Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Общая характеристика возбудителя туберкулеза и устойчивость к противотуберкулезным препаратам 12
1.1.1 Морфологические, культуральные и биохимические свойства возбудителя туберкулеза 12
1.1.2 Лекарственная устойчивость М. tuberculosis и ее типы 17
1.1.3 Молекулярно-генетические механизмы формирования резистентности М. tuberculosis к основным противотуберкулезным препаратам 18
1.2 Лабораторная диагностика туберкулеза 26
1.2.1 Фенотипические методы диагностики 26
1.2.2 Современные ускоренные молекулярно-генетические методы диагностики 32
1.2.3 Методы выявления жизнеспособных микобактерий туберкулеза в клиническом материале 36
1.3 Актуальность проблемы туберкулеза и лекарственной устойчивости в мире и в
Российской Федерации 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 41
2.1 Объект исследования 41
2.2 Бактериологические методы 43
2.2.1. Обработка клинических образцов 43
2.2.2 Микроскопическое исследование образцов 44
2.2.3 Культуральное исследование образцов и методы идентификации 45
2.2.4 Проведение фенотипических тестов на лекарственную чувствительность 46
2.2.5 Выделение ДНК из клинических образцов и изолятов 50
2.3 Молекулярно-генетические методы з
2.3.1 Определение лекарственной чувствительности молекулярно-генетическими методами 51
2.3.2 Типирование по спейсерным олигонуклеотидам (сполиготипирование) 57
2.3.3 Определение жизнеспособности микобактерий с использованием моноазида пропидия (метод ПМА) 58
2.3. Методика ввода данных 59
2.4 Методы статистического анализа 60
ГЛАВА 3. Лекарственная устойчивость штаммов м. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в самарской области, находившихся на лечении в течение 2008-2010 гг 62
3.1 Идентификация и лекарственная устойчивость штаммов М. tuberculosis, выявленная фенотипическими методами 62
3.2 Лекарственная устойчивость штаммовМ. tuberculosis, выявленная молекулярно-генетическими методами
3.2.1 Мутации, определяющие резистентность к противотуберкулезным препаратам, среди штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в Самарской области 73
3.2.2 Оценка диагностических параметров ускоренных молекулярно-генетических методов определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам 79
3.3 Генетические группыМ tuberculosis 91
ГЛАВА 4. Диагностика туберкулеза путем определения жизнеспособности клеток м. tuberculosis в респираторных образцах с использованием моноазида пропидия 95
ГЛАВА 5. Эпидемиологические аспекты лекарственной устойчивости в самарской области: факторы риска, влияние на исходы лечения и выживаемость пациентов 102
5.1 Факторы риска лекарственной устойчивости к препаратам первого ряда и резервным препаратам 102
5.2 Влияние спектра лекарственной устойчивости на исходы лечения и выживаемость больных туберкулезом 104
Глава 6. Оптимизация алгоритма ускоренной диагностики туберкулеза 111
Заключение 116
Выводы 120
Список использованной литературы
- Молекулярно-генетические механизмы формирования резистентности М. tuberculosis к основным противотуберкулезным препаратам
- Микроскопическое исследование образцов
- Лекарственная устойчивость штаммовМ. tuberculosis, выявленная молекулярно-генетическими методами
- Влияние спектра лекарственной устойчивости на исходы лечения и выживаемость больных туберкулезом
Молекулярно-генетические механизмы формирования резистентности М. tuberculosis к основным противотуберкулезным препаратам
Еще одним важным компонентом клеточной стенки МВТ является липоарабиноманан. Он заякорен на цитоплазматической мембране, пронизывает клеточную стенку и выходит на ее поверхность. Его терминальные фрагменты (маннозные радикалы) подавляют активацию Т-лимфоцитов, что ведет к нарушению иммунного ответа (Зверев, 2010).
