Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Воздействие нефти и нефтепродуктов на свойства почвы и живые организмы
1.1.1. Изменение основных свойств почвы при ее загрязнении нефтью и ее
производными 13
1.1.2. Действие углеводородов нефти на почвенную микробиоту 17
1.1.3. Изменение ферментативной активности почвы в результате попадания в нее нефти 20
1.1.4. Влияние нефтезагрязнения на растения, животных и человека
1.2. Естественная биодеградация нефти в почве 27
1.3. Микроорганизмы-деструкторы нефтяных углеводородов 32
1.4. Методы биоремедиации территорий, загрязненных нефтью и нефтепродуктами 34
1.4.1. Стимуляция аборигенной микрофлоры.. 36
1.4.2. Интродукция углеводородокисляющих микроорганизмов.. 40
1.4.3. Биопрепараты для очистки нефтезагрязненных почв 41
1.5. Приемы стимуляции биодеградации нефти 49
1.5.1. Применение диазотрофных микроорганизмов 49
1.5.2. Образование биосурфактантов углеводородокисляющими микроорганизмами 53
1.6. Современные методы идентификации микроорганизмов 61
1.6.1. Секвенирование и филогенетический анализ 61
1.6.2. Анализ содержания жирных кислот в клеточной стенке микроорганизмов 67
1.6.3. МАЛДИ-масс-спектрометрия клеточных белков микроорганизмов 69
2. Объекты и методы исследования 73
2.1. Объекты исследований 73
2.2. Среды для культивирования микроорганизмов 73
2.3. Скрининг микроорганизмов-нефтедеструкторов 74
2.4. Изучение культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств выделенных культур 75
2.5. Идентификация штаммов микроорганизмов молекулярно-генетическими методами
2.5.1. Выделение ДНК 75
2.5.2. Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК 75
2.5.3. Определение нуклеотидной последовательности гена, кодирующего субъединицу ДНК-гиразы 76
2.5.4. Построение дендрограмм филогенетического сходства изучаемых штаммов микроорганизмов 78
2.6. Определение видовой принадлежности микроорганизмов консорциума масс спектрометрическими методами 78
2.6.1. Определение качественного и количественного состава жирных кислот клеточных стенок микроорганизмов консорциума 78
2.6.2. МАЛДИ-ВП-масс-спектрометрия клеточных белков штаммов, входящих в состав консорциума
2.7. Исследование окислительной активности консорциума и входящих в него микроорганизмов 80
2.8. Выявление нитрогеназной активности штамма Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2 80
2.9. Исследование поверхностно-активных свойств штамма Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 2.9.1. Поверхностное натяжение 82
2.9.2. Индекс эмульгирования 82
2.10. Выявление фитотоксичности консорциума и входящих в него штаммов 83
2.11. Определение эффективности процесса биодеструкции нефти в полевых экспериментах 83
2.11.1. Измерение массовой концентрации нефтепродуктов в почве 84
2.11.2. Определение численности основных групп микроорганизмов 84
2.12. Определение фитотоксичности отбеливающей глины 84
2.13. Полевой эксперимент по биорекультивации нефтезагрязненной
отбеливающей глины 85
2.14. Статистическая обработка результатов 86
3. Результаты и их обсуждение 87
3.1. Таксономические исследования микроорганизмов, составляющих консорциум
3.1.1. Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства
микроорганизмов консорциума 87
3.1.2. Нуклеотидные последовательности гена 16S pPHK и филогенетическое положение штаммов Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 и Оchrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2 92
3.1.3. Нуклеотидные последовательности гена gyrB и филогенетические древа штаммов Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 и Оchrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2 97
3.1.4. Профиль жирных кислот клеточных стенок микроорганизмов, составляющих консорциум 100
3.1.5. МАЛДИ-ВП-масс-спектрометрия клеточных белков 109
3.2. Свойства микроорганизмов, позволяющие использовать образуемый ими консорциум в экологической биотехнологии (в очистке почвы от нефтезагрязнения) 112
3.2.1. Окислительная активность консорциума и входящих в него микроорганизмов 112
3.2.2. Нитрогеназная активность штамма Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2
114
3.2.3. Потенциальная нитрогеназная активность почвы, инокулированной микроорганизмами Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2 117
3.2.4. Поверхностно-активные свойства штамма Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 119
3.2.4.1. Поверхностное натяжение 119
3.2.4.2. Индекс эмульгирования 119
3.2.5. Фитотоксичность штаммов Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 и Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2 120
3.3. Полевые испытания биотехнологии рекультивации отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты, с помощью консорциума микроорганизмов 123
