Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общие закономерности формирования популяций микроорганизмов на плотной питательной среде 16
1.1. Развитие микроколоний микроорганизмов как первый этап формирования колоний на плотной питательной среде . 16
1.2. Развитие популяций микроорганизмов на этапе пространственно локализованных образований колоний. 23
1.3. Адаптационные процессы популяциях микроорганизмов. Диффузно-распределенные популяции микроорганизмов как природно существующие в составе различных биоценозов. 27
1.4. Биотестирование как метод оценки экологического состояния окружающей среды при развитии микробных популяций. 35
1.5. Информационные показатели, характеризующие адаптивный процесс популяций микроорганизмов при развитии на плотной питательной среде. 52
Заключение. 54
Глава 2. Материал и методы исследования. 56
2.1 Исследуемые объекты - популяции прокариотов и эукариотов. 56
2.2 Микрокамеры для культивирования микроорганизмов. 57
2.3 Фазово-контрастная микроскопия развивающихся бактериальных клеток и микроколоний. Сигмум-морфометрия бактериальных клеток как метод исследования световой микроскопии. 59
2.4 Электронная микроскопия бактериальных клеток и их колоний. 63
2.5 Определение окислительно-восстановительного потенциала развивающихся культур бактерий 64
2.6 Определение уровня обсемененности воздушной среды микроорганизмами. 67
2.7 Определение уровня микробной контаминации отработанного воздуха при производственном выбросе в атмосферу. 69
2.8 Прецизионный камерный счет клеток в бактериальной популяции. 70
2.9 Дополнительные методы исследований. 71
Глава 3. Выбор информационных показателей, наиболее полно характеризующих адаптивный процесс популяции(й) микроорганизмов при развитии на плотной питательной среде . 75
3.1. Микроколония бактериальных клеток как сложное сообщество.
3.2. Бактериальная колония как сложное сообщество клеток. 110
3.3. Показатель колонизационной активности в оценке развития популяции микроорганизмов. 130
Заключение 134
Глава 4, Экологические аспекты колонизационной активности микроорганизмов .
4.1. Показатель колонизационной активности как возможный экологический индикатор состояния окружающей среды . 135
4.2. Сравнительная характеристика чувствительности метода определения колонизационной активности микроорганизмов и косвенных методов оценки развития микробных популяций. 140
4.2.1. Исследования по оптимизации условий и необходимых факторов для конструирования бактериальных тест-систем. 140
4.2.1.1. Бактериальные культуры, оптимальные сроки их хранения, подбор питательных сред, редокс-индикаторов. 140
4.3. Динамика колонизационной активности микроорганизмов в модельной системе "почва закрытого грунта" (теплица). 148
4.4. Колонизационная активность при тестировании микробного развития в водной фазе. 165
4.4.1. Колонизационная активность мицелиальных микроорганизмов на примере гриба Вешенка. 166
4.4.2. Колонизационная активность при ингибирующем действии различных биоцидов. 168
4.4.3. Колонизационная активность при физическом воздействии на микробные популяции. 171
4.5. Определение колонизационной активности микроорганизмов при оценке экологической
безопасности воздушной среды. 188
4.5.1. Определение уровня обсемененности воздушной среды микроорганизмами в рабочей зоне цеха ферментных препаратов (АОО "Петровский спиртовой комбинат" Ивановская область). 188
4.5.2. Определение уровня микробной контаминации отработанного воздуха при производственном выбросе в атмосферу. 189
4.5.3. Определение колонизационной активности микроорганизмов для воздушной среды текстильных предприятий. включение 203
Глава 5. Медико-экологические аспекты колонизационной активности микроорганизмов .
5.1. Влияние пектина на колонизационную активность микроорганизмов постоянных обитателей желудочно-кишечного тракта человека . 206
5.2. Использование определения колонизационной активности при разработке нового оздоровительного напитка "Лактис" {фирма "Кумир" Иваново). 210
5.3. Влияние сока высшего гриба Шиитаке на микроорганизмы микрофлоры тела человека. 211
5.3.1. Оценка биологической активности сока гриба Lentinus edodes в отношении различных характеристических микроорганизмов микрофлоры человека. 213
5.4. Антибактериальное действие сока Шиитаке. 227
Заключение 234
Глава 6. Обсуждение результатов. 237
Выводы, 264
Список литературы, 267
- Развитие микроколоний микроорганизмов как первый этап формирования колоний на плотной питательной среде
- Определение окислительно-восстановительного потенциала развивающихся культур бактерий
- Показатель колонизационной активности как возможный экологический индикатор состояния окружающей среды
- Влияние пектина на колонизационную активность микроорганизмов постоянных обитателей желудочно-кишечного тракта человека
Введение к работе
В настоящее время происходит нарастание экологического неблагополучия среды обитания за счет увеличения антропогенного "негативного" прессинга. Ненормированные диссипативные антропогенные нагрузки на окружающую среду, несмотря на колоссальные резервы ее устойчивости, могут явиться первопричиной экологических катастроф. В первую очередь это относится к загрязнению химическими веществами, несвойственными природе, так называемыми, ксенобиотиками (Мзраэль Ю.А.,1979). Это может также привести к закономерному изменению спектра инфекционной патологии современного человека и смене приоритетов среди микроорганизмов (Литвин В.Ю. с соавторами, 2001). Оценка состояния природной среды подразумевает всесторонний анализ ее изменений. К сожалению, существующие методы экологического мониторинга часто сложны и трудоемки в исполнении. При экологической оценке состояния окружающей среды в первую очередь наблюдают за реакцией биоты под влиянием различных факторов. Реакции биоты обычно оцениваются по обнаружению и реакции определенных тест-организмов, за которыми наблюдают необходимое время. Сравнение полученных данных относительно количества организмов в контроле позволяет делать выводы о благоприятности или неблагоприятности внешних воздействий на экосистему. Вместе с тем, достаточно трудно сопоставлять биологическую активность того или иного организма в составе биоты, поскольку абсолютные величины численности организмов порой невозможно сравнивать между собой. Поиск показателей, позволяющих определить как активность организма в составе биоты (экосистемы), так и сопоставлять активность организмов внутри ее, является актуальной задачей биологической науки. Более простым путем могут быть поиски такого рода показателя для характеристики различных экосистем и организмов внутри их, прибегнув к микробиологическим исследованиям.