Помимо прочего микобактерии туберкулеза нечувствительны ко многим классам антибиотиков, в том числе к препаратам бета-лактамного и тетрациклинового ряда. Это обеспечивается наличием у МВТ бета-лактамазы, а также строением их клеточной стенки: высокогидрофобная поверхность служит физическим барьером для антимикробных агентов (Jarlier, 1994). Микобактерии также способны формировать лекарственную устойчивость к специфическим противотуберкулезным препаратам, что создает значительные сложности для лечения пациентов, инфицированных такими штаммами М. tuberculosis
Открытие препаратов, обладающих активностью в отношении микобактерии туберкулеза, навсегда изменило многовековую историю заболевания. Одним из первых таких лекарств был стрептомицин, открытый Ваксманом и Шацем в 1944 году (Schatz, 1944). Однако очень скоро были выявлены штаммы микобактерии, нечувствительные к терапевтическим концентрациям стрептомицина, что явилось следствием монотерапии этим антибиотиком (Wolinsky, 1948).
В 1952 году была открыта противотуберкулезная активность изониазида, и, практически сразу было зафиксировано развитие устойчивости к нему у штаммов микобактерии (Bowen, 1952). Рифампицин начали использовать в середине 60-х гг. прошлого века, и, уже в 1969 были обнаружены резистентные к антибиотику штаммы (Manten, 1969).
На сегодняшний день лекарственно устойчивый (ЛУ) туберкулез представляет серьезнейшую проблему для здравоохранения во многих странах мира. Наличие антибиотикорезистентности у возбудителя заболевания является одним из основных факторов, определяющих значительное снижение эффективности лечения, а также уменьшение продолжительности жизни пациентов (Mitnick, 2003; Leimane, 2005).
В зависимости от количества антибиотиков, к которым возбудитель нечувствителен, выделяют несколько видов лекарственной устойчивости микобактерий: монорезистентность - наличие у штамма устойчивости к одному противотуберкулезному препарату; - полирезистентность - наличие у штамма устойчивости к двум и более противотуберкулезным препаратам без одновременной устойчивости к изониазиду и рифампицину; - множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) - нечувствительность штамма как минимум к двум наиболее эффективным противотуберкулезным препаратам -изониазиду и рифампицину; - широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ) - нечувствительность штамма как минимум к изониазиду, рифампицину, а также к одному из препаратов группы фторхинолонов (офлоксацин, моксифлоксацин и др.) и одному из инъекционных препаратов (амикацин, канамицин, капреомицин и др.).
Помимо этого также выделяют первичную и вторичную лекарственную устойчивость. Первичная ЛУ определяется как устойчивость, обнаруженная у микобактерий, выделенных от пациента, который никогда ранее не получал противотуберкулезные препараты, либо получал их в течение не более 4-х недель. В данном случае предполагается, что пациент был изначально инфицирован антибиотикорезистентным штаммом микобактерий. Уровни первичной лекарственной устойчивости характеризуют состояние циркулирующей на данной территории популяции микобактерий; ее показатели важны для оценки степени напряженности эпидемической ситуации (Коровкин, 2005).
Вторичная (приобретенная) ЛУ определяется как устойчивость микобактерий, выделенных от пациента, получавшего специфическую противотуберкулезную терапию в течение месяца и более. Показатели вторичной ЛУ являются косвенным показателем эффективности проводимого лечения больных ТБ (Коровкин, 2005). 1.1.3 Молекулярно-генетические механизмы формирования резистентности М. tuberculosis к основным противотуберкулезным препаратам
Одной из особенностей генома микобактерий туберкулеза явлется относительно большой его размер (более 4 миллионов пар нуклеотидов), а также преобладание гуанина и цитозина, которые составляют около 70% всех нуклеотидов. Геном МВТ содержит 4000 генов, из которых 60 кодируют компоненты РНК (Мишин, 2007). Для микобактерий характерна крайне высокая степень внутривидовой генетической гомогенности; степень синонимичных нуклеотидных полиморфизмов оценивается в 0,01-0,03% (Cole, 1998; Fleischmann, 2002)
Горизонтальный перенос генов посредством плазмид и транспозонов, являющийся основным механизмом распространения антибиотикорезистентности среди многих других видов микроорганизмов, для микобактерий нехарактерен. Основной причиной формирования устойчивости М. tuberculosis к ПТП являются спонтанно возникающие точечные мутации в генах, кодирующих важные для метаболизма бактериальных клеток белки, которые являются мишенями для антибиотиков. Считается, что появление лекарственной устойчивости вследствие подобных мутаций - явление достаточно редкое, поскольку частота их возникновений относительно невелика - 1 на 10-10 репликаций. Формирование же резистентности одновременно к 3 препаратам в этом случае представляется практически невозможным (вероятность 10" и менее) (Zhang, 2009). И, тем не менее, мы наблюдаем широкое распространение и непрерывный рост количества ЛУ штаммов микобактерий во многих регионах мира.
