только для Streptomyces viridosporus T7A (Ramachandra M. et al., 1988) и Pseudomonas sp. SUK1 (Kalyani D.C. et al., 2008a).
Обнаружение лигнинолитической активности бактерий рода Azospirillum
Энзимология бактериальной деполимеризации лигнина на данный момент представляет собой недостаточно изученный процесс. Так, например, относительно недавно рядом авторов была выдвинута гипотеза, в которой говорится о том, что способность разлагать широкий спектр полифенольных соединений, включающий лигнин и лигниноподобные соединения, обусловливается наличием у некоторых представителей почвенных бактерий потенциала к окислению соединений, содержащих ароматические группы (Bugg T.D.H. et al., 2011 a, b; Bholay A.D. et al., 2012).
Ранее нами была показана способность штаммов A. brasilense Sp245 и A. brasilense Sp7 расти на плотных питательных средах, содержащих лигнин Классона (Петров С.В. и др., 2014). Однако, исходя из методики проведения эксперимента, связанной с культивированием бактерий на плотной среде, было невозможно установить степень разрушения препаратов лигнина исследуемыми микроорганизмами.
Для качественного и количественного выявления способности азоспирилл к деградации лигнина нами был проведен скрининг по способности к разрушению препаратов лигнина культуральной жидкостью штаммов бактерий рода Azospirillum: эпифитных A. brasilense Sp7, A. brasilense SR80, A. picis TAR-3, A. lipoferum Sp59b, A. tiophilum Bv-S (Tarrand J.J. et al., 1978; Позднякова Л.И. и др. 1988; Lin S.-Y. et al., 2009; Lavrinenko K. et al., 2010) и эндофитных A. brasilense Sp107, A. brasilense Sp245 (De-Polli H. et al., 1980; Baldani V.L.D. et al., 1983). Разрушение модельных препаратов фиксировалось по изменению оптической плотности смеси с течением времени (Петров С.В., Купряшина М.А., 2015). Исходя из данных, полученных Ahmad (Ahmad M. et al., 2010), возрастание оптической плотности обусловлено появлением ряда веществ фенольной природы, образующихся при разрушении модельных препаратов лигнина.
В эксперименте (рис. 7) нами использовались модельные препараты лигнина Классона. Один препарат был получен из древесных опилок, обработанных с применением метанолиза, второй – из нативных опилок, которые не подвергались алкоголизу с участием метилового спирта.
Из представленных на рисунке 8 данных видно, что все исследуемые штаммы оказались способны разрушать как лигнин Классона, так и лигнин Классона с повышенным содержанием метоксильных групп. Метанолиз древесных опилок приводил к изменениям в молекуле лигнина, которые выражались в повышенном содержании метоксильных групп, а также моно-, ди- и олигомерных фенольных производных, что, в результате, сказывается на степени ее конденсированности. А, как известно из литературных источников (Ильина Г.В., 2011), измененные подобным образом субстраты разрушаются грибами в значительно большей степени, нежели субстраты, молекулы лигнина которых находятся в нативной форме.
Было определено, что большинство взятых в эксперимент штаммов эффективней разрушали метанолизный препарат лигнина. Самую высокую степень разрушения данного препарата продемонстрировал штамм A. lipoferum Sp59b с показателем изменения оптической плотности, равным 0,53 mAU (рис. 8). Второй по величине результат был отмечен у штамма A. brasilense SR80, составивший 94,34 % от максимального. Штамм A. picis TAR-3 разрушал метанолизный препарат лигнина с эффективностью, на 7,55 % меньше максимальной. У штамма A. brasilense Sp107 изменение оптической плотности реакционной смеси было на 26,42 % ниже, чем у A. lipoferum Sp59b. Результат в 62,26 % от максимального был отмечен у штамма A. brasilense Sp7. У A. brasilense Sp245 было отмечено изменение оптической плотности реакционной смеси, составившее 0,30 mAU, что было меньше, чем у штамма A. lipoferum Sp59b на 43,4 %. Наименьший результат наблюдался у A. tiophilum Bv-S – зафиксированное изменение оптической плотности реакционной смеси с метанолизным препаратом лигнина для данного штамма составило 0,18 mAU. Данный результат был меньше максимального, отмеченного у A. lipoferum Sp59b, на 66,04 %.
При множественном сравнении показателей степени разрушения препарата, подвергнутого метанолизу, обнаружено достоверное отличие между всеми штаммами (рис. 9).