3.3.1. Динамика содержания остаточных нефтепродуктов в отработанной отбеливающей глине в ходе эксперимента 124
3.3.2. Динамика численности основных групп микроорганизмов, участвующих в биотрансформации нефтепродуктов 127
3.3.3. Влияние интродукции микроорганизмов на фитотоксичность отработанной отбеливающей глины 132
3.3.4 Производство опытных партий биопрепарата «Ленойл», СХП 134
Заключение 141
Выводы 143
Список использованной литературы
- Методы биоремедиации территорий, загрязненных нефтью и нефтепродуктами
- Изучение культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств выделенных культур
- Нуклеотидные последовательности гена gyrB и филогенетические древа штаммов Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 и Оchrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2
- Динамика содержания остаточных нефтепродуктов в отработанной отбеливающей глине в ходе эксперимента
Введение к работе
Актуальность проблемы. Загрязнение окружающей среды углеводородами – острейшая проблема во многих регионах России и во всем мире. Помимо нарушения естественной природной обстановки в ходе разведки, добычи, транспортировки и хранения «черного золота», в процессе переработки нефти и газа накапливается большое количество нефтесодержащих отходов, хранение которых также приводит к деградации экосистем. К таковым относится отработанная отбеливающая глина, используемая в качестве тонкодисперсного природного адсорбента в процессе контактной доочистки масел. Она насыщена полициклическими ароматическими углеводородами и смолистыми соединениями, устойчивыми к химическому разложению. Процесс самоочищения таких субстратов идет крайне медленно и лимитируется высокой концентрацией поллютантов, недостатком биогенных элементов и низкой микробиологической активностью. Отвалы нефтезагрязненной отбеливающей глины занимают обширные территории, уродуют ландшафт и могут служить источником вторичного загрязнения почв, поверхностных и подземных вод, воздуха. Так, например, на полигоне промышленных отходов ОАО «Орскнефтеоргсинтез» (Оренбургская область) накоплено свыше 100 тысяч тонн загрязненной углеводородами отбеливающей глины. Наиболее перспективным, экологически чистым и экономически выгодным способом очистки нефтезагрязненных территорий является применение биологических технологий, основанных на использовании активных культур углеводородокисляющих микроорганизмов (Ghazali et al., 2004; Назарько, 2004; Joo et all, 2008; Тимергазина, 2012). В настоящее время известно довольно большое количество биопрепаратов-нефтедеструкторов, содержащих отдельные штаммы микроорганизмов или их ассоциации (Кураков, 2006; Кабиров, 2009; Рогозина и др., 2010; Леонов, 2015). Последние позволяют полнее осуществить рекультивацию за счет более
4 широких адаптационных и экологических возможностей. Однако природные условия очищаемых территорий и химический состав нефти и нефтепродуктов различны, поэтому работы созданию новых биопрепаратов-нефтедеструкторов на основе консорциумов микроорганизмов остаются актуальными. Реализация этого подхода требует не только выделения новых бактерий с нефтеокисляющей активностью, но и изучения свойств, детальной характеристики, идентификации микроорганизмов и четкой дифференциации штаммов (Whyte, 2002; Клюянова, 2009; Самкова и др., 2012).
Цель исследования. Идентификация микроорганизмов, образующих нефтеокисляющий консорциум, изучение их свойств и разработка на основе консорциума биопрепарата для очистки загрязненных углеводородами отходов нефтехимической промышленности.
Задачи исследования
1. Выделить из нефтезагрязненной почвы микроорганизмы, способные
к утилизации нефти и идентифицировать их согласно критериям полифазной
таксономии.
2. Изучить свойства бактерий-нефтедеструкторов, составляющих
консорциум, полезные для биорекультивации загрязненных грунтов.
3. Проверить эффективность применения консорциума
микроорганизмов для очистки от углеводородов отхода нефтехимической
промышленности в полевых условиях.
4. Разработать технологическую схему получения биопрепарата для
рекультивации загрязненных углеводородами грунтов на основе
консорциума микроорганизмов.
Научная новизна. Впервые на основании направленного скрининга выделен консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов и проведена идентификация входящих в его состав штаммов Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 и Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2 согласно критериям полифазной таксономии.
5 Впервые установлено, что консорциум Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 и Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2 обладает окислительной и азотфиксирующей активностью, тем самым способствуя деструкции углеводородов и повышению потенциальной нитрогеназной активности почвы.