Основную роль в развитии лекарственной устойчивости микобактерий и нарастании уровней ЛУ играет отбор и накопление в тканях микобактерий с изначально спонтанно возникшими мутациями, главным образом вследствие неадекватного лечения (в т.ч. монотерапии). Чаще всего такая ситуация связана с отсутствием лабораторных данных по антибиотикорезистентности, а также перебоями со снабжением противотуберкулезными препаратами и низкой приверженностью пациентов к лечению. Еще более усугубляет проблему то, что сформировавшиеся в процессе лечения антибиотикорезистентные штаммы способны далее распространятся в популяции; в этом случае пациенты изначально инфицируются ЛУ ТБ (Рисунок 6).
Микроскопическое исследование образцов
Объектом исследования послужили 2 группы образцов, характеристика которых представлена ниже.
В эту группу вошли клинические образцы и выделенные из них в последующем штаммы М. tuberculosis от 877 пациентов с легочным ТБ, проходивших стационарное или амбулаторное лечение с 01.09.2008 по 01.09.2010 в противотуберкулезных учреждениях г. Самары и Самарской области. В исследование включались пробы, полученные от пациентов, удовлетворяющие следующим критериям включения:
Набор пациентов и взятие биологического материала производили в рамках многоцентрового международного научно-исследовательского проекта «ТБ-Евроген» (грант Евросоюза 201483), одобренного Комитетом по медицинской этике при Министерстве здравоохранения и социального развития Самарской области.
Исследуемая выборка больных составила 59% (877 из 1485) от всех бактериологически подтвержденных (микроскопическими и/или культуральными исследованиями) случаев ТБ по Самарской области за период с 01.09.2008 по 01.09.2010, что позволяет говорить о ее репрезентативности для данного региона. В рассматриваемой группе преобладали мужчины (78%); средний возраст больных составил 40,9 ± 11,6 лет. У 66% пациентов туберкулез был диагностирован впервые, остальные проходили повторные курсы химиотерапии. Подавляющее большинство являлись жителями крупных городов (Самара, Тольятти, Сызрань), 28% проживали в сельской местности (Приложение А). Более подробная характеристика участников исследования из первой группы представлена в Приложении Б. От каждого больного было получено по 1 образцу мокроты, который в последующем использовался для: - выделения ДНК для последующих молекулярно-генетических исследований - микроскопии, посева и выделения культур микобактерий
Было получено 877 изолятов (пациенты с отрицательным результатом посева исключались из исследования), на которых в дальнейшем проводились культуральные и иные исследования, в том числе идентификация вида микроорганизма, определение спектра лекарственной чувствительности и генотипирование.
Для всех пациентов из первой группы (N=877) был проведен сбор клинико-эпидемиологической информации, которая совместно с данными бактериологических и молекулярно-генетических исследований использовалась для анализа факторов риска лекарственной устойчивости. Также был проведен анализ влияния спектра лекарственной устойчивости на исход лечения больных, для которых были доступны соответствующие данные, и анализ выживаемости пациентов.
Внутри первой группы образцов была выделена подгруппа из 90 проб, полученных от пациентов с сочетанной ВИЧ-инфекцией и подтвержденным диагнозом МЛУ ТБ. Данная выборка образцов использовалась для апробации молекулярно-генетического теста GenoType MTBDRs/, направленного на определение лекарственной устойчивости к препаратам резервного ряда. Образцы мокроты из данной выборки обрабатывались таким же способом, что и другие пробы первой группы; в дальнейшем, помимо всех вышеперечисленных методик, использовались для определения лекарственной устойчивости с помощью тест системы GenoType MTBDRs/.