По ранговому дисперсионному анализу Краскела-Уоллиса H = 46,58 при p 0,05. Во всех описанных выше случаях U-критерий Манна-Уитни = 0 при p 0,05. Необходимо отметить, что для A. brasilense SR80 и A. picis TAR-3 U-критерий Манна-Уитни = 8 при p 0,05.
В случае с разрушением нативного препарата лигнина отмечалась несколько иная картина. Так, наибольший результат изменения оптической плотности реакционной смеси был отмечен у A. brasilense SR80 и составил 0,42 mAU (рис. 8). На втором месте по эффективности находился штамм A. brasilense Sp245, чей результат был меньше максимального на 16,67 %. Третий результат, отмеченный у штамма A. brasilense Sp107 был меньше, чем у A. brasilense SR80 на 19,05 %. Штамм A. lipoferum Sp59b разложил нативный препарат лигнина с эффективностью, на 28,57 % меньше максимальной. Обесцвечивание реакционной смеси на 66,67 и 61,9 % от максимального значения, было отмечено у A. picis TAR-3 и A. brasilense Sp7 соответственно. Наименьший результат, аналогично ситуации с метанолизным препаратом лигнина, был отмечен у штамма A. tiophilum Bv-S – на 64,29 % меньше, чем у A. brasilense SR80.
При множественном сравнении показателей степени разрушения нативного препарата обнаружено достоверное отличие между всеми штаммами (рис. 10). По ранговому дисперсионному анализу Краскела-Уоллиса H = 46,49 при p 0,05. Во всех описанных выше случаях U-критерий Манна-Уитни = 0 при p 0,05. Необходимо отметить, что для A. brasilense Sp245 и A. brasilense Sp107 U-критерий Манна-Уитни = 10 при p = 0,07, что говорит об отсутствии статистически достоверного отличия между ними при парном сравнении.
Большинство почвенных бактерий, обладающих лигнинолитической активностью, способны к эндофитному существованию в тканях растений (Bholay A.D. et al., 2012). Вероятно, данный факт может говорить о повышенном, относительно эпифитных микроорганизмов, потенциале к разрушению лигнина и лигниноподобных соединений у бактерий, способных к эндофитному существованию.
Таким образом, по результатам данного эксперимента, нами впервые как качественно, так и количественно обнаружена способность разлагать препараты лигнина культуральной жидкостью штаммов бактерий рода Azospirillum. Было отмечено, что A. brasilense Sp245 оказался единственным из исследуемых штаммов, у которого способность к разрушению препарата нативного лигнина была достоверно выше, чем способность деградировать препарат, молекулы лигнина которого были подвергнуты алкоголизу с применением метилового спирта. Все остальные исследуемые штаммы в большей степени разрушали препарат, полученный из подвергнутого метанолизу субстрата.
Вероятнее всего, это связано со способностью A. brasilense Sp245 колонизировать корневые волоски и межклетники проводящей системы корня (Schloter M., Hartmann A., 1998), образовывая эндофитный симбиоз с травянистыми растениями, молекула лигнина которых характеризуется низкой степенью метаксилированности (Далимова Г.Н. и Абдуазимов Х.А., 1994). Необходимо отметить, что A. brasilense Sp245 не только способен к колонизации внутренних структур корня, но и является модельным объектом в изучении данных процессов (Schloter M., Hartmann A., 1998).
Способность разлагать различные ароматические соединения, в том числе и лигнин, на основании литературных данных, показывающих взаимосвязь данных фактов (Cullen D., Kersten P.J., 2004) дает нам возможность предположить наличие у бактерий рода Azospirillum способности к разрушению других ароматических соединений.
Изучение влияния внесения фенольных соединений и медиатора в среду культивирования на лигнин-пероксидазную активность A. brasilense Sp245
В эксперименте (рис. 40) использовали ряд фенольных соединений, характерных для ризосферы: пирокатехин и 2,6-диметоксифенол, а также специфические субстраты фенолоксидаз – АБТС и сирингалдазин (Niku-Paavola M. et al., 1990). Ароматические соединения вносили в среду культивирования при засеве культуры. Сирингалдазин, 2,6-диметоксифенол, AБTС и пирокатехин вносили в концентрациях 0,1; 0,5 и 1 мМ (Купряшина М.А., Петров С.В., 2013; Петров С.В., Купряшина М.А., 2014). Выбор концентраций используемых в эксперименте веществ был основан на литературных данных (Hoang H. et al., 2010).
