Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Эколого-физиологическая характеристика бактерий рода Rhodococcu ... 11
1.1. Распространение в природе И
1.2. Приуроченность отдельных видов родококков к определенным условиям существования и пищевым субстратам.. : 13
Глава 2. Адаптивные механизмы защиты как способ выживания родококков in SITU 17
2.1. Механизмы адаптации родококков к различным экологическим условиям 17
2.1.1. Клеточная стенка 17
2.1.2. Синтез протекторных и запасных соединений 21
2.1.3. Плеоморфизм. Цикл развития 26
2.1.4. Олиго-и диауксотрофность 27
2.1.5. Естественная колониально-морфологическая изменчивость 29
2.1.6. Адгезия и колонизация поверхности 31
2.2. Экологическая стратегия 32
Глава 3. Консервация и длительное хранение бактериальных культур EXSITU 36
3.1. Современные представления об анабиозе микроорганизмов 36
3.2. Общая характеристика и особенности приемов хранения коллекционных культур 40
3.3. Практический опыт хранения родококков в мировых и отечественных коллекциях чистых культур 49
Экспериментальная часть
Глава 4. Материалы и методы исследования 54
4.1. Рабочая коллекция 54
4.2. Условия культивирования 54
4.3. Консервация чистых культур 57
4.4. Контроль чистоты и жизнеспособности 61
4.5. Проверка сохранения исходных физиолого-биохимических свойств ., 63
4.6. Определение клеточного жирно-кислотного профиля 64
4.7. Исследование интенсивности эндогенного дыхания 65
4.8. Статистическая обработка экспериментальных данных 66
Глава 5. Сравнительное исследование методов хранения, обеспечивающих выживаемость и стабильность исходных свойств Rhodococcus SPP 67
5.1. Испытание традиционных методов краткосрочного
хранения бактериальных культур 67
5.1.1. Высушивание с иммобилизацией на твердых носителях... 67
5.1.2. Применение "голодных" сред 75
5.1.3. Хранение под вазелиновым маслом
5.2. Низкотемпературное замораживание 84
5.3. Лиофилизация как основной метод длительного поддержания коллекционного фонда чистых культур
5.3.1. Влияние условий лиофилизации и последующего хранения на жизнеспособность. Перспективы долгосрочной консервации.. 89
5.3.2. Изучение стабильности исходных свойств лиофилизированных культур 97
Глава 6. Поиск специфических условий консервации алканотрофныхродококков
6.1. Влияние среды предварительного культивирования на устойчивость родококков к естественному высушиванию ЮЗ
6.2. Криоконсервация алканотрофных родококков 105
6.3. Сравнительное изучение выживаемости лиофилизированных родококков в зависимости от условий предварительного выращивания П0
6.4. Обобщение информации о методах консервации и
хранения коллекционных культур 124
Обсуждение 127
Выводы 138
Литература
- Олиго-и диауксотрофность
- Общая характеристика и особенности приемов хранения коллекционных культур
- Условия культивирования
- Применение "голодных" сред
Введение к работе
Актуальность проблемы. В условиях прогрессирующего процесса разрушешія биологического разнообразия одним из наиболее эффективных способов охраны микробиолоппеских ресурсов является их поддержание в современных коллекциях. Созданная в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН коллекция бактерий рода Rhodococcus специализируется на изучении и сохранении чистых культур, обладающих свойствами прикладного назначения.
Перспектива пракпгческого использования алканотрофных родокок-ков в различных областях биотехнологии и охраны окружающей среды - от биоиндикации углеводородных залежей до интенсификации процессов биодеградаціїи нефтяных загрязнений, синтеза кормового белка на природном газе до биокатализа в тонком оргашгческом синтезе - требует надежных методов гарантированного хранения культур без потери их исходных свойств.
В литературе описаны различные способы консервации большого разнообразия физиологических групп микроорганизмов (Сидякина, 1990; Heckly, 1978; Kirsop, 1991). В последнее время предлагается много новых методов (Доронина и др., 1992; Фельдман, Маханева, 1994; Henry, Kirsop. 1989; Malik, 1990, 1996; Gherna, 1994), однако ни один из них не является универсальным. Наиболее оправдано, по-видимому, применение глубокого замораживания и высушивания. Помимо оптимального режима самого процесса консервации необходим ряд дополнительных условий, как то: наличие протектора, оптимальная концентрация исходной суспензии, соответствующий регидратант, благоприятная среда восстановления. Следует учитывать и то, что разные виды и даже штаммы обладают специфическими реакциями на высушивание - репщратацию. Все это диктует необходимость индивидуального подбора наиболее эффективных условий хранения для каждой конкретной систематической группы организмов.