Во данную группу вошли респираторные образцы (N=501), полученные от 80 пациентов, находившихся на лечении в период с 09.01.2011 по 27.03.2014 в противотуберкулезных учреждениях г. Самары, удовлетворяющие ранее перечисленным критериям включения, а также при отсутствии специфического лечения до момента включения в исследование (т.е. включение и забор первых образцов обязательно осуществлялся до начала нового эпизода химиотерапии). Набор больных и взятие биологических образцов данной группы производили в рамках международного научно-исследовательского проекта «ТБ-Паннет» (грант Евросоюза 223681), одобренного Комитетом по медицинской этике при Министерстве здравоохранения и социального развития Самарской области. Мужчины составили 75% пациентов второй группы, средний возраст достигал 40,3 ± 14,3 лет. Подавляющее большинство больных (86,3%) были впервые выявленными.
Все полученные от пациентов респираторные образцы после процедуры обработки подвергались микроскопическому исследованию, а также использовались для выделения ДНК и посева на 2 вида питательных сред: модифицированную среду 7Н9 с использованием системы автоматизированного культивирования ВАСТЕС MGIT 960 (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) и среду Левенштейна-Йенсена. Все процедуры бактериологических исследований производились в соответствии с инструкцией производителя системы ВАСТЕС MGIT 960 (Siddiqi, 2006), а также согласно Приказу № 109 МЗ РФ "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" (Приказ № 109 МЗ РФ).
Первичную обработку поступившей мокроты проводили с использованием реагента BBL МусоРгер , содержащего гидроксид натрия в конечной концентрации 1% и N-ацетил-Ь-цистеин (NALC) (Siddiqi, 2006). Для этого образцы мокроты заливали равным количеством свежеприготовленного раствора NALC-NaOH, многократно перемешивали, далее инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут, после чего фосфатным буфером (BBL МусоРгер Phosphate Buffer) доводили объем пробы до 50 мл и центрифугировали 20 минут при ускорении 3000G. После супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 1-1,5 мл фосфатного буфера. Ресуспендированный осадок использовали для посева на питательные среды, а также для приготовления мазка.
Приготовление мазков проводилось с использованием осадка материала, полученного после процедуры обработки мокроты. Окрашивание мазков осуществлялось с помощью раствора аурамина/родамина в концентрации 0,1% и 0,01% соответственно (Приказ № 109 МЗ РФ). Для выявление кислотоустойчивых бактерий в мазках применялся метод люминесцентной микроскопии. В Таблице 1 представлена система градации результатов микроскопического исследования при помощи люминесцентного микроскопа и ее соотношение с системой количественной оценки при световой микроскопии.
Лекарственная устойчивость штаммовМ. tuberculosis, выявленная молекулярно-генетическими методами
Преобладание мутации D94G в гене gyrA среди устойчивых к фторхинолонам штаммов и мутации A401G в гене rrs среди устойчивых к инъекционным препаратам штаммов было продемонстрировано рядом других авторов в разных географических регионах (Ни, 2013; Елисеев, 2013; Tukvadze, 2014). Мутация M306V в гене етЪВ также отмечалась большинством исследователей как наиболее часто определяющая устойчивость микобактерий к этамбутолу (Li, 2010; Елисеев, 2013).
Также следует отметить, что наши данные вполне соответствуют результатам других исследований, в рамках которых было проведено полное геномное секвенирование значительной выборки штаммов, циркулирующих в Самарской области (Casali, 2012; Casali, 2014). В частности согласно данным Casali, et al. распространенность мутаций в гене katG среди штаммов региона почти достигает 60% (в нашем исследовании 65%); гене гроВ - 50% (в нашем исследовании 54%). Помимо этого была продемонстрирована относительно редкая встречаемость мутаций в гене rrs наряду с более частой встречаемостью мутаций в гене gyrA, что также имело место в нашей работе. Это указывает на достаточно высокую точность метода GenoType MTBDRs/ для определения соответствующих мутаций в геноме М. tuberculosis.
Из 795 протестированных проб наличие комплекса Mycobacterium tuberculosis (присутствие полоски TUB на мембране) было выявлено у 749 образцов (94,2%). Читаемые данные по рифампицину были получены для 728 (91,6%), а по изониазиду - для 725 (91,2%) образцов. Таким образом, интерпретируемость результатов теста в целом оказалась весьма высокой. Нами также было установлено, что интенсивность окраски полос на мембране, а, следовательно, и возможность объективного прочтения результатов существенно варьировала в зависимости от концентрации микобактерий в образцах мокроты, которая отражалась в степени положительности проб при микроскопическом исследовании (Рисунок 17). и О
Было выявлено, что интерпретируемость результатов теста достоверно повышается с увеличением концентрации КУМ в образце (1+ по сравнению с 1-9 КУМ ОШ= 3,52, 95% ДИ 1,78-6.91; 2+ по сравнению с 1+ 0111=2,24, 95% ДИ 1,02-5,19; 3+ по сравнению с 2+ ОШ= 2,32, 95% ДИ 1,00-5,27).