7 Внутри биоты микроорганизмы являются оптимальным индикатором, учитывая их повсеместное распространение, высокую численность, большой вклад в процесс обмена веществ, энергии и быструю смену поколений (Пшеничнов Р.А., 1991). С помощью различных микробиологических методов возможно быстро и достоверно оценить генотоксический (мутагенный и канцерогенный) потенциал химических соединений (Методические указания Института общей генетики АН СССР 1985), установить персистентные характеристики бактериальных популяций, зависящие от степени загрязнения окружающей среды {Бухарин О.В., 1999). Это позволяет быстро прогнозировать и оценивать степень реальной опасности загрязнения экосистемы для человека. Однако практически постоянно исследователи сталкиваются с проблемой значимости того или иного микроорганизма в структуре биоценоза. Оценка развития определенного штамма микроорганизма в чистой культуре и влияние на него различных факторов биотической и абиотической природы является ведущей проблемой микробиологии.
Микроорганизмы (бактерии и грибы) обычно развиваясь, формируют структурно-организованное скопление клеток - колонию. Изучена организация бактериальных колоний отдельных видов, ее цито архитектоника (Высоцкий В.В. и др.1984;1985, Afrikjan E.G. et al., 1971), возрастная и пространственная гетерогенность (Тикк Э.И,,1984, Пузырь А.П., Могильная О. А. ,1988). В то же время особенности развития микроскопических эукариотических организмов изучены недостаточно. Возможности познания эукариотических организмов ограничиваются сложностью их культивирования и длительностью клеточного цикла, что ведет к существенному усложнению постановки экспериментов и недостаточностью методов оценки полученных результатов. Кроме того, существует довольно значительное различие между растительными эукариотическими клетками и эукариотическими клетками животного происхождения. Наиболее часто в природе сталкиваются микроорганизмы (прокариоты и эукариоты) в почве, где идет тихая, молчаливая, но от этого не менее напряженная
8 симбиотическая жизнь или борьба за существование. На поверхности питательного субстрата, так и внутри его, многие эукариотические микроорганизмы, также как и бактериальные клетки, способны образовывать колонии. В связи с этим, доступным, оптимальным, и воспроизводимым может оказаться изучение развития колоний на поверхности питательных субстратов, поскольку практически отсутствуют методы исследования микроорганизмов, заключенных внутрь агаризованных питательных сред.
Бактериальная колония, также как и колония эукариотических клеток - это сообщество клеток, развивающееся как единый организм, которое тонко реагирует на изменение химических, физико-химических и биологических факторов среды обитания и, поэтому, именно колонии могут быть использованы в качестве простых индикаторных систем. В настоящей работе предполагалось провести фундаментальное исследование воздействия химических, физических и биологических факторов на процесс формирования колонии бактериальных клеток и предложить морфофизиологическую цитоархитектонику колоний микроорганизмов в качестве простого теста для оценки экологического состояния окружающей среды по особенностям колонизационной активности изучаемых штаммов. Предполагалось также исследовать в аналогичных условиях развитие колоний эукариотических организмов на модели гриба Вешенка, а затем, используя полученные данные определить потенциальную возможность их применения для оценки влияния экологических факторов.
Цель работы:
Выявить особенности роста и развития некоторых популяций прокариотических и эукариотических клеток на плотных и жидких питательных средах, определить наиболее информативные показатели развития этих популяций, возможности и ограничения использования установленных интегративных показателей в различных экологических исследованиях.
9 Задачи научного исследования:
Разработать методическое обеспечение для морфометрического изучения бактериальных колоний и колоний некоторых грибов (эукаритов) на поверхности плотной питательной среды. Исследовать в динамике морфоцитоархитектонику колоний.
Изучить закономерности формирования бактериальных колоний (на примере штаммов S.flexneri с генетически детерминированной антигенной структурой} на плотной питательной среде в оптимальных и экстремальных условиях среды обитания.
Разработать общие подходы для оценки активности процесса адаптации микроорганизмов (некоторых прокариотов и эукариотов) к различным условиям среды обитания (оптимальным и экстремальным условиям) и созданию индикаторных микробиологических систем для определения экологического состояния среды.
Определить возможности и ограничения использования показателя колонизационной активности в различного рода экологических исследованиях, в том числе и при изучении микробной экологии человека.
Объект исследования:
Прокариоты:
Грамотрицательные бактерии: шигеллы S.flexneri S (Shigella flexneri 50 - S) и Rd (Shigella flexneri 62 - Rd = (За)) из коллекции Симмонса, E.coli M-17 (препарат «Колибактерин»), E.coli 0-114 из коллекции микробных штаммов кафедры микробиологии, вирусологии Ивановской государственной медицинской академии.
Грамположительные бактерии: Baciiius subtilis. * Грамположительные кокки: род. Staphylococcus, Streptococcus и другие микроорганизмы - прокариоты, как промышленные штаммы, так и "дикие", выделенные из различных экологических источников, в том числе и из организма человека.
