Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Микроскопические грибы антропогенно нарушенных почв (обзор литературы) 11
1.1. Влияние антропогенных загрязнений на структуру и свойства комплексов почвенных микромицетов 11
1.1.1 .Разложение нефти микроскопическими грибами 20
1.2.Биоремедиация нефтезагрязненных почв 25
1.2.1 .Биостимуляция 26
1.2.1.1. Фитомелиорация 28
1.2.2.Использование биопрепаратов 29
1.3. Влияние биорекультивации на почвенные микроскопические грибы 32
1.4. Микроскопические грибы и экологический риск 34
Глава 2. Объекты и методы исследований 42
2.1. Природные условия 42
2.2. Условия проведения опытов 42
2.3. Методы исследований 51
2.3.1. Агрохимические показатели 51
2.3.2. Посев, выращивание и учет микроорганизмов на питательных средах 51
2.3.3. Определение длины гиф грибного мицелия методом мем бранных фильтров 52
2.3.4. Определение средней радиальной скорости роста колоний 53
2.3.5. Описание структуры комплекса почвенных микроскопических грибов 53
2.3.6. Расчет индекса сходства Серенсена-Чекановского 54
2.3.7. Характеристика видового разнообразия комплекса почвенных микромицетов 54
2.3.8. Определение фитотоксичности почвы 55
2.3.9. Определение фитотоксичности культуральной жидкости грибов 55
2.3.10. Определение литической активности микромице тов 56
2.4. Статистическая обработка экспериментальных данных 56
Глава 3. Комплексы микромицетов почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами 57
3.1. Влияние нефтяного загрязнения на численность почвенных микроскопических грибов 57
3.2. Влияние нефтяного загрязнения на видовой состав почвенных микромицетов 63
3.1.2. Влияние нефтяного загрязнения на радиальную скорость роста микромицетов 73
Глава 4. Изменения в комплексах микроскопических грибов при биорекультивации нефтезагрязненных почв 83
4.1. Влияние биопрепаратов Бациспецин и Деворойл на комплексы микромицетов нефтезагрязненных почв 83
4.1.1. Влияние биопрепаратов Бациспецин и Деворойл на численность микроскопических грибов в почвах, загрязненных нефтью 84
4.1.2.Влияние биопрепаратов Бациспецин и Деворойл на динамику численности углеводородокисляющих микроскопических грибов 89
4.1.3. Влияние биопрепаратов Бациспецин и Деворойл на видовую структуру комплексов микромицетов нефтезагрязненных почв 93
4.2. Влияние посевов люцерны на комплексы микромицетов нефтезагрязненных почв 102
4.2.1. Люцерна как фитомелиорант 102
4.2.2. Влияние посевов люцерны на численность микроскопических грибов в нефтезагрязненных почвах 105
4.2.3. Влияние посевов люцерны на видовую структуру комплексов микромицетов в нефтезагрязненных почвах 107
4.2.4. Влияние фитомелиорации нефтезагрязненной почвы с помощью посевов люцерны на радиальную скорость роста
микромицетов 117
4.3. Влияние комплексной биоремедиации на микроскопические грибы нефтезагрязненной почвы 119
4.4. Оппортунистические микромицеты нефтезагрязненных и рекультивируемых почв 129
Глава 5. Литическая активность микромицетов и фитотоксичность нефтезагрязненных почв 136
5.1. Влияние нефтяного загрязнения на фитотоксические свойства почвенных микромицетов 136
5.2. Целлюлозолитическая активность микромицетов нефтезагрязненных и рекультивируемых почв 141
5.3. Пектолитическая активность микромицетов нефтезагрязненных и рекультивируемых почв 149
Заключение 154
Выводы 158
Список литературы 160
Приложение 178
- Влияние антропогенных загрязнений на структуру и свойства комплексов почвенных микромицетов
- Характеристика видового разнообразия комплекса почвенных микромицетов
- Влияние биопрепаратов Бациспецин и Деворойл на численность микроскопических грибов в почвах, загрязненных нефтью
- Влияние нефтяного загрязнения на фитотоксические свойства почвенных микромицетов
Введение к работе
Актуальность проблемы Даже при современных достижениях в области охраны окружающей среды загрязнение почвогрунтов нефтью в процессе ее добычи, транспортировки и хранения остается не решенной проблемой. Поэтому исследование возможностей очистки от загрязнителя и оптимизации биологических процессов в нефтезагрязненных почвах является важным направлением прикладной экологии.