Следует отметить, что на хранение, как правило, закладываю і ся микроорганизмы, предварительно выращенные на богатых питательных средах. Использование таких сред для родококков, осуществляющих синтез на основе углеводородных субстратов, представляется не совсем корректным. Так, известно, что культивирование на сложных питательных средах приводит к снижению содержания клеточных липидных компонентов, облегчающих потребление гидрофобного углеводородного субстрата (Мпль-ко, Егоров, 1991; Коронелли и др., 1993, 1994), повышению антибнотшео-чувствительности (Ившина и др., 1990), а, следовательно, к снижению конкурентноспособности, уменьшению биохимической активности организмов в отношении ряда ксенобиотиков (Ротмистров и др., 1990).
Цель настоящей работы - разработка оптимальных методов сохранения жизнеспособности и стабилизации потенциально биотехнологически ценных свойств Rhodococcus spp. с учетом биологических особенностей их
клеток. Формирование дублирующей коллекции культур родококков и автоматизированной базы данных по методам их хранения. Конкретные задачи исследования:
1. Испытание традиционных методов консервации микроорганизмов
с целью подбора эффективных способов сохранения чистых культур Rho-
dococcus spp.
-
Изучение влияния условий предварительного культивирования клеток родококков на их жизнеспособность и биохимическую активность при хранении различными способами.
-
Разработка новых методов и рекомендаций по консервации и последующему хранению коллекционных культур родококков с учетом их структурных и физиолого-биохимических особенностей.
-
Оценка рациональной продолжительности хранения Rhodocoecvs spp.
-
Формирование автоматизированной базы данных по методам консервации и условиям хранения штаммов, поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ.
Научная новизна работы. Апробирован широкий спектр методов для сохранения чистых культур Rhodococcus spp. Показано, что наиболее оптимальный и надежный метод долгосрочной консервации родококков -лиофилизация.
Впервые исследована зависимость жизнеспособности сохраняемых клеток родококков от источника углеродного питания в среде их предварительного культивирования. Установлено, что клетки с углеводородным питанием более устойчивы к действию неблагоприятных внешних факторов - замораживанию и высушиванию. Показано влияние уровня десатура-ции клеточных жирных кислот на жизнеспособность и длительность хранения лиофилизированных клеток алканотрофных родококков.
Практическое значение. Подобраны оптимальные методы консервации культур Rhodococcus spp., гарантирующие сохранение их жизнеспособности и исходных свойств. Предложен новый способ высушивания клеток на мембранных фильтрах. К практическому использованию для длительного хранения родококков рекомендован метод лиофилизации. Создана дублирующая коллекция сублимированных чистых культур Rhodococcus spp., Gordona spp., Dietzia spp. Рекомендовано поддержание штаммов-деструкторов и продуцентов практически ценных веществ по оптимизированным схемам хранения. На основе пакета «рограммы СУБД Paradox (версия 4.5.) сформирована компьютеризированная база данных по методам консервации и хранения штаммов родококков в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Гарантированное сохранение чистых культур бактерий рода Rhodococcus можно осуществлять в лабораторных условиях с использованием широкого спектра краткосрочных и долгосрочных методов.
-
Клетки родококков с предварительно индуцированным алкано-трофным метаболизмом более устойчивы к действию неблагоприятных внешшгх факторов - замораживанию и высушиванию.
-
Наиболее надежный способ сохранения исходных свойств Rhodo-coccus spp. - криоконсервация и лиофилшация клеток родококков, предварительно выращенных на н-алканах.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Международной научной конференции "Environmental Pollution (ICEP'95)", Санкт-Петербург, 1995; Международной конференции "Перспективы развития естественных наук на Западном Урале", Пермь, 1996; Международной конферешгии "Microbial Diversity: current situation, conservation strategy. and ecological aspects (ICOMID'96)", Пермь, 1996. По,теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей и 14 рисунками; состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальной части, обсуждения и выводов. Список литературы включает 228 наименований работ, в том числе 137 отечественных и 91 зарубежных авторов.