10 кариоты: штаммы грибов: Candida albicans, музейные штаммы высших грибов Pleurotus ostreatus, Shiitake (Lentinus edodes) и др. учная новизна:
Впервые разработана методология для изучения закономерностей формирования микроколоний прокариотов на плотной питательной среде
Предложен и широко апробирован новый метод оценки колонизации популяциями клеток прокариотов и эукариотов питательного субстрата. Показана эффективность применения этого метода при экологических исследованиях в трех средах -почве, воде, воздухе.
3. Установлено, что метод оценки колонизационной активности микроорганизмов, позволяет расшифровать иерархическую структуру микробной популяции. Это дает возможность целенаправленно конструировать (реконструировать) микробные ассоциации для различных биотехнологических целей, в том числе для создания новых оздоровительных и профилактических препаратов для человека.
Определено, что комплекс биологически активных веществ, выделенных из сока высшего съедобного гриба Шиитаке, обладает выраженным избирательным действием различной направленности на характеристические виды микрофлоры человека.
Разработан оригинальный технологический цикл культивирования съедобных грибов (на примере гриба Шиитаке) и получения на его основе биологически активных компонентов, обладающих ярко выраженным иммуностимулирующим и профилактическим действием.
Практическая ценность исследования и реализация результатов работы:
Создан комплекс методов микрокультивирования, позволяющих проследить закономерности развития микробных популяций от единичных клеток до этапа визуально различимых колоний. Данные разработки могут быть использованы в фундаментальных исследованиях в микробиологических лабораториях различного профиля.
Результаты работы в настоящее время используются в производстве - молочнокислый напиток «Лактис» (фирма «Кумир» г.Иваново). Фи то защитный препарат для применения в условиях закрытого грунта теплиц «Э ко фит» (ФГСП совхоз «Тепличный г.Иваново). Способы получения зернового мицелия съедобных грибов и метод их культивирования внедрены и имеют крайне важное значение в хозяйствах различных форм собственности, а также личных дачных участках для получения плодовых тел грибов как экологически чистого продукта питания. Получение достаточного количества грибной биомассы как сырья дает возможность последующего фармакологического использования при получении биологически активных компонентов с медицинскими целями.
В целом по результатам работы были получены следующие авторские свидетельства, патенты и отраслевые рационализаторские предложения в различных областях микробиологии:
Кузнецов О.Ю., Смирнов С.Г. Способ бестарного выращивания высших грибов. Бюл.изоб.Ы2, 20.01.1 998,А.С.N 2101913.
Кузнецов О.Ю. Способ выращивания зернового мицелия высших грибов. A.C.N 2101914 Бюл.изоб.№2 от 20.01.1998.
Кузнецов О.Ю., Чистякова М.Н. Способ получения оздоровительного напитка. Патент №2140448 Бюл.изоб.№30, 27.10.1999.
Неустроева Н.Р., Воробьев Ю.Г., Смирнов Р.П., Кузнецов О.Ю. 54, 56 - индий(Ш)хлор:58,60-кобальт([|)оксо-6,11:19,24:32:45,50-тет-раимино-5,52: 13,18: 20,31: 39,44-6,11: 19,24:32,37:45,50-
12 тетранит-рилоктабензо[С, G, Е, Р, U, Y, D, Н] (1, 10, 19, 28-тетраазациклогекса-триаконтин, обладающий бактериостатичес-ким действием на стафилококк и кишечную палочку. Патент России №2135500 Бюл.изоб.№24 от 27.08.1999
Кузнецов О.Ю., Голубев О.А., Егорова Н.Г., Ащеулов В. И., Рупасов К.И., Марков B.C. Способ получения биологического препарата «Экофит» для защиты растений от фитопатогенов и повышения урожая. Патент России №2170510 Бюл.изоб.№20 от 20.07.2001.
Миль ко в а Е.В., Кузнецов О.Ю., Сотникова Н.Ю. Способ получения препарата эубиотика колибактерин. Патент России №2174842, Бюл.изоб.№ 29 от 20.10.2001.
Кузнецов О.Ю. Способ выращивания мицелия высших грибов. Патент России №2192119, Бюл.изоб.№ 31 от 10.11.2002.
Стройкова И.К., Максимов А.И., Галашина В.Н., Кузнецов О.Ю., Морыганов А.П. Способ стерилизации. Патент России №2195961 Бюл.изоб.№1 от 10.01.2003.
Егорова Н.Г., Голубев О.А., Кузнецов О.Ю., Слободин В.Б. Способ измерения электрофоретической подвижности биологических микрообъектов. Патент России №2199733 Бюл.изоб.№ 6 от 27.02.2003.
Егорова Н.Г., Голубев О.А., Кузнецов О.Ю., Слободин В.Б. Способ определения электрофоретической подвижности биологических микрообъектов. Патент РФ № 2199733. Бюллетень изобретений № 6 от 27.02.2003.
Голубев О.А., Кузнецов О.Ю., Железняк Н.И., Маклецова Ю.И. Огурцов В.В. Способ измерения электрофоретической подвижности абиотических микрообъектов. Патент РФ №2245539 Бюл.изоб.№ 3 от 27.01.2005.
Кузнецов О.Ю., Соснина А.Е., Голубев О.А., Козловский А.С. Емкость для выращивания мицелия высших грибов и их плодовых тел. Патент на полезную модель РФ №38528. Бюллетень изобретений №19 от 10.07.2004.