Теоретическая и практическая значимость
Таксономические изыскания важны как для развития основополагающих теоретических областей науки, так и для решения ряда конкретных проблем биотехнологии, медицины, сельского хозяйства, охраны окружающей среды. Несмотря на достигнутые успехи в развитии молекулярно-генетических и хемотаксономических подходов к идентификации микроорганизмов, базы данных по нуклеотидным последовательностям генов, жирным кислотам клеточной стенки и масс-спектрам клеточных белков все еще недостаточны для установления таксономической принадлежности большинства штаммов. В данной работе изучены фенотипические и физиолого-биохимические свойства, проведено секвенирование и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и gyrB, установлено филогенетическое положение, определен состав жирных кислот клеточной стенки и получены масс-спектры белковой фракции клеток микроорганизмов Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 и Оchrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2. Полученные результаты расширяют имеющиеся базы данных, способствуя идентификации других микроорганизмов.
На основе выделенного и изученного консорциума микроорганизмов Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 и Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2 разработан полифункциональный биопрепарат для очищения и восстановления нефтезагрязненных грунтов.
Разработана технология биорекультивации нефтезагрязненных грунтов
с помощью консорциума микроорганизмов, которая была эффективно
применена в полевых условиях для обезвреживания
6 углеводородсодержащего отхода нефтехимической промышленности на полигоне ОАО «Орскнефтеоргсинтез» (Оренбургская область).
Получен патент Российской Федерации на консорциум штаммов микроорганизмов Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 и Ochrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (Патент РФ № 2553540).
Положения, выносимые на защиту
-
Выделенный в ходе скрининга природный нефтеокисляющий консорциум состоит из штаммов Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 и Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2.
-
Микроорганизмы Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 и Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2, входящие в консорциум, способны к деструкции нефтепродуктов до конечных соединений - углекислого газа и воды. Штамм Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 обладает поверхностно-активными свойствами, а штамм Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2 – способностью к фиксации атмосферного азота.
3. Внесение консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов в ходе
полевого эксперимента позволяет снизить содержание углеводородов в
отработанной отбеливающей глине, способствует повышению
микробиологической активности и уменьшению фитотоксичности субстрата.
4. Разработана технологическая схема получения опытной партии
биологического препарата «Ленойл» на основе консорциума Acinetobacter
calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 и Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Всероссийской научно-технической конференции «Инновационные технологии в области химии и биотехнологии» (22-23 ноября 2012 г., г. Уфа), V Международной заочной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы науки и техники» (22-24 ноября 2012 г., г. Уфа), Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2013», II Всероссийской научно-технической конференции
7 молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Высокие технологии в современной науке и технике» (ВТСНТ-2013) (27-29 марта 2013 г., г. Томск), IX Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (21-23 октября 2013 г., г. Москва), школе-конференции молодых ученых на базе Института фундаментальных проблем биологии РАН «Биосистема: от теории к практике» (24-25 октября 2013, г. Пущино), Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2014», Международной заочной научно-практической конференции «Современные тенденции в образовании и науке» (28 ноября 2014 г., г. Уфа), VIII Всероссийской научной интернет-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии» (24-25 ноября 2014 г., г. Уфа), IX Международной конференции аспирантов и студентов «Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов». (15-16 апреля 2015 г., г. Донецк), VIII Международной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы науки и техники – 2015» (16-18 ноября 2015 г., г. Уфа).
Публикации. По материалам диссертации опубликована 18 научных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК, рекомендованных для соискателей ученой степени кандидата биологических наук, и 1 патент РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, экспериментальной части, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 194 страницах, содержит 12 таблиц и 8 рисунков. Список литературы включает наименований 392, из них 163 на английском языке.
Методы биоремедиации территорий, загрязненных нефтью и нефтепродуктами
Негативное действие нефти на биологические свойства почв объясняется следующими причинами: обволакивание нефтяными углеводородами почвенных частиц, содержание в нефти тяжелых металлов, ароматических углеводородов, фенолов, накопление в почве таких продуктов окисления углеводородов, как гексадециловый спирт, пальмитиновая, бензойная, салициловая кислоты и др., значительное увеличение соотношения С:N (Киреева и др., 1998).
Углеводороды нефти оказывают на микроорганизмы токсическое действие, кроме того, нефтяное загрязнение влияет на них через трансформацию физико -химических свойств почвы: уменьшение доступности элементов минерального питания, ухудшение водного и воздушного режимов, изменение реакции почвенной среды и структуры почвы (Назаров, 2010).