При изучении влияния различных концентраций данных веществ на ферментативную активность штамма Sp245 установлено, что наибольшее снижение лигнин-пероксидазной активности A. brasilense Sp245 в присутствии пирокатехина в среде культивирования наблюдалось через 24 ч при концентрации внесенного вещества 0,1 мМ и составившее 50,26 % относительно контроля (рис. 41). При концентрации пирокатехина 0,5 мМ в аналогичных условиях наблюдалось снижение лигнин-пероксидазной активности штамма Sp245 на 11,29 %. Однако, при внесении пирокатехина в среду культивирования в концентрации 1 мМ было отмечено незначительное увеличение ферментативной активности. Внесение в среду культивирования сирингалдазина в концентрациях 0,1 мМ и 0,5 мМ приводило, в сходных условиях, к снижению лигнин-пероксидазной активности относительно контроля на 34,56 и 24,09 % соответственно. Необходимо отметить, что добавление сирингалдазина в среду культивирования в концентрации 1 мМ через 24 ч культивирования вызывало увеличение лигнин-пероксидазной активности, составившее 9,93 % относительно контрольного образца. Добавление 2,6-диметоксифенола в концентрациях 0,1 и 1 мМ в тех же условиях вызывало уменьшение ферментативной активности на 36,00 и 18,84 % соответственно. В аналогичных условиях концентрация 2,6-диметоксифенола, равная 0,5 мМ, вызывала увеличение лигнин-пероксидазной активности A. brasilense Sp245 на 20,40 %. Добавление в среду культивирования АБТС в концентрациях 0,1 мМ; 0,5 мМ; 1 мМ через 24 ч культивирования вызывало увеличение ферментативной активности штамма Sp245 на 101,5; 98,92 и 51,80 % соответственно.
Через 48 ч культивирования наблюдалась несколько иная картина. Так, в присутствии в среде культивирования пирокатехина в концентрациях 0,1 мМ и 1 мМ отмечалось незначительное снижение ферментативной активности, составившее 9,82 и 2,30 % соответственно. Однако, концентрация пирокатехина 0,5 мМ вызывала повышение лигнин-пероксидазной активности A. brasilense Sp245 на 228,76 % относительно контроля. Наличие в среде культивирования сирингалдазина в концентрациях 0,1 мМ; 0,5 мМ; 1 мМ вызывало снижение ферментативной активности штамма Sp245 на 11,93 %; 24,85 и 24,85 % соответственно. Культивирование в течение 48 ч A. brasilense Sp245 в присутствии 2,6-диметоксифенола в концентрациях 0,1 мМ и 0,5 мМ вызывало снижение лигнин-пероксидазной активности на 25,55 и 17,33 % соответственно. Через 48 ч наличие 2,6-диметоксифенола в среде культивирования в концентрации 1 мМ вызывало рост ферментативной активности на 365,75 %. В тех же условиях присутствие АБТС в среде культивирования в концентрациях 0,1 мМ; 0,5 мМ; 1 мМ вызывало увеличение лигнин-пероксидазной активности A. brasilense Sp245 на 140,31; 215,63 и 312,91 % соответственно.
При множественном сравнении показателей внеклеточной лигнин-пероксидазной активности обнаружено достоверное отличие между показателями при различных концентрациях фенольных соединений в среде культивирования (рис. 42 – 47).
Через 24 ч культивирования при концентрации внесённых веществ, равной 0,1 мМ, по ранговому дисперсионному анализу Краскела-Уоллиса H = 32,06 при p 0,05; при 0,5 мМ H = 32,66 при p 0,05; при 1 мМ H = 31,60 при p 0,05. Во всех, описанных выше случаях, кроме значений, полученных при добавлении пирокатехина в концентрации 1 мМ, при сравнении с контролем U-критерий Манна-Уитни = 0 при p 0,05. В случае с внесением в среду культивирования пирокатехина в концентрации 1 мМ, полученные через 24 ч культивирования значения практически не отличаются от контрольных (U-критерий Манна-Уитни = 10 при p = 0,07).