13 Связь задач исследований с проблемными планами:
Диссертация выполнялась в рамках научно-исследовательской программы «Снижение инфекционной заболеваемости в условиях социально-экологического неблагополучия» Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского и научного плана Ивановской государственной медицинской академии 1995 -2001 г.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены и обсуждены на следующих международных, всесоюзных, республиканских и региональных конференциях:
Физико-химические исследования патогенных энтеробактерий в процессе культивирования, Иваново, Регион.конф., 1985;
Конференц. АН СССР, Сиб. отделение «Биофизика микробных популяций», Красноярск, 1987;
Электр,микроскопия для иссл. функциональных изменений структуры клеток при различных воздействиях//.Всес.семинар НТО РЭС им.А.С.Попова, ИГМИ им.А.С.Бубнова Иваново, 15-18 июня 1987;
Всес. Семинар «Колонизационная резистентность и химиотерапевтические антибактериальные препараты» 28-29 июня Москва,1988. «Проблемы современной биологии» 20-я науч.конф.биол.фак.МГУ,Москва,24-28 апреля МГУ.М.,1989; «Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Сев. Прикаспия» Всес.симпозиум, Оренбург^ 991;
Республиканская конференция "Проблемы развития малоотходных ресурсосберегающих экологически чистых технологий в текстильной и легкой промышленности" (г. Иваново, 1994);
Всероссийская конференция с международным участием "Озон в биологии и медицине" II Всероссийская научно-практическая конф. с междунар. Участием 6-8 сентября 1995 г., Нижний Новгород, 1995 (г. Нижний Новгород,1995);
Всероссийская конференция "Дисбактериозы и Эубиотики" (г.Москва, 1996);
Международная конференция "Экология человека и природы" (г. Иваново,1997);
I Международная научно-техническая конференция 22 -23 сентября, Иваново, 1997.Актуальные пробл. Химии и химической технологии (Химия-97). Per.семинар «Экологические проблемы Верхн.-Вол же к.региона. Условия перехода к устойчивому развитию (22-23сент.), г.Иваново,1997;
Международная научно-практической конференция: "Загрязнение окружающей среды и здоровье населения" Смоленск СГМА . 1999;
Внутрибольн.проблемы эпидем. клиники,диагностики, лечения и профилактики. II Росиийская научн. практ.конф. с междун.уч. 30 ноября-2 декабря 1999, Москва; Росс.научн. ко нф. «Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях». Челябинск, 2000;
Третья научная конф. с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге - 99" С-П 18-20 мая 1999; И Всероссийской научной конференции "Молекулярная физика неравновесных систем" Иваново 2000;
Физика и радиоэлектр. в медицине и экологии ФРЭМЭ, 2000. Мат. 4 международн.научно-техн.конф. 27-30 июня 2000, Владимир, 2000; Ml Всероссийской науч-пр.кон. «Экологические проблемы биодеградации промышленных, строительных материалов и отходов производства». Пенза, 2000;
Междунар. НТК «Достижения текстильной химии в производстве» (Текстильная химия -2000); III Конгресс РСХТК, Москва -2000;
Международный форум по проблемам науки, техники и образования г. Москва, 2000;
Современные наукоемкие технологии и перспективные материалы текстильной и легкой промышленности (Прогресс-2001). Науч.-практ. конф. Иваново, 2001. ИГТА. Молекулярная биология, химия и физика неравновесных систем. 6-я Международная научная конференция. Иваново,2002.
Научно-практическая конференция «Современное состояние Российской биотехнологии», Москва, 2003, Пущино, 28-29 октября 2003.
II Московский международный Конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития, М., 10-14 ноября 2003. Первый Всероссийский Конгресс медицинских микологов «Успехи медицинской микологии», М.2003.
2-й съезд Общества биотехнологов России, 13-15 октября 2004, Москва.
Второй Всероссийский Конгресс по медицинской микологии. Москва. 2004.
Республиканская конференция «Иммунология репродукции», Иваново, 2005.
Положения выносимые на защиту.
1. Колонизационный потенциал прокариотов и микроскопических эукариотов, определяемый на основе расчета показателя колонизационной активности (ПКА), определяет
15 закономерности и особенности функционирования микробиоценозов в различных средах обитания, адаптивную стратегию конкретного вида в составе микробиоценоза.
Для оценки колонизационной активности популяций микроскопических прокариотов и эукариотов предлагается комплекс оригинальных устройств и способов их использования в микробиологической науке и практике, имеющих как фундаментальное, так и прикладное применение.
На основе предложенной концепции показателя колонизационной активности микроорганизмов разработан и внедрен в производство биологически активный препарат «Экофит», позволяющий осуществить коррекцию микробиоценозов почвы в ходе выращивания овощных культур растений.
Впервые установлено, что комплекс биологически активных веществ, присутствующий в соке высшего съедобного гриба Шиитаке, обладает выраженным избирательным действием различной направленности в отношении характеристических видов микрофлоры человека.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 81 работа, в том числе 11 изобретений и патентов России.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 288 страницах, состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, 3 глав результатов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов, приложения, иллюстрирована 53 рисунками и 40 таблицами. Список литературы включает 256 работ отечественных и 127 публикаций иностранных авторов.