Токсическое действие свежей нефти на почву связано, в первую очередь, с летучими ароматическими углеводородами (бензолом, толуолом, ксилолом и т.п.) нафталином и некоторыми другими водорастворимыми соединениями (Griffin, Calder, 1997), чем с полиароматическими углеводородами. ПАУ медленнее проникают через мембраны, действуют более длительное время, являясь хроническими токсикантами (Кураков и др., 2006; Колесников и др., 2006, 2007).
Особенно быстро действуют нормальные алканы с короткой углеродной цепью, содержащиеся в основном в легких фракциях. Эти углеводороды растворимы в воде и легко проникают в клетки организмов через мембраны, растворяя липиды клеток и вызывая расслоение цитоплазматической мембраны.
По мере убывания токсичности основные компоненты нефти располагаются в следующем порядке: ароматические углеводороды, циклопарафины, олефины и парафины (Кураков и др., 2006; Сваровская и др., 2007; Новоселова и др., 2014).
Авторы приходят к мнению, что циклопарафины очень устойчивы к микробной атаке, хотя активно утилизируются путем соокисления (Розанова, 1967; Trudgill, 1978; Tiehm, 1994; Kuever et al., 1998).
Микроорганизмы также не могут использовать в качестве единственного источника углерода такие углеводороды, как полиароматические (Колесникова, Плещева, 1988) и гетероциклические углеводороды (Мурзаков и др., 1992). В этом случае особую роль играет, так называемый, сопряженный метаболизм, при котором указанные соединения разрушаются лишь в присутствии легко метаболизируемых углеводородов. Превращение какого-либо вещества, которое одно не используется, а потребляется только в присутствии косубстрата, т. е. вещества, используемого клетками для роста, получило название кометаболизма или соокисления (Шлегель, 1987; Скрябин и др., 1976).
Воздействие нефти на комплекс почвенных микроорганизмов не однозначно. Нефтяное загрязнение стимулирует рост определенных видов и подавляет развитие других. Все зависит от концентрации и состава загрязнителя и биологических особенностей организмов. В целом, при слабом загрязнении может происходить стимуляция жизнедеятельности основных групп микроорганизмов, а высокие концентрации нефти угнетают их развитие. С течением времени микробиологическая активность почв восстанавливается (Иларионов, 2004; Колесников и др., 2006, Маганов, 2006; Оборонин и др., 2008; Хазиев, 2012)
В работах (Марфенина, 2005; Киреева и др., 2005) отмечена тенденция к увеличению числа фитопатогенных и фитотоксичных грибов в почвах при внесении высоких доз нефти в почвы. Накапливаются потенциально опасные для человека виды, например, Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, Aureobasidium pullulans var. pullulans, Fusarium moniliforme f. moniliforme, Penicillium miczynskii и Ulocladium consortiale (Корнейкова и др., 2011; Хабибуллина, Ибатуллина, 2011; Корнейкова и др., 2012; Evdokimova et al., 2013).
Наиболее чувствительны к нефтяному загрязнению актиномицеты, нитрификаторы (Odu, 1977; Исмаилов, 1983; Киреева, 1994; Пархоменко и др., 2006), целлюлозоразрушающие микроорганизмы (Кайгородова, 1996; Колесников и др., 2006; Касаткина, Федорова, 2007). Последние играют важную роль в поддержании стабильности экосистемы почвы, поскольку их нормальное функционирование позволяет обеспечить естественное замыкание цикла углерода. Отрицательное влияние углеводородов нефти на эти микроорганизмы связано с низким содержанием подвижных соединений азота, растительных остатков в нефтезагрязненных почвах, а также неблагоприятным водно -воздушным режимом (Киреева, 1994, 1995). Аммонифицирующие (Исмаилов, 1983; Елин, 2002; Мукашева, Шигаева, 2004; Середина и др., 2006), азотфиксирующие микроорганизмы (Исмаилов, 1983; Елин, 2002; Мукашева, Шигаева, 2004;), микромицеты (Рыбак и др., 1984; Киреева 1996; Кирсанов и др., 2010; Лабутова и др., 2010), дрожжи (Исмаилов, 1983), сульфатредуцирующие бактерии (Riviere, Gatellier, 1976; Киреева 1996), углеводородокисляющие микроорганизмы (Габбасова, 2004), наоборот, положительно реагируют на нефтяное загрязнение - возрастает их видовое разнообразие и численность (Киреева 1996).