Через 48 ч культивирования при концентрации внесённых веществ, равной 0,1 мМ, по ранговому дисперсионному анализу Краскела-Уоллиса H = 31,77 при p 0,05; при 0,5 мМ H = 32,41 при p 0,05; при 1 мМ H = 31,60 при p 0,05. Во всех, описанных выше случаях, кроме значений, полученных при добавлении пирокатехина в концентрации 1 мМ, при сравнении с контролем U-критерий Манна-Уитни = 0 при p 0,05. В случае с внесением в среду культивирования пирокатехина в концентрации 1 мМ, полученные через 48 ч культивирования значения практически не отличаются от контрольных (U-критерий Манна-Уитни = 10 при p = 0,07).
Таким образом, по результатам эксперимента нами было установлено, что фенольные соединения способны стимулировать исследуемую ферментативную активность. Лигнин-пероксидазная активность A. brasilense Sp245 в 2 раза превышала контрольные значения в присутствии АБТС при всех исследуемых концентрациях через 24 часа культивирования и в 4 раза при содержании 1 мМ АБТС и 1 мМ 2,6-диметоксифенола и 0,5 мМ пирокатехина в среде через 48 часов. Однако, в ряде случаев нами отмечалось снижение лигнин-пероксидазной активности при внесении в среду культивирования некоторых соединений фенольной природы. Так, через 24 часа культивирования при концентрации 0,1 мМ снижение лигнин пероксидазной активности вызывали пирокатехин, сирингалдазин и 2,6-диметоксифенол, при 0,5 мМ – пирокатехин и сирингалдазин, в концентрации 1 мМ – 2,6-диметоксифенол.
По данным литературы, лигнинолитические ферменты обладают достаточно широкой специфичностью по отношению к низкомолекулярным субстратам (Ахмедова З.Р., 1991). В то же время, учеными отмечается, что типичным специфическим субстратом лигнин-пероксидазы является вератриловый спирт – вторичный метаболит Phanerochaete chrysosporium, образование которого связано с процессом разложения лигнина (Schoemaker H.E., Leisola M.S.A., 1990). Кроме того, он является медиатором лигнин-пероксидазы и выполняет протекторную функцию, защищая фермент от инактивации избытком перекиси водорода, не являясь индуктором синтеза данного фермента (Cancel A.M. et al., 1993). Эксперимент проводили по следующей схеме (рис. 48).
Открытие способности лигнин-пероксидазы A. brasilense Sp245 к деградации азокрасителя
Исходя из представленной в литературе информации о взаимосвязи способностей к деградации фенольных соединений и продукции лигнин-пероксидазы, показанной для некоторых объектов (Cullen D., Kersten P.J., 2004; Buzzini A.P. et al., 2006), нами было сделано предположение о наличии подобной способности и у азоспирилл. В связи с этим, следующим этапом нашей работы стало проведение эксперимента по разрушению азокрасителя метилового оранжевого с помощью препарата внеклеточной лигнин-пероксидазы A. brasilense Sp245 (рис. 64).
Нами оценивалась степень разрушения красителя, выражаемая нами в процентах. Также в ходе эксперимента изучалось влияние на процесс деградации красителя ферментом ряда параметров, включающих в себя концентрацию вносимого вещества и время протекания реакции (табл. 7).
При разрушении препарата красителя в концентрации 0,1 мМ оптическая плотность реакционной смеси через 24 ч после начала реакции снизилась на 11,2 % относительно контроля (рис. 65). За первые 30 мин протекания реакции показатель обесцвечивания красителя достиг значения в 7,6 %. Чрез 1 ч разрушение метилового оранжевого достигло отметки в 8,62 % относительно контроля. Спустя 2 ч протекания реакции краситель был обесцвечен на 9,02 %.
Следующее значительное изменение произошло через 4 часа протекания реакции, когда процент обесцвечивания красителя достиг значения в 11,3 %. Рост данного показателя по сравнению с предыдущим этапом составил 2,28 %. Дальнейшее инкубирование фермента с субстратом не вызывало значительных изменений в степени обесцвечивания азокрасителя.
При множественном сравнении показателей степени обесцвечивания метилового оранжевого обнаружено достоверное отличие между значениями, полученными спустя различное время инкубирования (рис. 66). По ранговому дисперсионному анализу Краскела-Уоллиса H = 47,68 при p 0,05. Во всех случаях, описанных выше и при сравнении с контролем U-критерий Манна-Уитни = 0 при p 0,05.
