Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Система quorum sensing как новая перспективная мишень для антимикробной терапии (обзор литературы) 10
1.1. История открытия явления Quorum Sensing 10
1.2 Принцип организации систем Quorum Sensing 12
1.3 Биологическая роль систем Quorum Sensing 19
1.4 Особенности системы Quorum Sensing первого (LuxI-LuxR) типа 21
1.5 Система Quorum Sensing LuxI-LuxR типа у Chromobacterium violaceum 25
1.6 Методы и подходы к ингибированию системы Quorum Sensing
1.6.1 Ингибирование биосинтеза аутоиндуктора систем Quorum Sensing 28
1.6.2 Химическая или ферментативная деградация аутоиндуктора в среде обитания 31
1.6.3 Ингибирование связывания аутоиндуктора рецепторными белками 33
1.6.4 Блокирование экспрессии целевых генов 36
1.7 Растения и выделенные из них компоненты как ингибиторы систем Quorum Sensing патогенных бактерий 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46
2.1 Лекарственные растения и их экстракты 46
2.2 Методы разделения и анализа компонентного состава растительных экстрактов
2.2.1 Хроматографическое фракционирование экстракта коры дуба 49
2.2.2 Анализ компонентного состава коры дуба методом хромато-масс-спектрометрии
2.3 Библиотека химических соединений 51
2.4 Бактериальные штаммы и плазмиды
2.4.1 Виолацеинпродуцирующие штаммы Chromobacterium violaceum 51
2.4.2 Люминесцирующие штаммы Escherichia coli 54
2.5 Методы исследования анти-QS активности растительных экстрактов, их фракций и компонентов з
2.5.1 Исследование анти-QS активности в тестах ингибирования биосинтеза виолацеина 55
2.5.2 Исследование образования биопленки штаммами Chromobacterium violaceum 58
2.6 Оценка анти-QS активности растительных компонентов на биолюминесцентном штамме E. coli pAL103 59
2.7 Методы статистической обработки результатов исследования 60
Результаты и их обсуждение
Глава 3. Анализ биологической активности экстактов лекарственных растений в тестах на виолацеинпродуцирующих штаммах Chromobacterium violaceum 61
3.1 Скрининг экстрактов лекарственных растений в тесте ингибирования роста и пигмента виолацеина Chromobacterium violaceum 61
3.2 Анализ классификационного положения тестируемых лекарственных растений, проявляющих антибактериальную и анти-QS активности 68
3.3 Получение аддитивного биологического эффекта методом комбинирования активных QS-ингибирующих экстрактов 70
ГЛАВА 4. Исследование природы анти-qs активности экстракта коры дуба (quercus robur) 73
4.1. Хроматографическое исследование компонентного состава экстракта коры дуба (Quercus robur) 73
4.2. Анализ биологической активности ряда химических соединений, идентифицированных в составе экстракта коры дуба (Quercus robur) 81
4.3. Исследование биологических активностей производных 4-н-пропил-1,3-бензолдиола 86
4.4 Воссоздание молекулярной композиции экстракта коры дуба, сформированной из присутствующих в его составе малых молекул 94
Заключение 96
Выводы 104
Список сокращений 105
Список использованной литературы 106
- Система Quorum Sensing LuxI-LuxR типа у Chromobacterium violaceum
- Хроматографическое фракционирование экстракта коры дуба
- Анализ классификационного положения тестируемых лекарственных растений, проявляющих антибактериальную и анти-QS активности
- Исследование биологических активностей производных 4-н-пропил-1,3-бензолдиола
Система Quorum Sensing LuxI-LuxR типа у Chromobacterium violaceum
Уже несколько десятилетий внимание многочисленных исследователей, работающих с микроорганизмами в различных областях биологии и медицины, обращено на явление получившее название «Quorum Sensing» (QS). Данный термин означает особый тип регуляции экспрессии генов, зависящей от плотности популяции бактерий. Явление QS основано на действии низкомолекулярных сигнальных молекул различной природы, аутоиндукторов (АИ), способных накапливаться в культуре микроорганизмов при их высокой плотности (Greenberg et al., 1996; Miller, Bassler, 2001). С помощью АИ осуществляется коммуникация бактерий – передача информации между клетками, принадлежащих к одному и тому же или к разным видам, родам и даже семействам (Suga, Smith, 2003). Благодаря QS регуляции бактерии получают возможность координировано контролировать экспрессию генов во всем сообществе. Передача информации от клетки к клетке с использованием систем QS приводит к индукции специализированных наборов генов, что способствует быстрой адаптации популяций бактерий к меняющимся условиям и их выживанию в среде обитания (Fuqua et al.,1996).