Возникновение анаэробиоза и снижение численности нитрификаторов приводит к подавлению процессов нитрификации и усилению аммонификации, и нарушению азотного режима (Иларионов, 2004; Зильберман и др. 2004; Середина и др., 2006). Подавление процессов нитрификации начинается уже при уровне загрязнения 0,5% (Габбасова, 2004). Однако в дальнейшем (Deni, Penninckx, 1999) было показано, что нитрифицирующие бактерии хорошо адаптируются к углеводородам нефти.
В загрязненной нефтью почве увеличивается численность денитрификаторов. Их развитию в загрязненных почвах способствует избыток органической массы, слабощелочная реакция среды и микроэкологический фактор - низкий окислительно-восстановительный потенциал (Киреева, 1994).
В нефтезагрязненной более 5 лет назад почве остаются только сложные малодоступные для микробной деструкции высокомолекулярные нефтяные соединения, относящиеся, главным образом, к битумоидам. Вследствие этого происходит снижение численности гетеротрофных микроорганизмов по сравнению с предыдущим этапом деградации нефти, при этом доля в них углеводородокисляющих микроорганизмов остается повышенной (Оборонин и др., 2008).
Изучение культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств выделенных культур
Так, рамнолипид, продуцируемый Pseudomonas aeruginosa, удалил значительные количества разлитой нефти из галечного песка Аляски, загрязненного фирмой "Еxxon Valdez". Показано также, что этот биосурфактант способен удалять до 25-70% и 40-80% углеводородов из загрязненной супеси и суглинков соответсвенно (Гоготов и др., 2006).
При изучении особенностей метаболизма гексадекана у штамма Rhodococcus erythropolis ЭК-1 установили условия культивирования бактерий, обеспечивающих повышение синтеза ПАВ. Такими условиями являются: наличие в среде культивирования ионов железа (до 10 мг), необходимых для функционирования алкангидроксилазы (трехкомпонентного ферментного комплекса; одним из компонентом, входящим в комплекс является рубредоксин -железосеропротеид), повышение концентрации катионов натрия (активатор алкангидроксилазы и альдегиддегидрогеназ) и снижение содержания катионов калия (ингибиторы этих ферментов). Увеличение в 1,5-1,7 раза концентрации ПАВ при внесении в среду с н-гексадеканом 0,2% фумарата (предшественник глюконеогенеза) и 0,1% цитрата (регулятор синтеза липидов) обусловлено интенсификацией синтеза в таких условиях трегалозомикалатов, о чем свидетельствовало повышение активности в 3-5 раз фосфоенолпируватсинтазы и трегалозофосфатсинтазы соответственно (Пирог и др, 2010).
В настоящее время известны следующие группы биоПАВ: гликолипиды (рамнолипиды, трегалозолипиды, софорозолипиды), липополисахариды и полисахаридные комплексы (эмульсаны, ксантан), липопептиды (сурфактин, вискозин, лихенизин, грамицидин, полимиксин), жирные кислоты, фосфолипиды и нейтральные липиды (Rosenberg et al., 1999; Desai J., Banat I., 1997). Они условно могут быть разделены на 2 группы. К первой группе относятся низкомолекулярные соединения: гликолипиды, липопептиды, которые способны снижать поверхностное и межфазное натяжение жидкостей, но, как правило не образуют стабильных эмульсий. Во вторую группу входят высокомолекулярные ПАВ - эмульсаны (Rosenberg et al., 1998), биоэмульгаторы (Perfumo et al., 2010) -полисахариды, липопротеины, липополисахариды и их комплексы (Назина и др., 2004), которые могут образовывать стабильные эмульсии, но не могут снижать поверхностного натяжения.
Большинство представителей рода Acinetobacter синтезируют высокомолекулярные ПАВ, обладающие эмульгирующими, но не поверхностно-активными свойствами (Rosenberg et al., 1999; Toren et al., 2001; Bach et al., 2003; Walzer et al., 2006; Dams-Kozlowska et al., 2008). По химической природе эти соединения представляют собой комплексы внеклеточных полисахаридов и белков. Наиболее изученными на сегодняшний день являются эмульсан (продуцент Acinetobacter vetianus RAG-1 (Bach et al., 2003), Acinetobacter calcoaceticus BD4 (Kaplan et al., 1987)), алазан (продуцент Acinetobacter radioresistens К53 и КА53 (Navon - Venezia et al., 1995)), дисперсант (продуцент Acinetobacter calcoaceticus А2 (Rosenberg et al., 1988)).