Развитие микроколоний микроорганизмов как первый этап формирования колоний на плотной питательной среде
При попадании клеток микроорганизмов на поверхность плотной питательной среды необходимо время для активизации и репарации определенных ферментных систем отдельных клеток из состава популяции. В этом процессе часть клеток неспособных восстановить свои функции необратимо должна погибнуть, а все накопленные данными клетками вещества станут достоянием остальных, жизнеспособных клеток. Все эти особенности развития популяций микробов возможно наблюдать и зарегистрировать с помощью фазово-контрастной световой микроскопии. Одиночно развивающиеся клетки после первого деления образуют скопления клеток, первоначально размещающихся в одной горизонтальной плоскости. Такого рода скопления в микробиологических исследованиях принято определять как микроколонии. Впоследствии после роста и развития клеток на поверхности питательной среды разделяющиеся клетки из состава микроколонии переходят к трехмерному освоению питательной среды поверх слоя питательного агара, занимая в данном случае весь объем пленки жидкости над средой культивирования.
Микроорганизмы в природе существуют как в виде отдельных клеток, так и многоклеточных формирований, образуя популяции совокупности особей одного вида, внутри которых нет изоляционных барьеров пространственно-временного передвижения генетической информации. При наблюдении за отдельной бактериальной клеткой "нормально" проходящей свой жизненный цикл, видно как ее линейные размеры увеличиваются с течением времени, и затем это заканчивается делением клетки. Координированное воспроизведение всех клеточных структур и компонентов называется ростом, но не всегда рост предшествует делению. И поэтому правильнее в этом случае для характеристики процессов, происходящих на клеточном уровне, применять термин развитие. Развитие - необратимый, закономерно направленный процесс тесно 17 взаимосвязанных количественных и качественных изменений индивида или особи с момента рождения до ее смерти или прекращение индивидуального существования при делении. Растет или развивается популяция микроорганизмов, например, бактериальных клеток? Здесь наблюдается некоторое тождество понятий рост и развитие для бактериальной популяции. Рост бактериальной популяции выражается в увеличении общего числа клеток и их биомассы. Постоянно в популяции присутствуют живые и погибшие клетки, а также клетки, которые по каким-либо причинам перешли в состояние покоя. И термин «рост» для бактериальной популяции несколько противоречит тем сложным физиологическим процессам, происходящим с погибающими и покоящимися клетками. И именно поэтому, на наш взгляд, более правильно с биологических позиций говорить о развитии популяции. Для последующего описания процессов, происходящих в популяции клеток микроорганизмов на плотной питательной среде, необходимо понимание процессов, связанных с образованием клеткой подобных себе самой, т.е. понимание процессов воспроизведения элементарных кирпичиков природы - клеток. Этот процесс мы хотели бы рассмотреть на примере прокариотических клеток, как наиболее простой модели с достаточно хорошо изученным жизненым циклом. Еще в 1951 г. Иерусалимский Н.Д. утверждал, что проблема онтогенеза бактерий - одна из самых сложных в биологии. Вопрос о старении и смерти микроорганизмов имеет филосовский оттенок, и в этом смысле неоднократно обсуждался в литературе. Стрешинский М.О. (1956) писал: "С представлением об индивидууме у нас неразрывно связаны представления о процессах его онтогенеза -эмбрионального и постэмбрионального развития, функционирования в зрелом возрасте, старения и, наконец, естественной смерти. Правомочно ли перенесение всех этих этапов развития особи на бактериальную клетку?" У прокариотов, не имеющих митоза, определение стадий клеточного цикла, на котором находятся отдельные особи, крайне затруднено. В связи с этим, считают в частности Б.В.Громов и С.М.Ждан-Пушкина (1981), полезно было бы договориться, что следует понимать под возрастом бактериальной клетки. Оценка возраста бактерий тесно связана с вопросом о неравноценности клеток, образовавшихся в результате деления одной клетки. Так, Malek J. (1956) считает, что бактерия при делении дает не две клетки-сестры, а материнскую и дочернюю клетки. Наблюдения автора на 45 культурах показали, что на самых ранних этапах образующаяся микропопуляция уже является неоднородной. Рост живых существ состоит в увеличении массы активных частей организма, при котором количество свободной энергии в организме возрастает" (Шмальгаузен И.И., 1935). Различают рост индивидуальных клеток и рост популяции. Каждый из них характеризуется своими закономерностями и особенностями. Кинетика роста бактериальной популяции не определяется кинетикой роста индивидуальных клеток, хотя между ними существует определенная взаимосвязь (Коротяев А.И., 1973). Рост бактерий является сбалансированным процессом, включающим в себя синтез различных клеточных компонентов. Средний объем делящейся клетки должен быть примерно в два раза больше среднего объема вновь образованной бактерии (Collins J.F., Richmon M.N., 1962). При изучении процесса роста палочковидных бактерий удлинение клеток является удобным объектом измерения. Поэтому для определения кинетики роста индивидуальных клеток, размножающихся на плотной питательной среде, обычно используют прямое измерение длины (Powell Е.О., Errington F.P., 1963; Errington F.P., Poweli E.O, Thompson N., 1965; Aldea M., Herrero E., Trueba F.J.,1982). Скорость роста бактериальных клеток в жидкой среде определяется из частот распределения размеров индивидуальных клеток в популяции (Adeno К/]., Bacci С, Quaranta О., 1980; Woldring C.L., Grover N.B., Rosenberger R.F., 1980; Kubitschek H.E.,1981; Ranta J,, 1982). На основании полученных результатов авторами создан ряд математических моделей роста индивидуальных бактериальных клеток, зачастую противоречивых. Так, представлены модели линейного, экспоненциального роста клеток, а также билинейного - с удвоением скорости роста при достижении бактерией критического размера.