Олиго-и диауксотрофность
Большинство видов Rhodococcus выделяется из естественных и техногенных субстратов: R. erythropolis, R. rhodochrous, R. ruber, R. fascians, R. "longus", R. opacus и др. .Нестеренко и др., ,9855 Ившина и др.. ,981; ;995; Лысак, Сидоренко, 1997). Родококки являются наиболее стабильным и значительным компонентом биоценозов, если последние несут антропогенную нагрузку или природное углеводородное насыщение. Их количество тем выше, чем более загрязнена нефтью экосистема, - от полного отсутствия в чистой территории до почти 100 %-ного в сильно загрязненной (Ившина, 1982; Коронелли и др., 1994).
По результатам исследований О.А.Нестеренко с сотр. (1985) первое место по частоте встречаемости в почвах Украины принадлежит виду R. erythropolis (56 %). Представители этого вида, а также вида R. luteus (R. fascians) выделены Л.В.Лысак и Н.Н.Сидоренко (1997) из всех без исключения почвенных образцов с разными типами антропогенной нагрузки (ди-хлорфенол, углеводороды нефти, цементная пыль, костная мука), отобранных в Московской обл. Родококки доминируют в нижних слоях лесной подстилки, где идут активные процессы разложения растительного опада (Лысак и др., 1992). На столь значительное и повсеместное распространение родококков указанных видов влияет, очевидно, их способность к утилизации самого широкого спектра органических веществ. Это было подтверждено результатами исследований И.Б.Ившиной с сотр. (1995) на штаммах R. erythropolis и R. luteus (R. fascians), выделенных из разнообразных мест оби 14 тания сопредельных и географически удаленных районов бывшего Совет ского Союза.
При исследовании видового состава микроорганизмов, населяющих подземные воды и подпочвенные отложения в районе нефтеносных площадей, обнаружено численное преобладание двух видов доминантов - R. rho-dochrous и R. ruber. Они отличаются высокой биохимической активностью и широкими деструктивными возможностями. В результате многолетних исследований по изучению закономерности распространения алканотрофных родококков, ассимилирующих газообразные гомологи метана (пропан и н-бутан), в грунтовых водах и почвах нефтеносных и непродуктивных районов Пермского Предуралья, Удмуртии, Ульяновского Поволжья и Белоруссии подтверждена приуроченность данной группы к контуру нефтеносных структур (Ившина, 1982). Средний уровень численности пропан- и н-бутанокисляющих родококков достигает 10 -10 клеток/мл в нефтезагряз-ненных почвенных образцах и 10 -10 клеток/мл в подземных и поверхностных водах, что в несколько раз больше, чем гетеротрофных микроорганизмов, учитываемых высевом на мясопептонном агаре, разведенном в 10 раз (Ившина и др., 1981). Данные виды Rhodococcus служат специфическими индикаторами при поиске нефти и газа, а также используются в системе мониторинга углеводородного загрязнения и для очистки нефтезагрязненных территорий.
Вид R. coprophilus, численность которого в навозе травоядных животных составляет 10 -10 клеток/г, требует для роста веществ, образуемых анаэробными бактериями рубца жвачных - жирных кислот и тиамина. Представители R. coprophilus высеваются из субстратов и стоков, прилегающих к молочным фермам. Данный вид предлагается в качестве индикаторного на фекальное загрязнение водоемов (Al-Diwany, Cross, 1987).
Некоторые виды родококков, в отличие от свободноживущих, выделены из биологического материала: R. corallinus - из кишечйого тракта тараканов с острова Пасхи; R. rhodnii - от кровососущего клопа Rhodnius prolixus; G. (R.) bronchialis - из мокроты больных, страдающих туберкулезом легочной полости; R. equi - от животных, больных гнойным лимфаденитом и из крови больных СПИД (The Prokaryotes, 1981; Prescott, 1991).
В последнее время появляется значительное количество сообщений, описывающих инфекционные поражения, вызываемые родококками, ранее считавшимися непатогенными для человека. Так, вид G. (R.) bronchialis вызывает легочные заболевания у человека, R. equi - пневмонию, саркоидозы и остеомиелит (Goodfellow et al,, 1993; Hall, 1994). В течение последнего десятилетия считается, что вид R. equi является важным патогеном животных, вызывая бронхопневмонию, энтерит, лимфаденит, выкидыши и другие заболевания (Finnerty, 1992). Среди родококков известны и фитопатогенные формы. Бактерии вида R. fascians вызывают образование пучков у двудольных и однодольных растений, что характеризуется потерей доминирования верхушки и нарастания боковых почек. Эти бактерии эпифитны, живут на поверхности ткани хозяина, где они и продуцируют цитокинины. Штаммы R. fascians очень отличаются по степени их патогенности. Вирулентные штаммы выделяют больше цитокининов, чем слабые и не вирулентные (Sabart /., 1986).