Основными параметрами, учитываемыми большинством исследователей при оценке степени негативного влияния нефтяного загрязнения на почву и эффективности применяемых приемов рекультивации, является содержание остаточных нефтепродуктов и общая микробиологическая активность почв. Изменение в антропогенных условиях бактериальной составляющей микробоценозов привлекает внимание большей части исследователей. Гораздо меньше работ посвящено микроскопическим грибам - обитателям нефтезагрязненных почв. Сведения о сообществах микромицетов рекультивируемых почв, как правило, ограничиваются данными о содержании грибных пропагул в почве [Н.А. Киреева, 1996, Р.К. Андресон и др., 1997, Д.Г. Сидоров и др., 1997, И.М. Габбасова и др., 1999].
Вместе с тем, почвенные микромицеты представляют собой группу микроорганизмов универсальную по своему значению для формирования плодородия почвы [В.И. Билай, 1984]. Отдельные их виды участвуют в превращениях целлюлозы, гумуса, минеральных элементов, биостимуляторов, токсинов и многих других веществ в почве. Кроме того, необходимость контроля за развитием микроскопических грибов в почвах определяется и их влиянием на высшие организмы из-за наличия среди грибов токсичных и патогенных представителей.
Использование подходов биологического мониторинга для группы почвенных грибов удобно вследствие наличия удовлетворительных и разнообразных методов определения их биомассы [Методы почвенной ...,
7 1986], более простой по сравнению с другими микроорганизмами видовой идентификации и описания видовой структуры сообществ, а также сложности жизненных циклов.
В нефтезагрязненных почвах по сравнению с чистыми природными аналогами возрастает численность грибов и их значение в обмене органического вещества [Н.А. Киреева, 2000, 2001].
По мнению многих авторов [Е.В. Лебедева, 1988, 2000, О.Е. Марфенина, 1999, А.В. Назаров, 1999, Н.А. Киреева и др., 2000, 2003] общая численность грибов-токсинообразователей в антропогенно нарушенных почвах находится в тесной зависимости от перестроек в микробоценозе, вызванных воздействием загрязнителя. В результате таких перестроек доминирующие позиции в нефтезагрязненных почвах занимают сильные токсинообразователи. Публикуемые в последние годы результаты исследований указывают на высокую вероятность распространения в антропогенно нарушенных (в первую очередь городских) почвах патогенных для растений, животных и человека видов [О.Е. Марфенина, 1999].
Значительный интерес представляет мониторинг перечисленных выше групп микроскопических грибов в нефтезагрязненных почвах после проведения рекультивационных работ. Ведь даже при значительном снижении содержания углеводородов в почве, нормализация состояния почвенной микробиоты может продолжаться еще несколько лет. Для оценки восстановления естественных процессов деструкции органического вещества целесообразно слежение за представителями разных эколого-трофических групп грибов, например, разлагающих легкодоступные органические вещества, целлюлозу и более сложные органические соединения.
Таким образом, последствия антропогенного вмешательства в деятельность грибного сообщества, происходящего в результате загрязнения почв нефтью и последующих попыток их очистки, еще требуют дальнейшего изучения.
Цель работы Изучение влияния нефти, нефтепродуктов и некоторых приемов биологической рекультивации на свойства комплексов почвенных микроскопических грибов.
В соответствии с целью исследований были поставлены следующие задачи:
Изучить структурные и количественные изменения, происходящие в комплексах микромицетов темно-серой лесной, серой лесной почвы и выщелоченного чернозема под воздействием разных доз нефти и нефтепродуктов.
Изучить влияние посевов фитомелиоранта - люцерны и биопрепаратов Деворойл, Бациспецин, Белвитамил на свойства комплексов микромицетов нефтезагрязненного выщелоченного чернозема, серой лесной и темно-серой лесной почвы.