Определение окислительно-восстановительного потенциала развивающихся культур бактерий
Нами использована трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия бактериальных клеток и бактериальных колоний. Препараты готовили согласно широко известной методике Уикли Б. (1975). После фиксации в 2,5% растворе (рН=7,2) глутарового альдегида на основе раствора Хенкса образцы отмывали в 1 % растворе Os04 на фосфатном буфере и после промывки в том же буферном растворе обрабатывали 1% раствором таниновой кислоты (Simionescu N.M., Simionescu N.,. Palade P.E., 1975). Далее следовало обезвоживание в возрастающих концентрациях этанола и заливка в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB-III, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, а затем просматривали на электронном микроскопе ЭВМ-100 АК.
Для подготовки срезов колоний предварительно выполняли фиксацию колоний на агаре путем создания агаровых слоев следующим образом. Выбрав необходимую для работы-колонию, вокруг ее размещали на агаре кольцо с диаметром около 2 см. Затем на колонию внутрь кольца аккуратно выливали застывающий, но еще расправленный голодный агар при температуре около 45С. Установлено, что данная температура не приводит бактерии к гибели. Таким образом, колония бактерий оказывалась заключенной между двумя слоями агара. После застывания верхнего слоя агара специальным полым штампиком, диаметр которого был больше диаметра колоний, вырезали колонию и переносили ее в фиксирующий раствор глутарового альдегида. Ориентировка образцов колоний по параметрам "верх-низ" осуществляли принципу больший слой агара внизу, поскольку нанесение агара на колонию выполняли только для покрытия колонии агаром. Вырезанный блок помещали в фиксирующий раствор и оставляли там достаточное для проникновения фиксатора время, обычно это занимало не менее 24 часов. На следующий день выполнение методики продолжали до получения экспериментальных образцов, как было описано выше.
При подготовке исследуемого материала для сканирующей электронной микроскопии в целях исключения потерь образцов или их механического повреждения при проводке материала через этанол возрастающей концентрации (50-70-90-100) и ацетона, нами был использован оригинальный сборный контейнер (рац. пред.№1729, 1986 .ИГМИ). Образцы после прохождения через ацетон высушивали путем перехода через критическую точку в двуокиси углерода. Препараты приклеивали на алюминиевые столики, напыляли золотом, а затем просматривали в сканирующем микроскопе Hitachi-405 А при инструментальном увеличении до 30 тысяч раз.
В исследованиях окислительно-восстановительного потенциала бактерий нами был использован способ измерения физико-химических показателей развивающихся культур бактерий с помощью датчиков кислотно-щелочного равновесия, окислительно-восстановительного потенциала, температуры- и мутности, отличающийся тем, что, с целью повышения точности измерения, аналогичные датчики помещаются в сосуд с развивающейся культурой и в сосуд со стерильной питательной средой, причем выхода датчиков обоих сосудов включают в дифференциальную схему сравнения преобразованных токов с дальнейшим усилением полученной разницы этих токов и подачей их на регистрирующий или измерительный прибор (А.С. №215432 от 3.04.1968 "Способ измерения физико-химических показателей развивающихся культур бактерий", авт: Смирнов С.Г., Смирнов К.К.)- Измерения ОВП проводились в оригинальном "двенадцатиточечном" лабораторном приборе для измерения гН2 развивающихся бактерий. Датчиком в приборе является электродная пара платина-сурьма. Измерительный прибор - электронный милливольтметр ЛПУ-01 имеет компенсационную схему, существенно уменьшающую ток, потребляемый от датчика (10"11 - Ю"12), что позволяет применить как оригинальные биметаллические, так и стеклянные электроды серийного изготовления. Прибор состоит из двенадцатиячеечного термостатируемого культиватора, коммутатора датчиков, ЛПУ-1 и самопишущего потенциометра на 12 точек - КСП-4 (см. Рис.2.1.). Культиватор представляет собой водяной термостат, в крышке которого имеется 12 гнезд для крепления колб на 100 мл питательной среды. Помимо электрометрического метода измерения ОВП мы использовали колориметрический метод с помощью ре до кс-индикаторов. Индикаторы этого класса хорошо известны и довольно хорошо изучены, Однако применение их в титриметрии ограниченно по сравнению с другими используемыми индикаторами. Область рассматриваемых формальных потенциалов такова, что эти индикаторы применяются только с сильными восстановителями, такими как хром (II), ванадий (II), титан (111), олово (II) и аскорбиновая кислота, растворы которых неустойчивы в присутствии кислорода. Титрование этими восстановителями надо проводить в отсутствие кислорода, что сопряжено со многими трудностями.
По этой причине такие методы стараются по возможности не использовать. Например хотя железо (!!!) можно непосредственно, титровать ванадием (И), хромом (II) или титаном (111), чаще восстанавливают его до железа (П) и затем оттитровывают сильным окислителем, например церием (IY) или марганцем (YII). Были предложены многие методы, в которых используются индикаторы, имеющие формальный потенциал ниже 0,76 В. Эти индикаторы находят применение в биологических исследованиях для измерения окислительно-восстановительных потенциалов в конкретных системах. Кларк с сотр. (Clark W.M. 1923-1933) предпринял первое систематическое исследование в этой области, получив большое число окислительно-восстановительных индикаторов, потенциалы которых находились в области потенциалов биологических систем.
Показатель колонизационной активности как возможный экологический индикатор состояния окружающей среды
При попадании бактериальных клеток на поверхность плотной питательной среды, подходящей для их дальнейшего развития, они затем образуют скопления клеток - микроколонии. Прижизненная световая микроскопия бактериальных клеток, как известно, может предоставить в распоряжение исследователя сравнительно небольшой объем первичной информации. Исследование поведенческих аспектов отдельных клеток в составе микроколоний достаточно сложная и крайне трудоемкая задача в первую очередь из-за получения первичной информации о процессе их развития. Метод динамической векторной морфометрии, предложенный Воскун СЕ. в 1984 г., предполагает измерение длины, диаметра и координат перемещения клеток в пространстве с течением времени. При накоплении в составе микроколонии 4-8 клеток все измерения уже весьма затруднены.