Общая характеристика и особенности приемов хранения коллекционных культур
Так уж сложилось, что под названием широкого угнетения жизни взамен употреблявшихся ранее терминов "скрытая жизнь", "латентная жизнь", "мнимая смерть" укоренился термин "а н а б и о з", предложенный В.Прейером в 1873 году (Шмидт, 1955), хотя первоначальный смысл его заключался не в существовании в промежуточном состоянии между жизнью и смертью, а в "оживании", "воскрешении".
По мнению П.Ю.Шмидта (1955), более правильно употреблять выражение "абиотическое состояние", "абиос", как отражение нежизнедеятельного состояния организма, если понимать под "биос" не жизнь вообще, а только процесс жизни - жизнедеятельность. Кроме того, использование этого термина позволило бы более или менее четко обозначить разные состояния организмов от айабиоза до жизнедеятельности разной интенсивности.
Воспользовавшись этим предложением, А.М.Голдовский (1981, 1986) разработал классификацию состояний организмов, основным критерием которых принято наличие или отсутствие сочетания ассимиляции и диссимиляции, лежащего в основе жизнедеятельности. В связи с этим, разграничиваются состояния жизнедеятельности (гепербиоз, биоз, гипобиоз) и нежизнедеятельности (мезабиоз и анабиоз). Согласно представлениям, развиваемым в теории явления анабиоза, для сохранения потенциальной жизнеспособности при остановке жизнедеятельности организма необходимо сохранить его структуру (Голдовский, 1981). Остановка метаболических процессов сама по себе еще не означает смерти. Смерть заключается в таком нарушении структуры организма, при котором невозможно возобновить его функционирование.
Развитием современных представлений о состояниях организма применительно к микробиологическим объектам явились работы (Ураков и др., 1988; Волков, 1994), в которых отмечается соответствие "биоза" как нормальной жизнедеятельности, нормального функционального состояния -экспоненциальной фазе роста в оптимальных условиях; "гипобиоза" как пониженной функциональной активности - стационарной фазе развития; "ме-забиоза" - промежуточному состоянию, когда влажность уже недостаточна для нормального и даже сниженного функционирования и не настолько низка, чтобы прекратить процессы инактивации; и, наконец, полный "анабиоз", как отсутствие функциональной активности. В состоянии полного анабиоза биохимические процессы прекращаются, но жизнеспособность сохраняется. Жизнеспособные структуры находятся при этом в нефункциональном состоянии, но могут снова возобновить деятельность в благоприятных условиях. Полный анабиоз обычно достигается в условиях опыта/путем глубокого высушивания при умеренных температурах или охлаждения до низких температур или сочетания высушивания и охлаждения с применением вакуума и без него. В природе полный анабиоз встречается при определенном сочетании многих условий среды, например, споры бактерий в глубоких слоях почвы, обедненной кислородом или без него (Шмидт, 1955).
Однако, поскольку в атмосфере в природных условиях всегда содержится некоторое количество влаги, глубокое высыхание организмов с переходом к полному анабиозу чаще всего при высокой влажности воздуха оказывается невозможным. Большинство примеров для природных условий относится к неполному анабиозу (мезабиозу).
С учетом современных биологических представлений (Шмидт, 1955; Бекер, 1981, 1987; Голдовский 1986) анабиоз можно определить как существование организмов в состоянии временного обратимого прекращения жизнедеятельности (когда метаболизм предельно заторможен или приостановлен), из которого организм может перейти к активной жизнедеятельности при благоприятных условиях.