Лишь недавно (Zhao et al., 2009) появилось сообщение о способности представителей рода Acinetobacter синтезировать и низкомолекулярные ПАВ, однако только при культивировании на гидрофобных субстратах. Селекционированный штамм Acinetobacter calcoaceticus ИМВ В-7241 синтезирует необычные по химическому составу ПАВ, представляющие собой комплекс нейтральных, амино- и гликолипидов, причем гликолипиды представлены трегалозомиколатами- метаболитами, характерными также для бактерий рода Rodococcus (Rosenberg, 1999). В результате проведенных исследований установлено, что Acinetobacter calcoaceticus К4 синтезируют ПАВ при выращивании и на гидрофильных субстратах (этанол), определены оптимальные условия (при наличие мочевины, дрожжевого автолизата и микроэлементов, соотношения С/N 60/1 и использовании 10% инокулята, выращенного на среде с этанолом до конца экспоненциальной фазы роста). Причем синтезируют низкомолекулярные липиды (свободные и ассоциированные с клетками), которые обладают не только эмульгирующими свойствами, что для них характерно, но и поверхностно-активными (Пирог, 2009).
Установили, что одновременное внесение фумарата (С4-дикарбоновая кислота, предшественник глюконеогенеза) и цитрата (регулятор синтеза липидов) (0,01-0,02%) в конце экспоненциальной фазы роста штамма Acinetobacter calcoaceticus К-4 на среде с этанолом (2% по объему) сопровождалось увеличением условной концентрации ПАВ на 45-55% по сравнению с показателями синтеза на среде без органических кислот (Пирог, 2012).
Синтез поверхностно-активных веществ возможно повысить также при культивировании Acinetobacter calcoaceticus ИМВ В-7241 на смеси энергетически неравноценных субстратов (гексадекана и глицерина). На основе теоретических расчетов энергетических потребностей для синтеза поверхностно-активных трегалозомономиколатов и биомассы на энергетически дефицитном субстрате (глицерин) установлена концентрация энергетически избыточного гексадекана, позволяющая повысить эффективность конверсии углерода используемых субстратов в ПАВ. При молярном соотношении концентраций гексадекана и глицерина 1:7 и соотношении С/N, равном, количество синтезируемых внеклеточных ПАВ повышалось в 2,6-3,5 раза по сравнению с таковым на моносубстратах. Повышение образования ПАВ Acinetobacter calcoaceticus ИМВ В-7241 на смеси гексадекана и глицерина обусловлено увеличением в 1,3-2,4 раза активности ферментов их биосинтеза, а также одновременным функционированием двух анаплеротических путей (глиоксилатного цикла и фосфоенолпируват-карбоксилазной реакции).(22)
Так при культивировании Bacillus subtilis LB5а в 40 л ферментере на отходах производства муки из маниоки количество синтезированных липопептидов через 12 ч достигало 10 г/л. Выращивание Pseudomonas sp. DSM 2874 в 2 л реакторе с дробным внесением субстрата (рапсовое масло) дало возможность повысить синтез рамнолипидов до 45 г/л.
Нуклеотидные последовательности гена gyrB и филогенетические древа штаммов Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 и Оchrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2
Таксономические изыскания важны как для развития основополагающих теоретических областей науки, так и для решения ряда конкретных проблем биотехнологии, медицины, сельского хозяйства, охраны окружающей среды. Во всех областях, где действующим фактором являются бактерии, проблема вида и способы обнаружения видовой принадлежности имеют первостепенную важность. Современная классификация прокариот базируется на полифазном подходе - интегрированном применении различной согласующейся информации о микроорганизмах фенотипического, генотипического, филогенетического, хемотаксономического и экологического характера (Gilles et al., 2001; Tindall et al., 2010).
Из загрязненной дизельным топливом серой лесной почвы выделено 48 изолятов микроорганизмов. На основе таких показателей как динамика численности и разложение углеводородов при росте в жидкой среде с нефтью был выбран наиболее активный изолят ИБ ДТ-5.
