Клонирование генетических детерминант, локализованных на плазмиде pFra Yersinta pestis, и определение протективности кодируемых ими продуктов Яшечкин, Юрий Иванович

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время проводятся интенсивные исследования с целью разработки принципиально новых диагностических и профилактических препаратов для бактериальных инфекций, основанные на технике молекулярного клонирования различных генетических детерминант. Подобные исследования начаты и на чумном микробе: получены геино-ияженернш путем штаммы Е.соИ - продуценты известных Факторов вирулентности и иммуногенности этого микроорганизма (Гончаров Е.К., 1987; So-delndeO., eta!.. 1988, 198а; Price S.В.. etal.. 1989; Skur-nlk M.i Wolf-Watz H.. 1989; Гончаров а:Ю. с соавт.. 1989. 1993; Barve S.S.. etal. 1990; Llndler L. E.. etal.. 1990; Вєгрші Т.. etal., 1391; Булгакова. Ъ. Г., 1991; Филиппов А. А. с соавт. , 1991: Маракулин И. В., с соавт. 1991; Кириллина 0. А.. 1S92 и другие). Продолжаются исследования по определению роли этих антигенов в формировании невосприимчивости к повторному заражение лабораторных животных возбудителем чумы (Наумов А.В. с соавт., 1992). Полученные штаммы-продуценты антигенов чумного макроса приближают нас к создали» эффективной химической вакцины, но решение этого вопроса требует еще значительных усилий. Это обусловлено практически полной неизученностью подавляющего большинства антигенов.^-а их насчитывается у чумного микроба до 100 (Вейнблат В.И.. 1974). До сих пор не разрешен вопрос: воздействие какого дополнительного фактора необходимо, чтобы мощный ревакцинирующий эффект антигена фракция I (Белов Л.Г.. Лальвадянц СМ., 1939) стал вакцинирующим. Для ответа на этот вопрос необходим поиск новых генетических детерминат и

тестирование иммунологической активности кодируемых ими продуктов.

Многие из известных иммуногенных детерминант чумного микроба локализованы на плазмилах. в том числе и на самом большом внехромосомном репликоне - 100 kb ллазмиде pFra. Установлено, что на этой плаэмиде находятся гены, определяющие синтез "мышиного токсина" и антигена Фракция I. К настоящему времени эти гены достаточно хорошо изучены (Galyov Е. Е.. et al. 199Q, 1991; Черепанов П.А. с'соавт., 1991; Karlyshev А. V.. etal., 1992). Остальная же часть плазмиды pFra,' составляющая более 90 генетической информации этого репликона. обладающего большой кодирующей емкостью, представляет собой сплошное "белое пятно". В большинстве исследований, предметом изучения служат плазмиды pFra ю родственных океанических штаммов: У. pest is EV (Гончаров А.Ю. с соавт.. 1989; Galyov Е. Е. etal.. 1990, 1991; Черепанов П.А. с соавт.. 1991). и У. pe3tts-A1122 (Шишкина 0. Г.. 1990, Кириллина 0.А.. 1992). Выбор штамма У. pestts EV понятен. так как он широко применяется как противочумная вакцина. Естественным было бы продолжить в сравнительном плане исследование структурно-функциональной организации репликона pFra штамма другого происхождения , использующегося в качестве эталона вирулентности, - континентального штамма Y. pestls 231.

Все вышеизложенное определяет актуальность настоящего исследования.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - молекулярное клонирование локализованных на плазмиде pFra У. pest is 231 генов и определение протективной активности детерминируемых ими продуктов.

1. Построить рестрикционную карту ДНК плазмиды pFra штамма У. pes Us 231 с использованием эндонуклеаз рестрикции Вага-HI. НШШІ. Smal. Xbal. Xhol. EcoRI.

2. Провести сравнительный анализ рестрикционных карт плазмид pFra штаммов У. pestts 231, У. pestts А1122. У. pesits EV76.

3. Получить библиотеку генов плазмиды pFra штамма V. pes-tls 231 s плазмидных векторах.

4. Локализовать клонированные гены на рестрикционных картах плазмид pFra штаммов У. pestts 231 и У. pestts А1122.

5. Охарактеризовать продукты клонированных генов б составе реципнентных штаммов чумного микроба и кишечной палочки по молекулярной массе, антигенной активности и протективностн для белых мышеи.

6. Впервые построена рестрикционная 'карта ДНК плазмиды pFra штамма У. pestts 231 для эндонуклеаз BamHI, HindiII. Smal. Xbal, Xfiol, FcoRI и, частично,' для зндонуклєази SalGI. Уточнена рестрикционная карта ДНК плазмиды pFra штамма У. pestts АИ22 для эндонуклеаз BamHI. fltndlll, Smal, Xbal; дополнена сайтами для эндонуклеаз Xhol. EcoRI и. частично, для SalGI.

7. Проведен сравнительный анализ рестрикционных карт плазмид pFra штаммов У. pestts 231. У. pestts 358/12. У. pestts А1122. У. pestts EV, показавший консервативность молекулярной структуры плазмид pFra этих штаммов. Отличия структуры репликрнов pFra< океанических штаммов от структуры этих плазмид континентальных Штаммов заключаются в инверсии двух областей

плаамидной ДНК и делении фрагмента ЛНК размером около 3 kb.

ъ. Впервые клонированы до настоящего времени неизвестные гены г/р.заидц ррга. определена их локализация на рестрикциои-ных картах плаэмид рГга штаммов Y. pestts 231 и У. pestts АИ22. Гены кодируют не менее 10 белков, молекулярной массоП от 11.3 до 105,6 kDa., В реципиентном штамме У. pestts (pCad*. pPst*. pFra") эти белки характеризуются низкой антигенной активностью и не облададт протективность» для белых мьией.

8. Депонированы в Государственной коллекции бактериальных возбудителен инфекционных заболеваний 1-11 групп патогенносте (РосНКПЧИ "іілкроб". г. Саратов) семь генетически маркированных штаммов кяшечной палочки, содержащих рекомбинантные плазмидн -с клонированными ранее неизвестными генами плазмидн pFra штамма Y. pestts 231.

9. Методические рекомендации " Использование коммерческого препарата иммуноглобулинов диагностических чумных антикап-сульных моноклональиых люминесцирующих сухих для проведения иммунодот-анализа" одобрены Ученым Советом и утверждены'директором РосНИПЧИ "topoG"_ (Протокол-N5. от 19 апреля 1994 г.).

10. Метод определения элзктрофоретической подвижности микробных клеток в свободном потоке жидкости рекомендован в качестве способа скрининга библиотек генов. Данный способ применяется при выполнении экспериментов по-плановым НИР для анализа библиотек генов хромосомы чумного микроба научными подразделениями РосНИПЧИ "Микроб".