3. Оценить динамику накопления в почве фитотоксичных,
фитопатогенных и условно патогенных для человека микромицетов после ее
загрязнения и в ходе биорекультивации.
4. Изучить литическую активность микромицетов нефтезагрязненных и
рукультивируемых почв и ее связь с токсичностью почв, вызванной
микроскопическими грибами.
Научная новизна Описан комплекс свойств (численность, видовой состав, кинетическая характеристика, литическая активность) грибных сообществ, формирующихся в нефтезагрязненных почвах и их изменение в процессе рекультивации.
Впервые представлены данные о содержании в почвах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, условно патогенных видов микроскопических грибов. Показано, что нефтяное загрязнение способствует увеличению частоты встречаемости видов данной группы в серой лесной, темно-серой лесной почве и выщелоченном черноземе. Получены данные о снижении содержания в нефтезагрязненной почве условно патогенных для человека и растений и фитотоксичных микромицетов под влиянием биопрепаратов
9 Бациспецин, Деворойл, биологической добавки Белвитамил и фитомелиорации.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Как нефтяное загрязнение, так и биорекультивационные приемы
воздействуют на численность, видовой состав, кинетические параметры
комплекса микромицетов выщелоченного чернозема, серой лесной, темно-
серой лесной почвы.
2. Нефть увеличивает долю участия грибов в разложении целлюлозы и
пектина в почве.
3. Нефть помимо прямого негативного воздействия на почвенную
экосистему способна оказывать и трансбиотическое негативное влияние
посредством накопления токсичных, фитопатогенных и оппортунистических
микромицетов.
4. Применение биопрепаратов и фитомелиорантов не только
способствуют снижению содержания остаточных нефтепродуктов в почве, но
и уменьшает негативные изменения, происходящие в комплексе почвенных
микромицетов под воздействием нефтяных углеводородов.
Практическая значимость Полученные данные могут быть использованы при диагностике биологической активности почв и мониторинге их загрязнения. Результаты экспериментов используются в БашГУ при чтении курсов "Экология микроорганизмов", "Микология", "Рекультивация техногенно-нарушенных почв".
Апробация работы Основные положения и результаты диссертационной работы представлены на на 10м интернациональном конгрессе "Petroleum Contaminated Soils, Sediments and Water. Analysis, Assessment and Remediation" (London, 2001), на 1ом Европейском микробиологическом конгрессе (Ljubljana, 2003), на XIV Европейском микологическом конгрессе (Yalta, 2003), международном симпозиуме "Современные проблемы биоиндикации и биомониторинга" (Сыктывкар, 2001), международной конференции "Биогеография почв" (Сыктывкар, 2002), научн. конф., посвященной 180-
10 летию со дня рождения заслуженного профессора Харьковского университета Льва Семеновича Ценковского (Харьков, 2003), на 1-ом съезде микологов России (Москва, 2002), на XI съезде Русского ботанического общества " (Барнаул, 2003), на всероссийских конгрессах " Успехи медицинской микологии " (Москва, 2003, 2004), на молодежных конференциях "Растение, микроорганизмы и среда" (Санкт-Петербург, 2000), "Экология и проблемы защиты окружающей среды" (Красноярск, 2001), "Актуальные проблемы биологии и экологии " (Сыктывкар, 2002), "Ломоносов - 2002" (Москва, 2002), "Биология - наука XXI века" (Пущино,2002, 2003), VI Докучаевских молодежных чтениях (Санкт-Петербург, 2003, 2004).
Публикации По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, в том числе 6 статей в реферируемых журналах.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 172 источников, в том числе 55 на иностранных языках. Основной текст изложен на 177 страницах, иллюстрирован 19 рисунками и 38 таблицами.
Влияние антропогенных загрязнений на структуру и свойства комплексов почвенных микромицетов
Почвенные грибы - это разнородная и многообразная в таксономическом отношении группа сапротрофных организмов. Они обитают в почве и на всех поступающих в почву субстратах животного и, главным образом, растительного происхождения, осуществляя превращение этих субстратов с новообразованием органического вещества. К почвенным микромицетам могут относиться и некоторые факультативные паразиты, проходящие часть цикла развития как сапротрофы в почве [Т.Г. Мирчинк, 1988].