Изолят ИБ-5 представлял собой консорциум из двух штаммов, которые по совокупности культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств были идентифицированы как представители рр. Acinetobacter и Оchrobactrum. Характеристика штамма Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1. Культурально-морфологические признаки. Клетки - неподвижные толстые, короткие палочки, часто встречаются кокковидные одиночные или сдвоенные формы, иногда в скоплениях, размеры 0,7-1,50,7-1,0 мкм (рис. 1). Размножаются делением (перетяжка и перегородка). На плотных питательных средах колонии белые, круглые, плоские, гладкие, блестящие, с ровными краями, профиль равномерно возвышающийся, диаметр 2,0-2,5 мм. А) Физиолого-биохимические свойства. Грамотрицательные, аэробные, каталазоположительные, оксидазоотрицательные, неспорообразующие бактерии. Не подвергают гидролизу казеин, крахмал, желатину. Не образуют сероводорода, индола и 3-кетолактозы при окислении лактозы. Потребляют цитрат и малонат. Образуют кислоту из углеводов, при этом выделение газа не обнаружено. Разлагают мочевину и твин 20. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Способны переносить концентрацию NaCl не более 3% и рН среды в пределах 4,6-8,6. Максимальный рост наблюдается при рН 6,8-7,2. Растет при 10-42оС, оптимум температуры – 26-28оС. Непатогенен.
Клетки штамма Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 (сканирующая зондовая микроскопия). А) – одиночная клетка, Б) – скопления клеток. Обладают устойчивостью к левомицетину, тетрациклину, фузидину, ванкомицину, ампициллину, бензилпенициллину. Чувствительны к ципрофлоксацину, стрептомицину, канамицину, неомицину. В качестве единственного источника углерода и энергии используют углеводы (сахарозу, D-фруктозу, D-маннозу, D-глюкозу, D-лактозу, L-рамнозу, D-рафинозу, D-галактозу, D-мальтозу, D-ксилозу и L-арабинозу), спирты (сорбит, маннит, глицерин), аминокислоты (D-аланин, D-фенилаланин, DL-серин, DL-метионин, D-тирозин, DL-триптофан, D-валин, D-лейцин).
Утилизируют разнообразные органические вещества: нефть, углеводороды алканового ряда (декан, ундекан, тридекан), циклогексан, хлорпроизводные углеводородов (изобутил хлористый, этиловый эфир трихлоруксусной кислоты), ароматические соединения (бензол, толуол, о-ксилол), спирты (диэтиленгликоль, изопропиловый спирт, глицерин), кислоты (масляная, изовалериановая, капроновая). Штамм Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов по Будапештскому договору (VKM B-2753D).
Характеристика штамма Оchrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2. Культурально-морфологические признаки. Клетки - короткие палочки, по мере старения укорачивающиеся до кокков, одиночные либо в скоплениях, окруженные слизью, 1,2-1,30,5 мкм. Подвижные, имеют 1-3 жгутика (рис. 2). На плотных питательных средах колонии бесцветные, круглые, плоские, гладкие, матовые, с ровными краями. А) Физиолого-биохимические свойства. Грамотрицательные, аэробные, каталазоположительные, оксидазоотрицательные, неспорообразующие бактерии. Не подвергают гидролизу казеин, крахмал, желатин. Не образуют сероводорода, индола и 3-кетолактозы при окислении лактозы. Потребляют цитрат и малонат. Образуют кислоту из углеводов, при этом выделяется газ. Разлагают мочевину и твин 20. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Способны переносить концентрацию NaCl не более 2,5% и рН среды в пределах 4,3-8,6. Максимальный рост наблюдается при рН 5,8-7,8. Растет при 10-42оС, оптимум температуры – 26-28оС. Непатогенен.
Обладают устойчивостью к левомицетину, тетрациклину, фузидину, стрептомицину, ванкомицину, канамицину, ампициллину, бензилпенициллину. Чувствительны к ципрофлоксацину.
В качестве единственного источника углерода и энергии используют углеводы (сахарозу, D-фруктозу, D-маннозу, D-глюкозу, D-лактозу, L-рамнозу, D-рафинозу, D-галактозу, D-мальтозу, D-ксилозу и L-арабинозу), спирты (сорбит, маннит, глицерин), аминокислоты (D-аланин, D-фенилаланин, DL-серин, DL-метионин). Не развиваются на D-тирозине, DL-триптофане, D-валине.
Утилизируют разнообразные органические вещества: нефть, углеводороды алканового ряда (декан, ундекан, тридекан), циклогексан, хлорпроизводные углеводородов (пентахлорэтан, дихлорэтилен, изобутил хлористый, этиловый эфир трихлоруксусной кислоты), ароматические соединения (бензол, толуол, о-ксилол), спирты (диэтиленгликоль, изопропиловый спирт, глицерин), кислоты (масляная, изовалериановая, капроновая).