Известно, что в состоянии анабиоза жизнеспособные объекты приобретают особую устойчивость к внешним экстремальным факторам: относительно высоким положительным температурам, глубокому охлаждению и действию ионизирующих и неионизирующих излучений (Лозина 39
Лозинский, 1973; Голдовский, 1981, 1986; Жизнь микробов ..., 1981). В тоже время, при анабиозе могут проходить процессы, приводящие к постепенной потере жизнеспособности. При высушивании это, в первую очередь, окислительные (Stark, Herrington, 1931; Heckly, 1978) и медленно протекающие твердофазные реакции, с образованием связей между реакционноспособны-ми группами на поверхности биополимеров (Scott, 1960; Ураков и др., 1988). Для запуска окислительных процессов в сухих биопрепаратах достаточно следовых количеств кислорода (Сох, Heckly, 1973). Методом электронного парамагнитного резонанса в спектре лиофилизированных клеток при их контакте с кислородом М.Лионом в 1961 г (цит. по Ураков и др., 1988) обнаружено появление сигнала свободных радикалов, губительное действие которых обусловлено непосредственным окислением ненасыщенных связей остатков жирных кислот, сульфгидрильных и тиоэфирных групп остатков аминокислот в белках и др. (Хекли, 1979).
Как показывают многочисленные наблюдения, при переходе биологических объектов к анабиозу происходит изменение химического состава клеток и образуются вещества, препятствующие возникающим при этом неблагоприятным явлениям. Так, увеличивается содержание трегалозы в клетках грибов и дрожжей, что способствует повышению устойчивости мембран этих организмов к высушиванию (Волков и др. 1992; Феофилова, 1992), повышается содержание в эндоспорах бацилл дипиколиновоД кислоты, которой отводят роль протектора (Сидякина, 1990), синтезируются природные антиоксйданты (метилированные токоферолы), защищающие липиды от окисления (Феофилова, 1994), образуются ингибиторы, мешающие преждевременному прорастанию спор (производные бензойной или абсцизовой кислоты) (Голдовский, 1981) и т.д.
Условия культивирования
Способ хранения на дисках фильтровальной бумаги. Диски фильтровальной бумаги диаметром 0,6 см стерилизовали в сухожаровом шкафу при 160С в течение 2 чПлотную бактериальную суспензию (108-109 клеток/мл) наносили на диски, расположенные в стерильных чашках Петри, высушивали их при 30С в течение 2 сут и переносили в стерильные флаконы, закрытые пробками. Хранили при 4 С.
Способ хранения в кварцевом песке. Речной песок промывали, просеивали, насыпали по 0,5 г в стерильные пробирки и дважды стерилизовали при 120С в течение 1 ч. Песок инокулировали 0,25 - 0,5 мл бактериальной суспензии плотностью 10 -10 клеток/мл и просушивали при 30С в течение 2 сут. Хранили при 4 С.
Хранение на миллипоровых фильтрах Рост культур осуществляли путем наложения стерильного мембранного миллипорового фильтра "Сын-пор" N 8 (Хемапол, Чехословакия) либо капроновой микропористой мембраны (Р/К "Хийу Калур") на авизованную питательную среду в чашку Петри с последующим поверхностным засевом его родококками. После культивирования мембранный фильтр с хорошим газоном культуры снимали с поверхности агара и помещали в пустую стерильную чашку Петри для естественного высушивания при комнатной температуре. Кусочки сухого фильтра с адсорбированными клетками переносили в пустую стерильную пробирку под ватно-марлевой пробкой. Хранение осуществляли в темноте при температуре 4-6С. Для регидратации кусочки фильтра с сухой культурой помещали в 0,5 %-ный раствор NaCl на 1 ч, после чего бактериальную взвесь рассеивали обычным способом для получения изолированных колоний.
Данный метод защищен Рационализаторским предложением № 172 от 24 ноября 1987 г. "Метод хранения родококков в лабораторных условиях", принятым к внедрению Институтом экологии растений и животных УНЦ АН СССР (см. Приложение).
Естественное высушивание из жидкого состояния. Высушивание бактериальной культуры, предварительно выращенной на средах различного композиционного состава (МПБ; минеральная среда Rhodococcus с пропаном в воздушной фазе; минеральная среда Rhodococcus с н-гексадешном), осуществляли естественным путем, выдерживая 5 мл культуральной жидкости с плотностью 10 клеток/мл в стерильных чашках Петри, при комнатной температуре до полного высыхания.