Эффект QS был впервые обнаружен в конце прошлого столетия микробиологом W. Hastings и его учеником K. Nealson у морских люминесцирующих бактерий Vibrio fischeri (Nealson, Hastings, 1979).
Предметом их исследования являлось изучение особенности свечения бактерий V. fischeri, обитающих в теле кальмара Euprymna scolopes и способствующих его маскировке (Hastings, 1968). Анализ роста колоний V. fischeri в стенах лаборатории показал, что бактерии удваивают свою численность каждые двадцать минут, однако количество светящегося пигмента – люцифиразы – остается на прежнем уровне в течение многих часов, и только при слишком высокой плотности клеток количество люциферазы начинает расти. Hastings предполо 11 жил, что бактерии способны оценивать количество членов колонии и запускать механизмы, зависящие от их плотности (Nealson et al., 1970). Для обозначения этого феномена был предложен термин «Quorum Sensing» (Fuqua et al., 1994), что в переводе на русский язык означает «чувство кворума» (Гинцбург и др., 2003).
При исследовании механизма биолюминесценции V. fischeri был обнаружен внеклеточный фактор – аутоиндуктор, который регулировал продукцию лю-циферазы (Nealson et al., 1970). Проведенный анализ химической природы этого аутоиндуктора позволил идентифицировать его как N-(-кетокапроил)-L-гомосерина лактон, позже обозначенный как N-(3-оксо-гексаноил)-L-гомосерин лактон (С6-оксо-АГЛ). При этом важной особенностью подобной молекулы, лежащей в основе осуществляемой функции, является ее амфифильность с определяемой этим способностью к свободной диффузии через цитоплазматическую мембрану как во внешнюю среду так и в обратном направлении по градиенту концентрации (Eberhard et al., 1981).
Долгое время считалось, что QS присущ только морскими бактериями. Но в начале 1990-х годов при исследовании мутантных и диких штаммов фитопато-генной бактерии Erwinia carotovora на способность продуцировать антибиотик было показано, что подобный синтез происходит только вследствие передачи от диких штаммов сигнальных молекул мутантным штаммам. Изучение данных сигнальных молекул показало, что они были аналогичны по химической структуре сигнальным молекулам бактерии V. fischeri (Bainton et al., 1992).
В те же годы было обнаружено, что и патогенный для человека и животных микроорганизм Pseudomonas aeruginosa также имеет систему QS, ответственную за выработку эластазы – важного фактора вирулентности (Gambello, Ig-lewski, 1991). Участвовавшие в этом процессе АГЛ были идентифицированы как N-(3-оксо-додеканоил)-L-гомосеринлактон (3-оксо-С12-АГЛ) (Passador et al., 1993; Pearson et al., 1994; Gambello, Iglewski, 2004). Позднее была идентифицирована вторая система QS P. aeruginosa, отвечающая за регулирование рамнолипи-дов, гемолизинов и других факторов вирулентности бактерии (Latifi et al., 1995; Winson et al., 1995). В качестве АГЛ в этой системе был идентифицирован еще один ацелированный лактон – N-бутаноил-L-гомосеринлактон (С4-АГЛ) (Winson et al., 1995).
Таким образом, открытие QS долго оставалось недооцененным, поскольку считалось, что это свойство присуще только морским бактериям. Обнаружение основанных на действии ацилированных гомосерин лактонов систем QS у условно патогенных для человека бактерий Pseudomonas aeruginosa и растительных патогенов Erwinia carotovora позволило считать, что данное явление распространено более широко. Уже к началу XXI века было обнаружено более 100 видов микроорганизмов, продуцирующих АГЛ (Case et al., 2008).