Таким образом, почвенные грибы нельзя рассматривать как единую экологическую группу, так как экологические группы принято выделять на основе трофических связей, а почвенные грибы в таком понимании обладают разными способностями в освоении и использовании тех или иных субстратов. Их объединяет только общее местообитание в широком смысле.
К почвенным грибам в той или иной почве применимо понятие комплекса [Т.Г. Мирчинк, 1988], а не ценоза и не сообщества. Сообщество подразумевает наличие жестких функциональных связей между его компонентами. Таких связей внутри группы грибов нет. Грибы связаны функциональными и трофическими связями с другими компонентами биогеценоза. Однако, вопрос о правомерности выделения сообщества микромицетов до сих пор остается открытым. Например, М.Г.Таслахчьян, С.Г.Нагаполян (1996) со всеми выше изложенными оговорками все же предлагают выделять почвенные микроскопические грибы в отдельную структуру в связи с большим методическим удобством подобного подхода. Авторы указывают на возможность использования большинства показателей, применяемых в фитоценологии, для характеристики микоценозов.
Важным показателем состояния биологических систем является изменение биомассы различных групп организмов. Современные подходы к опре 12 делению биомассы грибов, их преимущества и недостатки представлены в специальных обзорах [Н.С. Паников и др., 1991]. Для почвенных грибов наиболее информативно раздельное определение биомассы спор и мицелия, которое дает возможность не только оценить суммарную биомассу, но и состояние грибов в почве. В этом случае биомасса спор может дать представление о покоящемся запасе (пуле) грибов, хотя методы ее определения методически далеко не отработаны. Изменение же биомассы мицелия может отражать в целом активизацию или ингибирование развития грибов в почве. Еще точнее это может быть определено с учетом метаболически активного (живого) и мертвого мицелия.
Значения суммарной биомассы мицелия изменяются обычно лишь при высоких уровнях воздействия, например, загрязнении тяжелыми металлами, радионуклеидами [Н.Н. Жданова и др., 1990] и т.п. Уменьшение биомассы мицелия в несколько раз, когда эта тенденция сохранялась во времени, наблюдали при воздействиях, чаще всего превышающих допустимые [А.В. Головченко, Л.М. Полянская, 2001]. При низких уровнях антропогенных нарушений в ряде случаев может наблюдаться некоторая стимуляция развития грибов и временное увеличение биомассы мицелия по сравнению с участками без воздействия. Для быстрой регистрации отклика на воздействие этот показатель малопригоден, так как значимое изменение биомассы происходит только через такое время после воздействия, когда уже произошло значительное нарастание мицелия или его уменьшение за счет лизиса и перехода к спорообразованию. Например, уменьшение биомассы мицелия грибов при уплотнении почв наблюдаются лишь через несколько месяцев после воздействия [О.Е. Марфенина и др., 1984].
Иной подход к мониторингу биологических систем - определение структурных показателей отдельных групп организмов на разных уровнях их организации - сообщество —» популяции — организм. Для комплексов почвенных грибов один из основных показателей - изменение их видовой структуры. В настоящее время в России в МГУ на Кафедре биологии почв под руководством Д.Г. Звягинцева создано целое направление по изучению влияния различных видов антропогенных воздействий на почвенные микроорганизмы [Методы почвенной..., 1991]. При проведении исследований сотрудниками кафедры применены оригинальные методические подходы. Для характеристики структуры комплексов микромицетов Т.Г. Мирчинк (1988) ввела понятие "пространственной" и "временной" частоты встречаемости. Их совместное использование позволяет разделить типичные виды микромицетов на доминирующие, частые и редкие.
Учет значимости (частоты встречаемости или обилия) видов в общей структуре грибного комплекса способствует более точному определению видового разнообразия и степени сходства грибных комплексов различных местообитаний [Методы почвенной ..., 1991]. Характер структуры комплекса почвенных грибов может быть использован для биомониторинга и биоиндикации изменений, происходящих в почве при длительном применении минеральных удобрений [А.П. Щербаков и др., 2002], пестицидов, загрязнении нефтью [Н.А. Киреева и др., 2001], тяжелыми металлами [Е.В. Лебедева и др., 1993] и других антропогенных воздействиях на почву.