Криоконсервация. Замораживанию подвергали родококки, предварительно выращенные на средах различного композиционного состава (МПА, минеральные среды с углеводородами) до начала стационарной фазы роста. Взвеси плотностью 107 - 1Q9 клеток/мл получали посредством снятия биомассы с авизованной поверхности питательной среды и гомогенизацией путем механического встряхивания суспензионной жидкости. Подготовленные суспензии смешивали в равных объемах с криопротектором (защитной средой) в двойной концентрации (контроль - без криопротектора), гомогенизировали и по 2-Ю мл разливали в стерильные флаконы с резиновыми пробками. В качестве криопротектора применяли глицерин (1Q об. % ). Время экспозиции с криопротектором составляло 30 мин при 20±2С. Суспензию разливали по флаконам, замораживали при температуре -20 С и хранили, периодически оттаивая и замораживая вновь или длительно сохраняя без оттаивания. Размораживание взвеси проводили при комнатной температуре.
Для изучения возможности многократного замораживания - оттаивания суспензии аликвоты по 10 мл каждого штамма в 10 %-ном глицерине и у без криопротектора замораживали при -20 С и хранили в течение 20 дней, после подвергали процедуре оттаивания при комнатной температуре в течение 10 мин и вновь замораживали. Число циклов замораживания - оттаивания достигало 10 - 20 в зависимости от жизнеспособности культур. Контрольные взвеси не размораживались до конца эксперимента. Лиофилизация. Предварительное культивирование осуществляли способом, аналогичным для всех используемых методов хранения. В работе использовали исходные взвеси бактерий различной плотности (106-10, 10 ,лл ,л1а ,Л1х 12 10, 10 - 10 , 10 клетск/мл), етобранные в начале стационарной фаз-рост1 куль1уры. Суспензии готовили путем смвва клеток с поверхнойти ко-сяков стерильной дистиллированной водой. В качестве криопротекторов при лиофилизации испытывали сахарозо-желатиновый агар (СЖА) Файбича (1и % сахарозы, и,и % желалина и ОД % агара Dirco ), суспензионную среду (Jaсda, Opecarova, 1989) с назкой ионной силой (1 % NaCl) с добавлением А Л, Л П/ 11 Л ъъъг «/ 0,014 % пирофосфата натрия, 0,0005 % йрожжевого экстракта, 15 % лакто о о/ зы, 1 % крахмала, а аакже в качестве контрольного варианта опыта - жидкую минеральную аснову среды Rhodococcus. Длв лиофилизации -,ж мл суспензии бактерии переносили в стеклянные ампуля из нейтральног0 стекла с перетяжками. йуда же добавляли 0,1 мл еащитной среды. Дегидратацию клеточной суспензии производили (ие позднее, чем чесез 1 ч после гомоге низации йактериальной культуры в лиофилизирующер среде) в Лаборатор ии пг А /тл \ ном лиофилизаторе типк ОЕ-960 (Венгрия) при остаточном давлении 0,7 А А 0,9 мм рт. ст. а предварительны0 замораживанием в жидком азоте и иосле-дующир высусиванием в течение 20 час.
Применение "голодных" сред
Анализ жизнеспособности родококков в течение первого года хранения показывает, что высокий процент гибели клеток в процессе сублимации не влечет за собой последующего быстрого вырождения бактериальной суспензии (табл. 10). Скорость гибели клеток при последующем хранении значительно замедляется по сравнению с таковой за время лиофилизации. Наиболее интенсивное отмирание клеток происходит в течение первого месяца хранения культур. Наблюдается обозначенный нами "эффект последействия лиофилизации", при котором процент выживаемости уменьшается в среднем в 10,8 раз. Полугодовое хранение приводит к последующему постепенному достоверному падению титра, однако к исходу первого года в консервированных суспензиях остается еще до 44,8 % живых клеток.