Все известные системы QS работают на основании трех основных принципов. Во-первых, члены сообщества производят сигнальные молекулы – аутоин-дукторы (АИ). При низкой плотности клеток АИ диффундируют на большое расстояние и, следовательно, присутствуют в концентрациях ниже порога их обнаружения клетками. При высокой плотности бактериальной популяции, совместное производство сигнальных молекул приводит к локализации высокой концентрации АИ в межклеточном пространстве, что позволяет клеткам их обнаруживать и запускать процессы, контролируемые системой QS. (Kaplan, Greenberg, 1985). Во-вторых, АИ обнаруживаются специфическими рецепторами, которые располагаются в цитоплазме или в мембране клетки, и прямо или опосредованно через систему внутриклеточной сигнализации запускают процессы транскрипции ранее молчащих целевых генов. В-третьих, кроме активации экспрессии целевых генов, АИ способны запускать процесс собственного синтеза (Novick et al.,1995; Seed et al., 1995). Эта опережающая аутоиндукционная петля, предположительно способствует скоординированной активности популяции.
Главными компонентами системы QS являются сигнальные молекулы – АИ; белки-синтазы, их синтезирующие; рецепторные белки, в комплексе с АИ активирующие или деактивирующие транскрипцию целевых генов (Смольская, Песнякевич, 2006). Типы системы Quorum Sensing. В зависимости от химической природы АИ, а также характера и локализации воспринимающих их рецепторных белков, обнаруженные к настоящему времени системы Quorum Sensing могут быть подразделены на несколько типов (Рисунок 1) (Хмель, 2006; Шпаков, Перцева, 2008; Frederix, 2011): 1) QS системы грамотрицательных бактерий первого (LuxI-LuxR) типа, в качестве аутоиндуктора использующие различные по структуре ацилированные гомосерин лактоны (АГЛ); 2) QS системы, использующие аутоиндуктор 2-го типа (АИ-2); 3) прочие QS системы грамотрицательных бактерий, использующие ауто-индуктор 3-го типа (АИ-3) и гормоны эпинефрин/норэпинефрин; 4) системы QS грамположительных микроорганизмов, преимущественно использующие аутоиндукторы олигопептидной природы.
Хроматографическое фракционирование экстракта коры дуба
Хроматографическое разделение экстракта коры дуба (Quercus cortex) было осуществлено двухстадийным фракционированием, включающим прямофаз-ную колоночную хроматографию и обращено-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию.
На первом (предварительном) этапе проводили обессоливание растительного экстракта методом хроматографии с неподвижной фазой в условиях низкого давления. Для этого сухой экстракт коры дуба (5 мг), растворяли в 25 мл 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФА) и наносили на колнку Synchroprep RP-P С8 (SynChrom Inc, США) с диаметром пор 30 мкм, размером 25 на 50 мм. После выхода несвязанных (гидрофильных) компонентов общая гидрофобная фракция была элюирована 65% ацетонитрилом с 0,1% ТФА. Мониторинг выхода компонентов проводился при 280 нм и скорости потока 2 мл/мин. Полученные образцы были высушены на вакуумной центрифуге «Speedvac» (Savant, США), после чего лиофилизированы («Labconco», США) и предоставлены для биотестирования (фракции А и Б).
На втором (основном) этапе осуществляли обращено-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ОФ-ВЭЖХ), протокол которой с незначительными изменениями был аналогичен ранее предложенному A. Adonizio et al. (2008) для выделения анти-QS соединений из экстракта тропического рас 50 тения Conocarpus erectus. При этом выбор данного метода диктовался успешным опытом его использования при разделении сложных смесей веществ в аналитической химии и фармакологии, основанном на участии компонентов разделяемой смеси в сложной системе Ван-дер-Вальсовых взаимодействий (преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз.
Полученные на предыдущей стадии пробы были перерастворены в 0,1% ТФА, после чего разделение присутствующих в них компонентов было проведено методом ОФ-ВЭЖХ в системе высокоэффективного жидкостного хроматографа Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, США) на колонке Luna C18 (Phenomenex, США) с диаметром пор 5 мкм, размером 4,6 на 150 мм; стационарная поверхность силикагеля, в которой модифицирована с RMe2SiCl, где R – прямая цепочка алкильных групп C18H37. Разделение проводилось при температуре окружающей среды в линейном градиенте ацетонитрила (CH3CN): 0-36% в течение 50 мин, 36-80% в течение 3 мин и 80% в течение 15 мин. Мониторинг выхода компонентов проводился при 313 нм, изолированные фракции были освобождены от растворителя, лиофилизированы и представлены для последующего биотестирования.