На основе методов, разработанных русской школой, установлено четыре зоны действия токсикантов на почвенные микроорганизмы: зона гомеостаза, стресса, резистентности и репрессии [B.C. Гузев и др., 1980]. С помощью лабораторных моделей осуществлено нормирование содержания нефти и других поллютантов в почвах разного типа, в зависимости от отклика микробного сообщества [Д.Г. Звягинцев и др., 1989, СВ. Левин и др., 1995].
Обогащение почвы нефтью в пределах до 1 - 3 мл/кг обычно оказывало лишь общее стимулирующее действие на почвенную микробиоту и не вызывало проявления каких-либо последствий. Общая биомасса микроорганизмов амилолитического микробного сообщества несколько возрастала, а его состав оставался постоянным. Этот интервал концентрации нефти в почве определяется как зона гомеостаза. По мнению авторов, отдельные компоненты нефти в этом диапазоне концентраций выступают как биологические стимуляторы.
При концентрациях нефти в интервале концентраций до 10-30 мл/кг она уже выступает как активный модификатор микробиологических свойств почвы. В этом диапазоне нагрузки, названной зоной стресса, происходит значительное перераспределение доминантов в составе активно функционирующего микробного сообщества. Организмы, занимающие минорные позиции в исходной почве, становятся доминирующими и, наоборот.
Н.А. Киреевой и др. (2000) показано, что в результате перестроек в комплексе микромицетов в зоне стресса доминирующими в темно-серой лесной почве становились Penicillium funiculosum и Aspergillus terreus, которые в составе комплекса незагрязненных почв являлись случайными и редкими. Нефть стимулировала развитие популяций P.cyclopium, P.janthinellum, P.lanosum, P.martensii, P.variable, A.repens, а в полевых условиях A.ustus, P.tardum, Graphium sp., Mortierella sp. [Н.А. Киреева, Н.Ф. Галимзянова, 1995]. При исследовании почв вблизи Батумского нефтеперерабатывающего завода установлено, что качественный состав комплекса микромицетов также имел характерные отличия от контрольных незагрязненных образцов [Е.В. Лебедева и др., 1988]. В загрязненной почве увеличивалась частота встречаемости P.cyclopium, P.vermiculatum, Trichoderma koningii, Fusarium solani, Torula alii. Как правило, разница в структуре комплекса микромицетов загрязненных и контрольных почв довольно значительна, и коэффициент сходства не превышает 50% [Е.В. Лебедева и др., 1988, Ф.М. Хабибуллина, И.Б. Арчегова, 2001].
Характеристика видового разнообразия комплекса почвенных микромицетов
Для оценки степени близости комплексов грибов анализируемых почвенных образцов использовался коэффициент сходства Серенсена-Чекановского с учетом частоты встречаемости видов:
S= 2Cmin/(A+B), где А - сумма частот встречаемости микромицетов первого объекта; В -сумма частот встречаемости микромицетов второго объекта; Сщт - сумма минимальных частот встречаемости общих для первого и второго объектов видов микромицетов.
Для характеристики разнообразия видов микромицетов рассчитывались индекс разнообразия Шеннона D и показатель доминирования Симпсона С:
D = (pi-lgpi)/lg2;
С=Ц bi/B)2 ; где pi - значимость і вида; В - сумма значимостей видов в выборке.
В качестве показателя значимости для расчета приведенных выше индексов были использованы данные о пространственной частоте встречаемости видов микромицетов.
Испытуемую почву с помощью пинцета освобождали от посторонних включений, растирали до пастообразного состояния и равномерно распределяли по дну чашек Петри. Предварительно замоченные семена редиса (Сорт Красный с белым кончиком) в количестве 30 штук раскладывали по поверхности исследуемой почвы. Контрольные семена раскладывали на увлаж 55 ненной вате, покрытой фильтровальной бумагой. После достижения корнями редиса длины 0,3-0,5 см ее замеряли дважды с интервалом в 24 часа.
АФ = 100 - (Дх-Дн)/ (Дк-Дн) х100 (1), где Дх - средняя длина корней проростков через 24 часа в опыте (мм), Дк - средняя длина корней проростков через 24часа в контроле (мм), Дн - средняя начальная длина корней проростков (мм).