С помощью данного метода устойчивость к изониазиду была обнаружена у 512 (70,2%) штаммов, к рифампицину - у 474 (65%) штаммов, множественная лекарственная устойчивость наблюдалась у 437 (61,2%) изолятов. Сопоставление данных определения лекарственной чувствительности, полученных двумя методами (молекулянро-генетическим и фенотипическим) указывает на высокий уровень совпадений результатов. Для изониазида процент полностью совпавших профилей чувствительности составил 91,2%), для рифампицина - 88,2%, в случае МЛУ совпали 89,1% результатов (Таблица 8). Количество совпадений несколько варьировало в зависимости от концентрации КУМ в мокроте, прослеживалась тенденция к возрастанию сходимости результатов с ростом степени положительности образца. Так, для изониазида, среди проб с результатом микроскопии 3+ полностью совпавших ответов было достоверно больше, чем проб с результатом микроскопии 1-9 КУМ в 100 полях зрения (0111=3,99, 95% ДИ 1,50; 9,72, р=0,003). Для рифампицина сходимость достоверно повышалась и у образцов 2+ (0111=2,87 95% ДИ 1,18; 6,83, р=0,001) и для образцов 3+ (0111=6,23 95% ДИ 2,71; 13,77, р 0,001). Это может быть связано с возможными неточностями при интерпретации образцов с меньшей концентрацией КУМ вследствие недостаточной интенсивности окраски полосок и неоднозначности при прочтении, что свидетельствует о необходимости повышения чувствительности метода.
Расхождения результатов фенотипических и молекулряно-генетических методов также могут быть обусловлены присутствием более чем одного штамма микобактерий в образцах мокроты, что уже обсуждалось в разделе 3.2.1. Помимо этого у некоторых изолятов устойчивость к противотуберкулезным препаратам может определяться еще не изученными мутациями, либо мутациями, не учитываемыми данной тест-системой. По данным Hazbon et. al. от 10 до 25% штаммов, демонстрирующих невысокие уровни устойчивости к изониазиду, не несут мутаций ни в гене katG, ни в гене inhA (Hazbon, 2006). Было установлено, что резистентность микобактерий к изониазиду в некоторых случаях может определяться мутациями в других генах, среди которых были описаны ген kasA, кодирующий один из ключевых ферментов, участвующих в синтезе миколовых кислот (Mdluli, 1998), ген ndh, кодирующий NADH-зависимую дегидрогеназу (Miesel, 1998), а также ген ahpC, кодирующий алкилгидропероксидредуктазу (Sreevatsan, 1997), хотя мутации в гене ahpC чаще считают компенсаторными. В одном из недавних исследований было идентифицировано еще 60 генов, которые потенциально могут определять резистентность к изониазиду среди штаммов фенотипически нечувствительных к данному препарату, но не имеющих ни одной из наиболее часто обуславливающих устойчивость мутаций (Shekar, 2014). Еще одним возможным механизмом формирования устойчивости как к изониазиду, так и к рифампицину может быть суперэкспрессия мембранных белков-насосов, способных удалять антибиотик из бактериальной клетки (Machado, 2012).
Нами также был проведен расчет основных диагностических параметров для оценки эффективности определения ЛУ - чувствительности, специфичности, прогностической ценности положительного и отрицательного результатов (Таблица 9). В целом все показатели, отражающие результативность теста были очень высоки. Чувствительность выявления устойчивости к изониазиду и рифампицину, а также чувствительность для обнаружения МЛУ ТБ превышала 95%; специфичность была несколько ниже, но превышала 80% как для отдельных препаратов, так и для МЛУ. Это говорит о склонности метода к некоторой переоценке показателей устойчивости при его проведении на материале клинических образцов. Как мы уже отмечали, респираторные пробы могут содержать смесь различных штаммов возбудителя, что детектируется методикой, однако по рекомендации производителя результат в подобных случаях следует читать как устойчивость.