Динамика содержания остаточных нефтепродуктов в отработанной отбеливающей глине в ходе эксперимента
На основании результатов изучения культурально-морфологических, физиолого-биохимических свойств, сравнительного анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, исследования качественного и количественного состава жирных кислот клеточной стенки и МАЛДИ-масс-спектра белков клетки достоверно идентифицирован род и с высокой степенью вероятности установлена видовая принадлежность микроорганизмов, составляющих консорциум. Штаммы Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 и Оchrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2 депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов по Будапештскому договору (VKM B-2753D и VKM B-2754D соответственно), а их нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК помещены в GenBank под номерами KJ461687 и KJ683734 соответственно). Показано, что и консорциум, и образующие его бактерии обладают значительной окислительной активностью в отношении широкого круга углеводородов, нефти и нефтепродуктов, причем величина этого показателя выше у консорциума. Обнаружена способность штамма Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2 к фиксации атмосферного азота и увеличению потенциальной нитрогеназной активности почвы. Доказано наличие у штамма Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 способности к продуцированию внеклеточных ПАВ, эмульгирующих гидрофобные углеводородные субстраты. На основании полученных экспериментальных данных, доказывающих отсутствие фитотоксических свойств исследуемых бактериальных штаммов Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 и Ochrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2, можно сделать вывод о возможности применения как штаммов по отдельности, так и консорциума в экологической биотехнологии при разработке новых биопрепаратов-нефтедеструкторов.
Одним из высокотоксичных загрязнителей окружающей среды является отработанная отбеливающая глина (код отхода по ФККО 30822101333), используемая в качестве тонкодисперсного природного адсорбента в процессе контактной доочистки масел. На полигоне промышленных отходов Орского нефтеперерабатывающего завода (ОАО «Орскнефтеоргсинтез») (Оренбургская область) накоплено свыше 100 тысяч тонн загрязненной углеводородами отбеливающей глины (Логинов и др., 2009). Наиболее перспективным, экологически чистым и экономически выгодным способом очистки нефтезагрязненных объектов является применение биологических технологий, основанных на использовании активных культур углеводородокисляющих микроорганизмов. Внесение дополнительных объемов биомассы обеспечивает пополнение экосистемы ферментами микроорганизмов, которые были ингибированы в процессе нефтезагрязнения, а также в целом увеличивает биологическую активность субстрата.
Для эксперимента на территории свалки промышленных отходов ОАО «Орскнефтеоргсинтез» были выбраны два относительно ровных по рельефу и относительно однородных по содержанию загрязнителя участка с отвалами отработанной отбеливающей глины, одинаковые по площади и разбитые на 15 делянок каждый (по три повторности на каждый вариант опыта). Среднее содержание нефтепродуктов (по массе) на первом участке составляло 7,12%, на втором – 22,76%. Каждую делянку несколько раз обрабатывали суспензией микроорганизмов с титром 108 КОЕ/мл в количестве 1 л/м2. Продолжительность полевого опыта - с июня 2013 г. по июль 2014 г. Для оценки эффективности применения консорциума и отдельных штаммов контролировали содержание остаточных нефтепродуктов и численность основных групп микроорганизмов, участвующих в биотрансформации. Перед началом эксперимента на обоих участках титр гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов составлял менее 104 КОЕ/г, а азотфиксирующих микроорганизмов – менее 103 КОЕ/г.
Результаты определения содержания остаточных углеводородов в отработанной отбеливающей глине в ходе эксперимента представлены на рисунке 7.
На первом участке самое резкое падение содержания нефтепродуктов (с 7,12% до 4,03-5,03%) наблюдалось через две недели после первого внесения суспензий микроорганизмов во всех вариантах опыта что, скорее всего, объясняется быстрой адаптацией микробных деструкторов к данному субстрату (рис.7А). В последующие месяцы процесс очистки замедлился. Возможно, это связано с исчезновением легкоразлагаемых парафиновых соединений и преобладанием к концу инкубационного периода в составе загрязнителя тяжелых ароматических фракций, труднодоступных для бактерий.
На втором участке штамм Оchrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2 и консорциум Acinetobacter calcoaceticus ИБ ДТ-5.1/1 и Оchrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2 (далее консорциум) также способствовали быстрому снижению содержания поллютантов в отбеливающей глине в первые две недели эксперимента – с 22,76% до 16,63% (Оchrobactrum intermedium ИБ ДТ-5.3/2) и 18,33% (консорциум) (рис.7Б). Далее процесс биодеструкции нефтепродуктов шел более медленно, но по-прежнему результативно.