Анализ компонентного состава растительных экстрактов проводили с использованием метода хромато-масс-спектрометрии (ХМС). При его выполнении 10 мг сухого растительного экстракт коры дуба растворяли в 1 мл метанола, хлороформа или ацетона, после чего шприцом Hamilton 1700 в объеме 10 мкл вводили в аналитическую колонку HP-5MS (длина: 30,0 м, диаметр: 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм) газового хроматографа, снабженного масс-селективным детектором GQCMS 2010 Plus (Shimadzu, Япония). В качестве газа-носителя использовали газообразный гелий (99,999%) при постоянной скорости потока 1 мл/мин. Исходная температура колонки была 100 С, которую повышали со скоростью 20 С/мин до 290 С. Детали данного метода: давление газа 73,0 кПа; общий поток 44 мл/мин.; поток по колонке 1,00 мл/мин.; линейная скорость 37,2 см/сек.; обдув септы 3,0 мл/мин.; деление потока 40,0. Параметры масс-спектрометрии описывались температурой ионного источника 200 С, температурой интерфейса 290 С; временем старта 2,5 мин.; временем окончания 33,00 мин.; начало m/z – 35,00; конец m/z – 450,00. Заявленная производителем чувствительность подобного варианта хромато-масс-спектрометрии составляла 10-6-10-9 г.
При интерпретации результатов исследований использовалось программное обеспечение GCMS Solutions, GCMS PostRun Analysis, для идентификации соединений использовался набор библиотек спектров CAS, NIST08, Mainlib, Wiley9 и DD2012 Lib. Количественное присутствие отдельных идентифицированных компонентов оценивалось относительной величиной (%), соотносящей площадь пика к общей площади хроматограммы экстракта.
По результатам хромато-масс-спектрометрии растительного экстракта была сформирована библиотека коммерчески доступных (Sigma-Aldrich, США; Enamine, Украина) химических соединений со степенью чистоты 95%, представляющих собой аналоги идентифицированных в экстакте коры дуба растительных компонентов, полностью идентичные по составу и химической структуре, но не выделенное из него, а полученное путем химического синтеза.
Основным инструментом исследования растительных экстрактов, их фракций и компонентов была генетически связанная пара штаммов вида Chromobacerium violaceum. К данному виду относятся грамотрицательные палочковидные факультативные анаэробные неспорообразующие бактерии, отличительной осо 52 бенностью которых является QS-зависимы процесс биосинтеза сине-фиолетового пигмента виолацеина.
Система QS этого вида пердставлена СviI-СviR группой белков. Образование данных белков кодируется генами cviI и cviR, из которых ген cviI (функциональный аналог гена luxI) кодирует синтазу аутоиндуктора СviI, а ген cviR (аналог гена luxR) кодирует рецепторный белок СviR с функцией транскрипционного регулятора (McClean et al., 1997). В свою очередь основным аутоиндуктором данной системы QS является N-гексаноил-гомосерин лактон (С6-АГЛ), синтезируемый белком СviI и воспринимаемый белком-рецептором СviR.
Как уже было сказано выше, наиболее ярким проявлением коллективного поведения C. violaceum является QS-зависимы синтез сине-фиолетового пигмента виолацеина (англ. – violacein) с максимумом поглощения при 570-600 нм., давшего название данному бактериальному виду и участвующему в его защите от солнечного излучения в условиях интенсивной инсоляции тропических и субтропических районов земного шара, а также обладающего антибиотическими и протистоцидными свойствами (Durаn et al., 2007; Becker et al., 2009).
Важной дополнительной особенностью этого вида является способность при росте на жидких средах в аэробных условиях образовывать поверхностную биопленку, что при развитии эффекта QS сопровождается накоплением в ней интенсивной сине-фиолетовой пигментации.
Первый из использованных штаммов – C. violaceum ATCC 31532, полученный из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection) (LGC Standards, Великобритания), представляет собой природный изолят с полноценной системой QS,. Он позволяет регистрировать комплексную анти-QS активность исследуемых веществ, реализуемую как через нарушение продукции АИ, так и через подавление его восприятия.
Анализ классификационного положения тестируемых лекарственных растений, проявляющих антибактериальную и анти-QS активности
В свою очередь спиртовые экстракты демонстрировали еще более выраженную активность, что проявлялось в увеличении площадей ингибирования роста по сравнению с водными экстрактами (кроме экстракта листьев толокнянки обыкновенной), а также к появлению аналогичных зон вокруг лунок, заполненных спиртовыми экстрактами листьев шалфея (Salvia officinalis) (25±5 мм2 и 31±4 мм2), побегов багульника (Ledum palustre) (19±6 и 31±4 мм2), почек березы (Betula verrucosa) (9±2 мм2 и 19±2 мм2) и корневищ девясила (Inula helenium) (9±2 мм2 и 9±3 мм2) в отсутствие такового эффекта в контроле – вокруг лунок, заполненных 40 % этанолом.
Корреляционный анализ значений ингибирования роста показал очень высокую степень зависимости между антибактериальной активностью водных (R = 0,998; P 0,001) и спиртовых экстрактов лекарственных растений (R = 0,994; P 0,001) в отношении обоих штаммов. Значительные коэффициенты корреляции были также показаны при выявлении зависимостей внутри штаммов С. violaceum АТСС 31532 (R = 0,992; P 0,001) и С. violaceum CV026 (R = 0,994; P 0,001) с аналогичными растительными экстрактами. Таким образом, первоначальный отбор из двадцати видов лекарственных растений, используемых в российской традиционной медицине, выявил прямую противомикробную активность у семи из них, что объясняет их традиционное использование в качестве лекарства против воспаления и инфицированных заболеваний. Большинство растительных экстрактов в анализируемых концентрациях, однако, не оказывали влияния на рост испытуемых микроорганизмов, что указывает на присутствие косвенных антимикробных эффектов, таких как QS-ингибирующая деятельность.
В продолжение данного исследования были констатированы несколько QS-регулирующих эффектов растительных экстрактов, которые не были полностью идентичны для штаммов C. violaceum дикого и мутантного типов. Так, многие фитоэкстракты стимулировали продукцию виолацеина диким типом C. violaceum АТСС 31532, что проявлялось в формировании интенсивного фиолетового ореола вокруг лунок, заполненных водными или спиртовыми экстрактами, в сравнении со светло-фиолетовым фоном (Рисунок 10А). Чтобы понять природу этого эффекта те же растительные экстракты были исследованы в тесте на му-тантном штамме С. violaceum CV026 без добавления C6-АГЛ. Среди 20 видов лекарственных растений только водные и спиртовые экстракты череды (Bidens tripartita) индуцировали фиолетовые ореолы (Рисунок 10Б), в то время как другие растения не показали заметных эффектов. Этот результат указывает на то, что увеличение содержания виолацеина в большинстве случаев является следствием неспецифических механизмов, предположительно реализуемых через повышение концентрации питательных субстратов, вносимых с экстрактом лекарственного растения. Следствием этого является более быстрое увеличение плотности клеток дикого штамма с достижением QS-зависимой коммуникации.
На этом фоне подавление продукции виолацеина, свидетельствующее об ингибировании QS у бактерий в присутствии экстрактов лекарственных растений, оказалось значительно более частым феноменом. В частности, выраженное ингибирование продукции пигмента виолацеина как дикого (АТСС 31532), так и мутантного (CV026) штаммов С. violaceum было зарегистрировано при использовании водных и спиртовых экстрактов коры дуба (депигментированные зоны площадью в 75±5 и 94±11 мм2), почек березы (89±5 – 113±12 мм2), листьев эвкалипта и толокнянки (175±13 – 276±33 мм2 и 126±16 – 204±30 мм2, соответственно).
Мы впервые обнаружили анти-QS свойства почек березы бородавчатой (Beula verrucosa), в то время как прямые антибактериальные свойства экстрактов березы было продемонстрированы ранее (Duric et al., 2013). Также мы представляем данные о анти-QS деятельности листьев эвкалипта прутовидного (Eucalyptus viminalis), что хорошо согласуется с данными о анти-QS свойствах эвкалиптового масла (Szabo et al., 2010), а также о значительном снижением QS-опосредованном образовании биопленки экстрактами Eucalyptus globulus (Kokkiligadda et al., 2013). Наконец, мы подтвердили анти-QS активность экстракта коры дуба черешчатого (Quercus robur), описанную ранее Adonizio для Quercus virginiana (Adonizio et al., 2008). Ранее при «слепом» скрининге лекарственных растений безотносительно рекомендаций по их практическому применению процент положительных находок анти-QS активности оказывается значительно ниже (7-10%) (Adonizio et al., 2006; Koh, Tham, 2011). В этой связи результаты настоящего исследования, свидетельствующие о более чем 50% распространении данного свойства в специально отобранной выборке, свидетельствуют о типичности его присутствия у лекарственных растений, используемых традиционной российской медициной для лечения инфекционно-воспалительных состояний.
Продолжая анализ полученных результатов, определили, что водные экстракты листьев брусники и побегов багульника вызывали подавление продукции виолацеина у мутантного штамма С. violaceum CV026 (депигментированные зоны площадью в 83±6 мм2 и 19±6 мм2, соответственно), но оказывались неактивными против штамма дикого типа, в отношении которого изолированный эффект (31±4 мм2) индуцировал водный экстракт плодов можжевельника (Juniperus communis). Кроме того, как показано в таблице 5, заметное ингибирование продукции виолацеина наблюдалось при тестировании спиртового экстракта корневищ девясила (Inula helenium) и сабельника (Comarum palustre), цветков календулы (Calendula officinalis) и шиповника (Rosa majalis).
Корреляционный анализ представленных данных выявил, что ингибирова-ние продукции виолацеина более значимо выражено для штаммов С. violaceum АТСС 31532 (R = 0,926; P 0,001) и С. violaceum CV026 (R = 0,904; P 0,001) при обработке водными или этанольными растительными экстрактами, чем сравниваемые эффекты водных (R = 0,749; P 0,01) или этанольных (R = 0,790; P 0,01) извлечений против обоих штаммов. Таким образом, результаты демонстрируют взаимодополняющий характер дикого и мутантного типов С. violaceum по выявлению общих анти-QS свойств исследуемых лекарственных растений.
Поскольку целый ряд растительных экстрактов продемонстрировал как антибактериальную так и анти-QS активности, была проанализирована статистическая взаимосвязь между подобными эффектами. С этой целью для штаммов дикого C. violaceum АТСС 31532 и мутантного C. violaceum CV 026, обработанных водными или спиртовыми экстрактами лекарственных растений были рассчитаны парные коэффициенты корреляции Пирсона, а результаты подобных зависимостей были представлены в виде графиков линейных регрессий (Рисунок 11).
При проведении подобной оценки в отношении дикого штамма C. violaceum АТСС 31532 между уровнями антибактериальной и анти-QS активностей была за-фиксирована умеренно выраженная взаимозависимость (Р 0,01) со значениями R1 = 0,642 при тестировании водных и R2 = 0,706 при тестировании спиртовых экстрактов, которая, однако, не могла быть корректно линеаризована (Рисунок 11А). Более того, в биотесте на C. violaceum CV026 статистические связи между анализируемыми параметрами становились незначимыми: R1 =0,430 для водных и R2 = 0,358 спиртовых экстрактов, соответственно (P 0,01), и также не могли быть корректно линеаризованы (Рисунок 11Б).
Исследование биологических активностей производных 4-н-пропил-1,3-бензолдиола
Лекарственные растения и происходящие из них компоненты насчитывают тысячелетнюю историю использования (Гончарова, 1997). Несмотря на успехи современной фармакологии, традиционная (народная) китайская, индийская и российская медицина, основанные на использовании экстрактов лекарственных растений, продолжают завоевывать многочисленных поклонников. Основная причина этого – выраженный клинический эффект фитотерапии при минимальном перечне побочных осложнений.
Среди показаний к использованию лекарственных растений значительное место занимают инфекционно-воспалительные заболевания кожи, кишечника, органов системы дыхания, мочевыделительной системы и т.д. При этом традиционное объяснение эффективности при данных нозологиях связано с присутствием в составе лекарственных растений веществ с выраженной антимикробной активностью – фитонцидов (Токин, 1951) или фитоалексинов (Ahuja et al., 2012). Однако, достаточно часто фитотерапия инфекционных состояний оказывается успешной и в отсутствии выраженного прямого бактерицидного или бактерио-статического действия используемых лекарственных растений.
Одно из предложенных объяснений данного феномена связано с существованием принципиально иного механизма биологической активности, определяемого присутствием в составе лекарственных растений соединений, эффективно ингибирующих систему плотностно-зависимой коммуникации (Quorum Sensing) бактериальных патогенов (Koh et al., 2013). Соответственно, основным вариантом действия подобных соединений при инфекционной патологии является не «уничтожение» микроорганизмов, а их «перепрограммирование» в благоприятном для хозяина направлении. Предположительно возникнув как орудие борьбы с бактериальными инфекциями растений, данный механизм в дальнейшем мог быть эффективно перенесен в гетерологичные системы (организм человека или животных), условием для чего являлся стереотипных характер организации систем Quorum Sensing (в частности, систем LuxI-LuxR типа) у фито- и зоопатоген-ных видов бактерий.
Экспериментально полученные доказательства полностью подтверждают данное предположение. Выраженная анти-QS активность уже зарегистрирована и продолжает выявляться у широкого круга лекарственных растений, используемых традиционной китайской (Liu et al., 2008), индийской (Zahin et al., 2010), ближневосточной (Al-Hussaini, Mahasneh, 2009) и европейской (Ponnusamy et al., 2009) медициной. Проведенное исследование является первым опытом поиска анти-QS активности в экстрактах лекарственных растений, используемых народной российской медициной для лечения и профилактики различных инфекционных состояний, и этот опыт представляется удачным. При комплексном сравнительном анализе механизмов антибактериальной и QS-ингибирующей активностей водных и спиртовых извлечений из 20 лекарственных растений, используемых традиционной российской народной медициной продемонстрирована типичность присутствия в них анти-QS активности, что характеризует исследованные лекарственные растения в качестве перспективного источника для поиска и выделения антибактериальных соединений нового принципа действия.
Среди 20 исследованных лекарственных растений наиболее выраженная анти-QS активность зарегистрирована у экстрактов коры дуба (Quercus robur), почек березы (Betula verucosa) и листьев эвкалипта (Eucalyptus viminalis). При этом названные растения ранее уже попадали в поле зрения ряда исследователей. Так анти-QS активность дуба Quercus virginiana ранее описана Adonizio et al. (Adonizio et al., 2008). Аналогичная активность, дополняющая представления об ингибировании образования бактериальных биопленок экстрактами Eucalyptus globulus (Kokkiligadda et al., 2013), продемонстрирована у масла эвкалипта (Szabo et al., 2010). Наконец анти-QS активность березовых почек, ранее демонстрировавших умеренно выраженную прямую антибактериальную активность (Duric et al., 2013), в рамках настоящего исследования была описана впервые. Таким образом, полученные результаты продолжают и развивают представления о типичности анти-QS действия лекарственных растений, применяемых для терапии раз 98 личных инфекционных состояний, одновременно впервые описывая «растения-лидеры» с подобной активностью, произрастающие на территории Российской Федерации и используемые для этих целей народной российской медициной.
Еще одним важным наблюдением представляется выявление соответствия между способностью к ингибированию системы QS LuxI-LuxR типа и филогенетическим (классификационным) положением лекарственных растений, отраженным в современной таксономической системе APG III (2009). При этом если наличие выраженной прямой антибактериальной активности оказывалось типичным для лекарственных растений клада asterids, порядка Ericales (Верескоцвет-ные), то наиболее активные анти-QS лекарственные растения локализовались в кладе rosids с наибольшей близостью в составе порядка Fagales (Букоцветные). В данном контексте полученные данные хорошо согласуются с представлениями о неравномерном распределении способности к ингибированию QS в царстве растений с преимущественным обнаружением внутри определенных родов и семейств. В частности, ранее выраженная способность показана для многих представителей семейства Lamiaceae (например – шлемника байкальского, Scutellaria baicalensis), находящих соответствующее применение в народной китайской медицине (Song et al., 2012). Тем самым полученные результаты свидетельствуют в пользу эволюционного происхождения систем контроля бактериальных инфекций у растений, являющихся следствием параллельной эволюции паразита и хозяина и ведущих к появлению специфического набора инструментов, ориентированного на прямое бактерицидное или непрямое регуляторное подавление основного фитопатогена (группы фитопатогенов). В свою очередь практически ориентированный аспект полученного результата заключается в определении наиболее перспективных направлений целенаправленного биоинформационного поиска соответствующих активностей (в том числе анти-QS) активности среди представителей двудольных растений.