В эксперименте по деградации красителя в концентрации 0,05 мМ (рис. 67) спустя 24 ч нами отмечалось снижение оптической плотности реакционной смеси, составившее 8,8 % относительно контрольных значений. Данный результат уступал достигнутому в аналогичных условиях показателю обесцвечивания метилового оранжевого на 2,4 %. Необходимо отметить, что в течение первых 30 мин степень разложения красителя достигла отметки в 3,5 %, что на 4,1 % ниже, чем при концентрации метилового оранжевого, равной 0,1 мМ.
Чрез 1 ч разрушение азокрасителя достигло отметки в 4,09 % относительно контроля. Данный результат, аналогично показателю обесцвечивания красящего вещества в концентрации 0,05 мМ через 30 мин, оказался ниже на 4,53 %, чем при концентрации красителя, равной 0,1 мМ.
Спустя 2 ч протекания реакции азокраситель был обесцвечен на 5,49 %, что оказалось на 3,53 % меньше, чем в случае с разрушением метилового оранжевого в концентрации 0,1 мМ за аналогичный период протекания реакции. Также нами отмечался аналогичный предыдущему эксперименту рост степени обесцвечивания красителя, достигший к четвертому часу протекания реакции значения в 8,3 %, что было меньше на 2,96 %, чем через 4 ч протекания реакции при концентрации метилового оранжевого 0,1 мМ. В целом, по результатам данного эксперимента нами отмечалось снижение процента обесцвечивания азокрасителя в концентрации 0,05 мМ по сравнению с тем же показателем, достигнутым при концентрации красящего вещества, равной 0,1 мМ.
При множественном сравнении показателей степени обесцвечивания метилового оранжевого обнаружено достоверное отличие между значениями, полученными спустя различное время инкубирования (рис. 68). По ранговому дисперсионному анализу Краскела-Уоллиса H = 56,5 при p 0,05. Во всех случаях, описанных выше и при сравнении с контролем U-критерий Манна-Уитни = 0 при p 0,05.
При разрушении препарата красителя в концентрации 0,01 мМ нами отмечалось снижение оптической плотности реакционной смеси через 24 ч на 22,5 %, что является наибольшим достигнутым результатом во всех трех экспериментах (рис. 69), превысившим показатели обесцвечивания метилового оранжевого в концентрациях 0,1 мМ; 0,05 мМ на 11,3 % и 13,67 % соответственно. Любопытным представляется тот факт, что в течение первых 30 мин процент обесцвечивания красителя достиг отметки в 4,2 % – средний результат в сравнении с двумя предыдущими экспериментами (0,1 мМ – 7,65 % (рис. 65); 0,05 мМ – 3,53 % (рис. 67)), в то время как спустя четыре часа степень разрушения красителя составила 20,8 %, что на 12,5 и 9,5 % больше, чем в экспериментах с концентраций красителя в 0,05 мМ и 0,1 мМ соответственно. Исходя из полученных данных, нами отмечается, что наибольший показатель обесцвечивания метилового оранжевого ферментом был достигнут именно при концентрации азокрасителя, равной 0,01 мМ.
При множественном сравнении показателей степени обесцвечивания метилового оранжевого обнаружено достоверное отличие между значениями, полученными спустя различное время инкубирования (рис. 70). По ранговому дисперсионному анализу Краскела-Уоллиса H = 57,78 при p 0,05. Во всех случаях, описанных выше и при сравнении с контролем U-критерий Манна-Уитни = 0 при p 0,05.
Согласно полученным нами данным, препарат лигнин-пероксидазы A. brasilense Sp245 оказался способен разрушать метиловый оранжевый во всех взятых в эксперимент концентрациях, с ростом степени разложения красителя с течением времени проведения реакции.
Полученные результаты согласуются с данными, представленными в литературе. Исследования показывают, что увеличение концентрации вносимого красителя приводит к уменьшению степени его обесцвечивания. Предполагается, что подобное явление может быть вызвано либо токсическим действием красителя, либо возрастанием концентрации красящего вещества по отношению к концентрации обесцвечивающих агентов. Также предполагается блокирование активных центров ферментов, разрушающих краситель, молекулами обесцвечиваемого вещества (Sani R.K., Banerjee U.C., 1999; Jadhav S.U. et al., 2008; Saratale R.G. et al., 2009; Tony B.D. et al., 2009 a, b).
Таким образом, по результатам данного эксперимента, нами впервые было подтверждено участие внеклеточной лигнин-пероксидазы бактерий рода Azospirillum в разрушении азокрасителя.