Влияние спектра лекарственной устойчивости на исходы лечения и выживаемость больных туберкулезом
На сегодняшний день туберкулез является одной из серьезнейших проблем для здравоохранения во всем мире, продолжая оставаться причиной смерти миллионов людей ежегодно. Значительно усугубляет ситуацию широкое распространение лекарственно устойчивых форм заболевания, в особенности МЛУ и ШЛУ ТБ, лечение которых длительно и, как правило, малоэффективно. В последнее время все большую настороженность вызывает возможность активной трансмиссии антибиотикорезистентных штаммов М. tuberculosis в популяции. МЛУ ТБ, изначально явившийся результатом неадекватной химиотерапии и недостаточной приверженности больных к лечению, сейчас во многих странах приобретает масштаб эпидемии; данные молекулярно-генетических исследований свидетельствуют о том, что наблюдаемый рост уровней множественной и широкой лекарственной устойчивости определяется именно активной трансмиссией МЛУ/ШЛУ ТБ штаммов (Toil, 2014).
В данной работе проведен детальный анализ распространенности лекарственной устойчивости среди циркулирующих в Самарской области штаммов М. tuberculosis, включающий в себя оценку частоты встречаемости ЛУ к противотуберкулезным препаратам основного и резервного ряда, а также определение основных мутаций, ассоциированных с устойчивостью к ПТП. Было выявлено значительное распространением антибиотикорезистентных микобактерий в изучаемом регионе, что наиболее заметно среди пациентов, ранее получавших лечение по поводу ТБ. Доля МЛУ ТБ в этой группе пациентов превысила 74%; 10% были инфицированы микобактериями с широкой лекарственной устойчивостью. Высокими были и показатели первичной ЛУ: почти половина (43,5%) штаммов, полученных от впервые выявленных пациентов, обладали множественной лекарственной устойчивостью, почти 3% оказались ШЛУ. Среди наиболее распространенных мутаций, детерминирующих устойчивость микобактерий к изониазиду и рифампицину в исследуемой выборке изолятов, были S315T1 в гене katG и S531L в гене гроВ соответственно. Резистентность к фторхинолонам чаще всего определялась наличием мутации D94G в гене gyfA; к аминогликозидам/капреомицину - мутации A401G в гене rrs.
Нами также была проведена оценка динамики показателей ЛУ за последние 10 лет, в рамках которой выявлен значительный рост доли антибиотикорезистентных штаммов, особенно среди пациентов, никогда ранее не получавших специфической терапии. Частота встречаемости первичного МЛУ ТБ за этот период увеличилась вдвое; уровень первичной устойчивости к фторхинолонам возрос в 7 раз, к аминогликозидам - почти в 2 раза. Подобная динамика, также имеющая место во многих других регионах Российской Федерации (Левченко, 2011; Стрельцова, 2011), вероятнее всего указывает на недавнюю и активную трансмиссию МЛУ и ШЛУ ТБ штаммов М. tuberculosis, причиной которой, помимо недостаточности мер инфекционного контроля, могут быть биологические свойства патогена, обуславливающие его эволюционную успешность. В частности, выявленное в рамках текущего исследования преобладание в регионе генетической группы Beijing, обладающей повышенной вирулентностью, патогенностью и ассоциированностью с лекарственной устойчивостью, может являться одной из причин, лежащих в основе столь быстрого распространения антибиотикорезистентных штаммов в регионе. Кроме того, семейство Beijing характеризуется высоким уровнем изменчивости вследствие более частого возникновения мутаций, предположительно вызываемых наличием дефектов в генах, ответственных за репарацию повреждений в ДНК (Dos Vultos, 2008). Это, в свою очередь, создает предпосылки для дальнейшего развития лекарственной устойчивости, косвенно отражаемой в наблюдаемом нами некотором росте показателей вторичной ЛУ.
Лекарственная устойчивость является одной из основных причин снижения эффективности лечения при туберкулезе, а также фактором, значительно уменьшающим продолжительность жизни пациентов. Результаты текущего исследования указывают на то, что в Самарской области шансы на благоприятный исход лечения у больных с МЛУ ТБ в 3,5, а у больных с ШЛУ ТБ - почти в 5 раз ниже, чему у пациентов с ЛЧ ТБ. Выживаемость в исследованной популяции больных также сильно зависела от спектра ЛУ штамма, которым инфицирован пациент. Наличие множественной лекарственной устойчивости микобактерий, особенно в сочетании с ВИЧ-инфекций, достоверно снижало продолжительность жизни.
Наблюдаемые тенденции подчеркивают тот факт, что на сегодняшний день, помимо эффективного лечения лекарственно чувствительного ТБ, одной из главных составляющих на пути к успешному контролю данного заболевания является активизация усилий, направленных на борьбу с мультирезистентным туберкулезом, том числе совершенствование мер инфекционного контроля, повышение скорости и качества лабораторной диагностики, подразумевающее раннее выявление лекарственной устойчивости и регулярное отслеживание эффективности проводимой терапии.
В рамках текущей работы нами проведена апробация новых молекулярно-генетических экспресс-методов, позволяющих идентифицировать микобактерии в диагностическом материале, а также определить их чувствительность к основным противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда. Были показаны высокие показатели чувствительности и специфичность тест-системы GenoType MTBDRplus (Hain, Lifecsience) для выявления МЛУ ТБ, которые составили 95,4% и 81,2% соответственно. Тест-система GenoType MTBDRs/ продемонстрировала несколько более низкие диагностические параметры, что, вероятнее всего, связано с генетическими особенностями штаммов, циркулирующих в Самарской области, а именно широким распространением мутаций в гене eis, которые определяют устойчивость отдельно к канамицину и не детектитруются с помощью использованной методики. Тем не менее, более высокая чувствительность теста для определения ЛУ к фторхинолонам, амикацину и капреомицину, а также высокая его специфичность для всех анализируемых ПТП делает его весьма полезным в качестве скринингового метода для быстрого обнаружения спектра ЛУ к резервным препаратам, и особенно широкой лекарственной устойчивости.
Однако следует иметь в виду, что данные тест-системы предназначены для обнаружения наиболее клинически значимых мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью у М. tuberculosis. В некоторых случаях резистентность детерминирована другими мутациями; кроме того в образцах биоматериала может присутствовать смешанная популяция, представленная как чувствительными, так и устойчивыми микобактериями. Именно поэтому оптимальным является параллельное использование молекулярно-генетических и классических фенотипических методов в диагностике ТБ.
Чрезвычайно важен и постоянный контроль эффективности проводимого лечения. Культуральные исследования, несмотря на свою точность и надежность, занимают значительное время, что создает сложности для своевременного выявления пациентов, не отвечающих на терапию, а также при подозрении на формирование ЛУ возбудителя. В рамках работы был апробирован альтернативный способ определения жизнеспособности клеток микобактерии с помощью моноазида пропидия. Показатели чувствительности и специфичности метода варьировали в зависимости от срока сбора материала; на более поздних этапах лечения (начиная со 2-го месяца) тест продемонстрировал высокие показатели прогностической ценности отрицательного результата, что делает его полезным для исключения возможной реверсии культуры у больного. Дальнейшая оптимизация метода путем подбора более точного способа детекции результатов может повысить диагностические показатели теста и способствовать его активному использованию в качестве скринингового метода для отслеживания эффективности лечения пациентов.
На основании проведенных нами исследований по распространенности антибиотикорезистентности микобактерий и ее выявления ускоренными молекулярно-генетическими методами, нами был разработан алгоритм лабораторных исследований, позволяющий оптимизировать процесс диагностики ТБ и лекарственной устойчивости с учетом имеющегося опыта, доступного оборудования и средств, а также современных рекомендаций. В рамках данного алгоритма предполагается дифференцированный подход к различным группам пациентов (впервые выявленные, получавшие лечение в прошлом, хронические пациенты) и образцов (диагностические, собранные в целях контроля лечения), что позволяет наиболее рационально и эффективно использовать ресурсы лаборатории, особенно в условиях высокой нагрузки. Примененеие молекулярно-генетических методов диагностики обеспечивает своевременное назначение адекватного режима химиотерапии, разделение потоков больных, что, в свою очередь, является очень важным для повышения эффективности лечения и ограничения трансмиссии ЛУ штаммов. Разработанный алгоритм внедрен в рутинную практику бактериологической лаборатории ГБУЗ «Самарский областной противотуберкулезный диспансер».