Введение к работе
Актуальность проблемы. Югаепчееюю исследования чрезвычайно
важны для углубления ваших знаний о биологии отдельных видов микро
организмов, так как они позволяют выяснить особенности нхповедения
и количественно оценить интенсивность метаболизма в мевяпвнхся-ус
ловиях окружающей среды. №евяо ростовые характеристики определяют
своеобразие распространения микроорганизмов в разных почвахи-в
разных генетических горизонтах» влияние'их на почвообразовательные
процессы (ЗаварзннДЭТб; Паников,Звягинцев,1983). От "ростовых ха--
рактериствх si; яоит всход конкуренттис взаимоотношений в ходе фор
мирования естественных сообществ (Печурквн,1978). Представление
результатов изучения особенностей роста иикробвоВ популяции в ви
де кинетических в стехнометрнческях показателей, таких как вкояо-
мвческий коэффициент, константа насыщения; иакоимальвая удельная
скорость роста^коэффициент поддержания жизнедеятельности, метабо
лический коэффициент н т.д.» имеет очевидные преимущества по срав
нении с традиционными способами (например, графическимизображе
нием ростовой кривой) в силу того, что оно предполагает знание оп
ределенного вяла функциональной зависимости между условиями гуль-
тивнроваяия н состоянием микробной популяции, а также позволяет
прогнозировать динамику ростовых процессов, исходя из условий сре
ды (Перт,1978). К сожалению, до сих пор кинетические наследования
были ограничены относительно кратким списком микроорганизмов, пред
ставлявших интерес с точки зрения микробиологической промышленнос
ти в медицины. Почвенные микроорганизмы почти не затронуты такими
исследованиями. '.'
Цель работы: изучение кинетики роста почвенных бактерий, занимающих разные экологические ниши, для выяснения особенностей стратегии их взаимодействия с окружавшей средой. . .
Основные задачи исследования. I. Изучение кинетики роста бакте
рий (образования биомассы н потребления субстрата) в периодической
культуре. '-.
2* Изучение кинетики отмирания и автолиза бактерий при длительном голодании.
-
Изучение кинетики непрерывного роста бактерий в хемостате (образования биомассы, потребления субстрата н кислорода) в условиях лимитирования по'источнику углерода (и энергии) н азота.
-
Изучение взаимосвязанных изменений скорости росте микробной популяции я морфологии клеток.
Научная новизна. Проведено детальное кинетическое исследование достаточно широкого круга почвеннах бактерий и выявлены особенности кинетики роста, связанные с дифференциацией экологических ниш
.-':. г
природных бактериальных гапуляцжй. Впервые показала возможность ко-личествевнаго олисаиия и предсказания динамики отмирания: голодапівх ' мифооргалвзмов, продемонотрироваяа нвтрЕВвальнооть кинетики роста іюримеподоаїшх бактерия, получив раэвнтвв я яашлв дополнительное экаперниентальаое подтверждение новая кинетическая модель, связы-. жавядая скорость роста микроорганизмов с внутриклеточной концентрацией активных центров, играющих роль "узкого меота" в метяболпзмв лимитирующего оубстрата, измерены важнейшие кинетические и ствхво-метрические константы, характеризующие рост исследованных бактерий: ішход биомассы на единіщу потребленной глюкозы, азота ж кислорода, яозффицлент поддержания, конотаята насыщения, максимальная величина удельной скороота потребления гдижоэа в киздорода,. удельная скорость роста, морфомвтрическне показатели и т.д.
Црактвчеокоа значение. В дяосертацжв разработан новый сдособрод** ределения мнтеноивнооти дыхания микроорганизмов в непрерывной культуре, который может быть рекомендован для широкого использования в практике микробиологических исследование. