Введение к работе
Актуальность проблемы. Бруцеллез - ипфекционво-аллергичесхое зяболева-ие человека и животных, характеризующееся тяжелым, часто хроническим те-еиием я возможностью эпидемического распространения. Бруцеллез является двои из основных причин заболеваемости в смертности сельскохозяйственши гивотных в работающих с ними людей в представляет собой серьезную угрозу порояью человека. В системе мероприятий по борьбе с бруцеллезом важное место знимяет идентификация и индикация бруцелл, которые затрудняются не только гирокой изменчивостью рода Brucella, явлением миграции возбудителя на нети-ичвых хозяев, по также несовершенством применяемых диагностических методов.
В настоящее время для идентификация и индикации бруцелл применяют бах-їриологическиЯ и иммунологический методы исследования. Бактериологический етод из-за длительного срока получения ответе (1 месяц) не удовлетворяет тре-ованиям, предъявляемым * методам вндахапнл. Иммунологические методы в боль-mmrrse случаев в хаяестве диагяостккумов используют антигены, в состав которых кодят лилополнсахарид (ЛПО, дающий перекрестные серологические реакции ГССР) с антителами таких видов бактерий как Yersinia enterocolitlca 0:9, Franaizella darenzls, Escherichia coli 0:137, Salmonella typhlmurium is др., что не позволяет мать однозначных заключений в требует дополнительных лабораторных тестов, взработка быстрых я эффективных мггодов идентификации представляет собой стуальную проблему, решению которой может способствовать полл-чение специ-ичеосого ДНК-зонда. Известно, что использование ДНК-зондов обеспечивает вы-исую чувствительность в специфичность идентификация возбудителя, что делает с применение предпочтительным для оценки эпидемической ситуации по срзв-їнню с другими методами. Специфичность зонда определяется уникальной дія ютветствуюш'го возбудителя нуклеотидяой последовательностью, испапьэуемой зн его конструирования. В связи с этим поиск такой последовательности целесо-5разло вести среда генов, определяющих синтез специфических антигенов или акторов патогенности. Для бруцелл такие факторы не охарактеризованы, хотя гоилровакы некоторые гены бруцелл и изучены контролируемые ими белковые ггвтены. В этой связи конструирование и апробация новых генетичесхих зондов целью ндемгифнкадага и равней индикация бруцелл в продуктах питания, объ-тах внешней среды др. весьма актуальна.
Цель в задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в кояструи-іваиия ДНК-зонда я отработке оптимальных условий его применения для аден-фнхация бруцелл. Для достижения этой цели были поставлены следующее дачи:
-
Создаж.е байка геиов Brucella meliteiuh 363 в клетках Escherichia coli К)2.
-
Анализ банка геыои; понсї клоноа эхепрессируювшх родоспецифичесхив бслха бруцелл.
-
Выбор специфической последовательности клонированной ДНК в ьзчестве зонда.
-
Отработка методов гибридизации in situ клеток бруцелл со сконструированным нерадноактишга меченным ДНК-зондом; оптимизация условии дла получение специфического положительного ешкала гибридизации.
-
Разработка метода идентификации бруцелл при помощи полиыераэноа цепной реакции (ПЦР).
-
Апробация комплексного метода идентификации бруцелл (ПЦР плюс гибридизация) в смешанных культурах.
Научная новизна. Впервые клонирована последовательяоеть геиа белка наружной мембраны бруцелл с молекулярной массой (м.м.) 38 кшюдальтон (кД). Показано, что ока родосіїещіфична для бактерий рода Brucella и может быть использована в качестве нерадвактгшного ДНК-зокда для идентификашш этик бактерий. Последовательность клонироииного геиа бруцелл использована дла конструирования и апробации праймеров в ПЦР. Показана высокая эффективность использования указанного метода доя выявления бруцелл в смешанных культурах.
Научно-практическая значимость. Проведенное исследование позволило разработать и предложить к использованию ДНК-зонд для идентификации бруцелл. Предлагаемый метод сочетает в себе пеналы озание ПЦР и ДНК-зондирование и является основой для разработки тест-систем для индикации возбудителя в изолятше внешней среды, продуктах жизнедеятельности человека и животных в т.д.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всесоюзной микробиологической конференции, посвященной актуальным вопросам борьбы с бруцеллезом (Новосибирск 14R0 г.>. на Всесоюзной конференции "Бактериальные плазмиды" (Нальчнх 1990 т.), на 1 Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии* (Самарканд 1991 г.) н на научной конференции отдела генетики и молекулярной биологии (13 мая 1993 г).
Публикация. По теме диссертации опу5/.тг,:овано 3 работы, 5 тезисов в отечественной и зарубежной печати и получено 2 авторских свидетельства.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание методов исследования, результатов и их обсуждения, вьшодов и списка цитируемой литературы. Текст