Токсичными считали почвы, вызывающие угнетение роста на 20-30% и более.
Для определения фитотоксичности культур микроскопических грибов их выращивали на жидкой питательной среде Чапека. Токсичность культуральной жидкости определяли на 7-10 день при поверхностном культивировании. Для этого семена редиса (сорт Красный с белым кончиком) промывали, замачивали в течение 5 часов в теплой воде и проращивали в термостате при температуре 25-26С. Для опытов использовались проростки в количестве 30 штук с длиной корней 1-2см.
Культуральную жидкость отделяли от мицелия фильтрованием, кончики корней (меристематическую зону и точку роста) помещали на 1 час в культуральную жидкость. Контрольные проростки помещали в питательную среду. После удаления культуральной жидкости проростки инкубировали в термостате еще 24 часа. Затем измеряли длину корней в опыте и контроле и рассчитывали фитотоксическую активность ингибирования роста корней (в %) по формуле (1). 2.3.11. Определение литической активности микромицетов [Методы экспериментальной..., 1982].
Для определения целлюлозолитической активности почвенных микромицетов использовали в качестве субстрата гель Na-КМЦ (натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы) с концентрацией 5%. Полученный гель разливали в пробирки, стерилизовали и засевали спорами исследуемых видов. Об активности целлюлозолитических ферментов судили по убыли непрозрачного геля Na-КМЦ за 7 суток культивирования, начиная с 5 дня после посева спор.
Способность грибных штаммов использовать пектин в качестве единственного источника углерода определяли визуально по интенсивности роста биомассы испытуемых грибов на среде Промбелона (п.2.3.2.) и оценивали по 3-х бальной шкале.
2.4. Статистическая обработка экспериментальных данных Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами [Э.В. Ивантер, А.В. Коросов, 1992] с использованием пакетов компьютерных программ STATISTICA V4.5. и Microsoft Office 2000 для Windows.
Влияние биопрепаратов Бациспецин и Деворойл на численность микроскопических грибов в почвах, загрязненных нефтью
Общая численность почвенных микромицетов - важный показатель экологического состояния почвы. Численность грибов в почве отражает их способность участвовать в разложении органического вещества почв, в круговороте минеральных веществ в почве.
Фоновая численность микромицетов в использованной для постановки эксперимента серой лесной почве была 3,5-10 грибных пропагул на 1 г почвы. Исследования экспериментальных почв, проводившиеся в течение полугода, выявили возрастание численности почвенных микроскопических грибов в контрольной почве в течение эксперимента (рис.2). Численность грибных зачатков в контроле через месяц инкубации увеличивалась в двадцать раз, а через три месяца - в тридцать раз (доверительные интервалы указаны в табл.1 приложения)
Колебание численности грибов в почве - распространенное явление, наблюдаемое в природных условиях и при создании лабораторных моделей [Д.Г. Звягинцев и др., 1994, Н.Ф. Галимзянова, Р.К. Андресон, 1990]. Наблюдавшийся нами рост численности микромицетов в контрольной почве скорее является следствием создания в почве более благоприятного температурного (повышение температуры до 27С) и водного (постоянно поддерживаемая влажность 60% от полной влагоемкости) режимов.
По отношению к микроскопическим грибам нефть не являлась сильно действующим токсикантом. Наоборот, в концентрации 1% и 5% она создавала благоприятные условия для развития микромицетов. Изменение численности микромицетов наиболее отчетливо проявлялось к 30 суткам инкубации. Через три месяца после загрязнения количество микромицетов уменьшалось, но при концентрациях нефти 1%, 5% оставалось выше контроля.
При концентрации 10-15% численность грибов становилась меньше, чем в контроле. Значительное нарушение водного и воздушного режима, битумизация поверхностных слоев почвы, высокое относительное содержание токсических компонентов неблагоприятно сказывалось на микобиоте почв и препятствовало ее росту.