Наиболее часто используемым морфологическим показателем при изучении клеток палочковидных бактерий является их длина (Powell Е.О., Errington F.P.,1963; Errington F.P., Powell E.O., Thompson N.,1965; Aldea M., Herero E., Trueba F.J., 1982). Диаметр данных клеток во время цикла роста обычно считается постоянным (Marr A.G., Harvey R.J., 1966; Grover N.B., Woldringh C.L., Zaritsky A. et al., 1977; Koppes L.J.H. et al., 1978; Pierucci O. et al., 1981), но некоторые исследователи обнаружили, что диаметр клеток энтеробактерий к концу цикла роста уменьшается (Trueba F.J. et al, 1980; Воскун C.E., 1985). Разовые измерения длины и диаметра клеток малоинформативны и способны охарактеризовать только морфологию клеток в данный момент. Вместе с тем, если провести эти измерения в динамике, используя материалы цеитрафернои микрокиносъемки, то можно описать индивидуальный цикл всех наблюдаемых клеток, измерив начальную длину (L0) и конечную длину (Ц). Следует отметить, что для клеток инокулята (т.н. первого поколения) практически все показатели Хо не вполне соответствуют именно нулевым показателям, поскольку нам неизвестно истинное время образования клеток до момента попадания на питательную среду и начала регистрации всех морфофизиологических показателей. Более точными и информативными, несомненно, будут показатели, снятые с клеток второго поколения, т.к. необходимое время образования клеток для расчета всех показателей нам известно. Однако, даже в случае первого поколения при особенно резкой смене среды обитания, информация о развитии первого поколения также будет важна и информативна, она способна дать представление о тенденции в развитии популяции, ее адаптивных реакциях.
При исследовании на клеточно-популяционном уровне нам потребовалось получение информации сразу о 25-150 клетках-представителях поколения клеток инокулята, а затем о 50-300 их потомках. Поэтому потребовалось определить основные показатели для клеток только в начале и конце цикла роста и использовать метод сигмум-морфометрии клеток (см.Глава 2).
После измерения базовых показателей (длины и диаметра всех клеток популяции, попавших в поле зрения микроскопа) в начале и конце цикла роста, мы будем иметь потенциально большую информацию, если эти результаты превратить в формализованные показатели, характеризующие интегральные морфофункциональные свойства как отдельных клеток, так и популяции в целом, приведенные в таблице 1.1. (см. в гл.1.5).
На Рис.3.1. представлены типичные фотоотпечатки различных моментов в динамике развития бактериальной популяции клеток Shigella flexneri S на этапе формирования микроколонии. Ранее (Кузнецов О.Ю., Смирнов К.К., 1990) было доказано, что разрешающая способность светового микроскопа с применением высококонтрастной пленки выше, чем она определена для светового микроскопа и человеческого глаза - она достоверна с точностью до сотых долей микрометра. Использование этого факта позволяет проводить достоверную морфометрию на фотоотпечатках, например, исследование кинетики развития одиночных клеток бактерий, при этом осцилляторные остановки роста клеток являются не ошибками измерений, а закономерными и достоверными. Однако, на наш взгляд, более важной является возможность снятия мгновенных морфометрических снимков развития бактериальной популяции, а измерения, полученные с этих снимков, могут охарактеризовать состояние популяции клеток в данный момент времени.
Все полученные данные при развитии клеток Shigella flexneri в стационарной микрокамере диффузионного типа (СКДТ) сведены в Таблицы 3.1 и 3.3.
Аналогичные результаты были получены также в экспериментах при использовании других оригинальных микрокамер - проточного типа (микрокамеры по A.C.N 1339123, 1987, Бюл.изобр. N 35, 1987 и A.C.N 1418668 Бюл.изобр. N 29, 1988). (см.Приложение) Полученные с их помощью данные представлены в Таблицах 3.5 -г- 3.10.
Полигоны распределений различных показателей (Lo; L ; Lk/L0) х, С) для развивающейся популяции клеток Shigella flexneri S и Rd (полигоны распределений приведены только для достоверно различающихся показателей). Полигоны распределений клеток по длине в конце цикла роста клеток инокулята и второго поколения изображены на Рис.3.2. Средняя длина исходных клеток во втором поколении значительно ниже у клеток R-формы. Средняя длина клеток в конце цикла роста уменьшается от S к Rd хемотипу. Различия по длине у исследованных штаммов статистически достоверны р 0,01). Существенное снижение (на 21%) Ц обнаруживается у S-штамма во втором поколении. Диаметр клеток исследованных штаммов к концу в первого поколения возрастает, но достоверные отличия установлены только для S.flexneri S. Вместе с тем, в конце второго поколения диаметр клеток уменьшается значительно и достоверно для обоих-штаммов S.flexneri S и S.flexneri Rd.
Влияние пектина на колонизационную активность микроорганизмов постоянных обитателей желудочно-кишечного тракта человека
Добавление в среду фильтрата 18-часовой культуры гомологичного штамма не изменяет средних значений структурно-адаптивного показателя LjJLo и х для клеток 3-часового инокулята при добавлении в среду 3-х и 18-часового фильтратов S.flexneri S в поколении инокулята. Популяция по этим показателям становится более однородной. Во втором поколении значения показателя Ц/І_0 уменьшаются относительно контроля, что свидетельствует о тенденции к ингибированию роста у части клеток популяции. Обнаружено во втором поколении уменьшение т клеток по сравнению с контролем.