Длительный период экспериментапозволил оценить эффективность долгосрочного хранения коллекционных культур в лиофилизированном виде (табл. И). Подавляющее большинство штаммов, испытанных на выживаемость в течение 8 лет консервации, было успешно восстановлено с высокой степенью жизнеспособности, что позволяет сделать оптимистический прогноз их долгосрочного хранения без промежуточных пересевов на свежую питательную среду. В целом характер динамики жизнеспособности культур - это устойчивое достоверное снижение числа живых клеток в течение всего срока консервации. На основании экспериментальных данных рассчитаны скорости гибели клеток и рациональные сроки хранения сублимированных препаратов коллекционных штаммов Так для штаммов R ruber константа скорости отмирания лиофилизированных клеток равняется в среднем 0,24, а рациональная длительность их хранения опрелєляется в границах от 22 6 до 43 9 JTGT Лишь отдельные штаммы были утрачены ния (D {R ) maris ИЭГМ 49; R "longus" ИЭГМ 69; R opacus ИЭГМ 61) или жизнеспособности, близкий критическому (R. opacus ИЭГМ Таблица 10. Жизнеспособность лиофилизированных культур Rhodococcus spр. при хранении в течение одного года /
Примечание. «-» Нет данных. Здесь и в табл. 11 отклонение экспериментальных данных от теоретически рассчитанной кривой гибели клеток при увеличении сроков хранения. Таблица 11. Изменение жизнеспособности лиофилизированных бактерий коллекционного фонда и перспективы их длительного хранения
Интересно заметить, что наиболее высокая степень жизнеспособности отмечена у штаммов, имеющих красно-оранжевый пигмент (см. табл. 11), Среди родококков - это активные продуценты биосурфактантов - R. rho-dochrous и R. ruber, сохраняющие в процессе наблюдения значительное число живых особей. Так, через 9 лет хранения в лиофилизированном состоянии средняя численность жизнеспособных клеток, предварительно выращенных и восстановленных на МПА, составляет от 2,7x10 клеток/мл R. ruber ИЭГМ 85 до 6,0x107 клеток/мл R. габег ИЭГМ 351(см. табл. 19).
С целью изучения стабильности основных морфологических характеристик, особенностей окисления и деструктивных способностей, присущих интактным клеткам родококков, проведено контрольное определение ключевых признаков 26 штаммов Rhodococcus spp. после еи хиофилизациии
По нашим данным основные фенотипические характеристики Rhodococcus spp. (морфология колоний, клеток) не меняются в результате 5-летнего хранения родококков в лиофилизированном состоянии. Клетки исследуемых штаммов палочковидные, слабоветвящиеся или с тенденцией к истинному ветвлению. Культуры имеют трехстадийный морфогенетический цикл развития (кокк - палочка или ветвящаяся клетка - кокк). На стандартных лабораторных средах образуют колонии без воздушного мицелия с розовато-красным, оранжево-красным, палево-телесным или интенсивно желтым недиффундирующим пигментом.
В табл. 12 представлены результаты сравнительного изучения степени воздействия широкого спектра антибиотических веществ различной природы на реактивированнные коллекционные штаммы после хранения их в
Примечание. «-» Нет данных. В числителе антибиотикочувствительность интактных клеток; в знаменателе - реактивированных клеток. В скобках - число исследованных штаммов. лиофильно высушенном состоянии, проведенные исследорания подтвердили стабильность реакции на действие антибиотиков. Лишь некоторые изменения уровня чувствительности в сторону повышения резистентности отмечаются по отношению к оксациллину (R fascians, R. "longus", R. opacus), полимиксину {R. opacus) и линкомицину (R. "longus")) Однако, статистический анализ с использованием (-критерия Стьюдента показал, что различия между чувствительностью интактных и лиофилизированных клеток Rhodo-coccus spp. к широкому спектру антибиотических веществ по величине диаметра зоны подавления роста не достоверны (Р О, 05).
Выявленная ранее (Ившина и др., 1990) антибиотшюрезистентность Rhodococcus spp., связанная с окислением высших газообразных гомологов метана, фиксируется у родококков и после 5-летнего хранения в лиофилизи-рованном состоянии (табл. 13). Исследуемые R. ruber (ИЭГМ 94, ИЭГМ 324, ИЭГМ 340) проявляют характерную резистентность на минеральной среде с пропаном к линкомицину, оксациллину, олеандомицину и полимиксину. В то же время их чувствительность в отношении канамицина, ампициллина и ристомицина остается на прежнем высоком уровне.
В табл. 14 представлены результаты проверки реакции на ключевые диагностические тесты - образование кислоты из углеводЬв и усвоение натриевых солей органических кислот - у 26-ти длительно сохраняемых в лиофилизированном состоянии штаммов Rhodococcus spp. Так, все испытанные штаммы образуют кислоту из сорбита, глюкозы и фруктозы; усваивают натриевые соли лимонной, молочной, уксусной, янтарной, фумаровой, пировиноградной, пропионовой кислот. Рост и образование кислоты на ара-бинозе, галактозе, лактозе, мальтозе, сахарозе, инозите, а-метил-/)-глюкозиде а так же усвоение натриевых солей у-аминомасляной и ос-кетоглутаровой определяются характерными для интактных клеток видос-цецифическими особенностями Rhodococcus