Внесение биологического препарата в незагрязненную почву положительно влияло на численность микроскопических грибов. Через три дня после начала эксперимента количество грибных зачатков в незагрязненной почве увеличивалась в сто раз, через месяц в восемьсот раз по сравнению с первоначальным фоновым значением. Эффект вспышки развития грибов после внесения Бациспецина не был долговременным, в дальнейшем численность почвенных микромицетов снижалась. Это явление может быть связано, как с улучшением физико-химических характеристик почв, так и с появлением более доступных питательных субстратов. Погибшие клетки внесенных в почву бактерий также могут служить хорошим субстратом для развития микромицетов [Н.А. Киреева, 1994].
Одной из основных целей нашей работы было выявить особенности комплекса почвенных микромицетов в условиях применения биопрепарата для восстановления нефтезагрязненных почв, т.е. совместное влияние двух факторов (загрязнения и внесения препарата) на микромицеты почв. Эффект от внесения Бациспецина, в первую очередь, зависел от концентрации нефти в рекультивируемой почве. Положительный эффект наблюдался при загрязнении почвы нефтью в концентрации 1% и 5%. В этих вариантах содержалось больше микроскопических грибов не только по сравнению с соответствующим им контролем, но и по сравнению с загрязненными нерекультивируемыми почвами. Достоверное увеличение численности микромицетов по сравнению с вариантами опыта, не содержащими биопрепарата, наблюдали лишь в течение первых месяцев опыта, к третьему месяцу численность микромицетов сравнивалась со значениями из загрязненной нерекультивируемой почвы. Стимуляции грибного роста в почве не было при концентрациях нефти 10% и 15%, численность микромицетов при данных концентрациях не отличалась от нефтезагрязненных почв и была ниже контроля с биопрепаратом.
Опыт по исследованию влияния Деворойла на комплексы почвенных микромицетов был заложен в лабораторных условиях (опыт №5) на темно-серой лесной почве. В чистых контрольных почвах были отмечены незначительные колебания численности грибных зачатков (рис.3, табл.И приложения). Нефтяное загрязнение приводило, как и в большинстве рассмотренных ранее случаев, к постепенному росту численности микромицетов, выделяемых на среде Чапека.
Динамика численности микроскопических грибов в почвах, в которые был внесен биопрепарат Деворойл, имела свои особенности по сравнению с почвами, не подвергавшимися рекультивации. Уже в течение первого месяца инкубации в почвах с Деворойлом по сравнению с чистыми контрольными почвами наблюдался рост численности грибных зачатков приблизительно в десять раз. Однако анализ, проведенный через 70 дней после постановки опыта, показал снижение численности грибных зачатков и возвращение ее почти к фоновому уровню. Пик численности микромицетов в почвах с Деворойлом через месяц после начала эксперимента, по-видимому, связан с интенсивным потреблением ими питательных веществ, входящих в состав микробиологического препарата. В дальнейшем вплоть до конца опыта (180 дней инкубации) в нефтезагрязненной почве с биопрепаратом в отличие от загрязненной почвы без его внесения не было зарегистрировано роста численности микроскопических грибов.
Влияние нефтяного загрязнения на фитотоксические свойства почвенных микромицетов
Одним из важнейших показателей пригодности почв для сельскохозяйственного использования является их токсичность по отношению к растениям.
Для определения видовой принадлежности токсинообразователей в нефтезагрязненных почвах нами была протестирована степень фитоток-сического действия культуральной жидкости грибов, выделенных из лабораторных образцов почвы, загрязненной нефтью, на рост корней у проростков редиса. Культуральная жидкость практически всех исследованных штаммов микромицетов в той или иной степени подавляла рост у проростков редиса, что подтверждает данные о высокой токсичности микромицетов антропогенно загрязненных субстратов [СЮ. Селивановская,1999, Е.В. Лебедева, 2000]. Полученные значения коэфициента фитотоксичности представлены в таблице 32.
Из 172 исследованных штаммов, относившихся к 25 видам микроскопических грибов 122 в той или иной степени проявляли фитотоксичекую активность. Слабый токсический эффект или его отсутствие наблюдались у представителей Chaetomium и Trichoderma, у некотрых представителей родов Aspergillus (A.versicolor) и Penicillium (P.piceum) выраженных фитотоксичес-ких свойств обнаружено не было.