Влияние метаболитов фильтрата 3-часовых культур на клетки S.flexneri S регистрируется уже в первом поколении, когда происходит активизация SOS-системы у части клеток. Использование в эксперименте фильтрата и инокулята одного возраста способствует сокращению т , особенно у клеток второго поколения. Таким образом, фильтратные добавки S.flexneri S различного возраста благоприятно влияют на клетки 3-часовой культуры S.flexneri S во втором поколении, где при наличии тенденции к ингибированию роста у части клеток популяции, определяемыми по структурно-адаптивному показателю Lk/Lo, происходит сокращение х клеток относительно данных контрольного эксперимента (Таблица 3.3).
Анализ данных Таблицы 3.8 свидетельствует о том, что при использовании фильтрата 18-часовой культуры S.flexneri Rd показывает, что происходит ингибирование основной части исходных клеток, судя по значениям показателей Lk/L0 и т.
В случае использования фильтрата 3-часовой культуры S.flexneri Rd наблюдается неблагоприятное влияние на клетки инокулята S.flexneri S, регистрируется ингибирование роста клеток, а во втором поколении рост клеток S.flexneri S полностью прекращается под влиянием веществ, содержащихся в фильтрате. Таким образом, воздействие фильтратов S.flexneri Rd на клетки S.flexneri S можно охарактеризовать как неблагоприятное, способствующее увеличению х клеток, особенно во втором поколении при фильтрате 18-часовых культур. Вещества фильтрата 3-часовой культуры S.flexneri Rd во втором поколении прекращают рост клеток S.flexneri S полностью (Таблица 3.8).
Из данных Таблицы 3.8 видно, что фильтрат 18-часовой культуры S.flexneri Rd неблагоприятно влияет на развитие исходных клеток, приводя к увеличению средних значений исследуемых показателей L /L0 и х клеток. Во втором поколении наблюдается тенденция к ингибированию роста клеток. Присутствие в среде фильтратной добавки 18-часовой культуры во втором поколении способствует уменьшению гетерогенности клеток по значениям показателя Lk/L0.
Влияние фильтратной добавки 3-часовой культуры в среду воздействует на клетки S.flexneri S благоприятно уже в первом поколении- уменьшается т клеток, но при этом наблюдается увеличение средних значений показателя Lk/L0 Во втором поколении х клеток также сокращено относительно контроля. Таким образом, фильтратные добавки S.flexneri Rd благоприятно влияют на развитие клеток S.flexneri S во втором поколении.
Анализ данных, представленных в Таблице 3.9 показал, что присутствие в среде фильтрата 18-часовых культур S.flexneri S способствует активизации SOS-функции первого порядка у клеток S.flexneri Rd первого и второго поколения относительно контроля (Таблица 3.3).
Так, при добавлении в среду фильтрата 3-часовых культур S.flexneri S наблюдается увеличение z исходных клеток S.flexneri Rd. Во втором поколении обнаружено стимулирование роста и развития во всех экспериментах с фильтратами. Структурно-адаптивный показатель Lk/L0 как в первом поколении, так и во втором меньше нормы, что позволяет говорить о тенденции к ингибированию роста клеток под влиянием метаболитов фильтрата 3-часовых культур.
Таким образом, установлено, что фильтрат S.flexneri S одного возраста с инокулятом (18 часов) стимулирует развитие клеток S.flexneri Rd, в первом и втором поколениях, судя по величине X. Добавление фильтрата 3-часовых культур неблагоприятно влияет на исходные клетки, но во втором поколении наблюдается уменьшение х клеток при тенденции к ингибированию роста.
Анализ данных, представленных в Таблице 3.9 показал, что средние значения структурно-адаптивного показателя Lk/L0 в исследованных поколениях в экспериментах с фильтратами по сравнению с контролем сходны при изучении адаптивного поведения клеток S.flexneri Rd (3-часовой инокулят) при добавлении в среду разновозрастных фильтратов культур S.flexneri S различного возраста. Добавление в среду фильтратов культур S.flexneri S различного возраста неблагоприятно сказывается на развитии исходных клеток, что проявляется в увеличении их т. Добавление в среду фильтрата 18-часовых культур несколько задерживает рост клеток относительно контроля (Таблица 3.4). Неблагоприятное влияние фильтрата 18-часовых культур на клетки характерно и для второго поколения, но отличия недостоверны. Особенно неблагоприятное воздействие оказывает фильтрат 3-часовых культур, вызывая полное ингибирование роста исходных клеток.
Таким образом, установлено, что фильтраты культуры S.flexneri S различного возраста неблагоприятно влияют на клетки S.flexneri Rd уже в первом поколении - происходит увеличение их -с и включение SOS-функции I порядка. Наблюдается тенденция к ингибированию роста клеток, судя по значениям показателя Ц/Lo.
Данные Таблицы 3.10, в сопоставлении с Таблицами 3.3 и 3.4 свидетельствуют о том, что фильтраты 3-х и 18-часовых культур S.flexneri Rd неблагоприятно влияют на исходные клетки S.flexneri Rd (18-часовой инокулят): происходит увеличение их т, активизация SOS-функции I порядка. Во втором поколении происходит сокращение х клеток относительно контроля (Таблица 3.3).
При использовании клеток 3-часового инокулята S.flexneri Rd вновь обнаруживается активизация SOS-функции первого порядка и увеличение значений т, как в первом, так и во втором поколении клеток при воздействии фильтратов 3-х и 18-часовых культур S.flexneri Rd, что может быть расценено как неблагоприятное воздействие в целом.