Коэфицент фитотоксичности грибов, выделенных из нефтезагрязненных почв, при росте на сахарсодержащей питательной среде колеблется в широких пределах от 13 до 95 %. Причем, большая часть данных укладывается в интервал от 40 до 70 %. То есть, грибы обладают достаточно высокой степенью токсичности по отношению к растениям. По степени фитотоксичности можно выделить виды, характеризующиеся высокой и низкой вариабельностью этого признака.
Сильно колеблется значение коэффициента фитотоксичности у штаммов Aspergillus fumigatus, Penicillium funiculosum. Близкие по значению фитотоксичности штаммы содержат виды Aspergillus niger, Aspergillus granulosus, Aspergillus terreus, Penicillium oxalicum. Грибами с ярко выраженным фитотоксическим действием считали изоляты, коэфициент фитотоксичности которых превышал 60% [Методы..., 1991]. Такие активные штаммы были обнаружены у большинства видов грибов. Наибольшим угнетающим действием на проростки пшеницы обладали штаммы Aspergillus niger. Показатель фитотоксичности для этого вида близок к 100%. Во многих работах указывается на сильную токсичность этого вида по отношению к растениям, почвенным животным и другим микроорганизмам [Е.В. Лебедева,2000, О.Е. Марфенина, И.А. Ищенко, 1997, Л.К. Михайлова и др., 1986]. Выраженное ингибирующее действие на рост корешков редиса было установлено у штаммов, принадлежащих к видам Penicillium funiculosum, P.cyclopium, P.lanosum, P.janthinellum, P.biforme, P.variable, P.martensii, Aspergillus restrictus, Cladosporium sp. Эти виды в качестве сильных токсинообразователей были отмечены и другими исследователями [Н.А. Киреева и др.,2000, Е.В. Лебедева,2000]. Многие из перечисленных видов не выделялись или были классифицированы нами в качестве типичных редких в чистых почвах и переходили в разряд типичных частых и доминирующих в загрязненных.
В связи с тем, что микромицеты при загрязнении почвы нефтью и другими антропогенными поллютантами способны значительно усиливать токсическое действие загрязнителя, нами была исследована представленность микромицетов с коэфициентом фитотоксичности, превышающим 60%, в нефтезагрязненных почвах в разные сроки отбора образцов (рис.15).
Как видно из представленных выше данных количество фитоток-сических микромицетов в почве растет с увеличением срока загрязнения. Если токсическое действие нефтяных углеводородов уменьшается со временем в связи с их испарением, физическим, химическим или биологическим разложением в почве, то токсикоз, обусловленный микроскопическими грибами, может не уменьшаться, а даже усиливаться в течение длительного промежутка времени. Так в нашем эксперименте через год после внесения нефти количество фитотоксичных форм грибов увеличилось более чем в два раза. Данный эффект достигается за счет изменения положения токсинообразователей в структуре комплекса почвенных микроскопических грибов. В первые месяцы после внесения загрязнителя наиболее активные изоляты были представлены видами Penicillium funi-culosum, Aspergillus niger. В шестимесячные сроки инкубации и в ее конце наибольшее количество колоний среди видов активных токсинообразователей пренадлежало Penicillium simplicissimum, Penicillium oxalicum. Несмотря на то, что штаммы Aspergillus niger отличались даже большим токсическим действием, чем изоляты этих видов грибов, общий токсикоз почв возрастал в связи с большей частотой встречаемости Penicillium simplicissimum, Penicillium oxalicum по сравнению с Penicillium funiculosum, Aspergillus niger.
Влияние разных способов рекультивации на уменьшение доли фито-токсичных форм микромицетов в почве относительно нефтезагрязненных аналогов (2-3 месяца инкубации)
Практически все исследованные нами методы рекультивации в той или иной степени способствовали снижению числа фитотоксичных изолятов микромицетов в нефтезагрязненной почве. Это может быть связано как с антагонистическим действием компонентов биопрепаратов, например, Bacillus sp. 739, так и с созданием благоприятных условий для развития микроорганизмов-антагонистов, например ризосферных бактерий, в самой почве. Более эффективными (на 20-30%) оказались методики, включавшие высев в почву фитомелиоранта - люцерны через некоторое время после загрязнения (рис.16).
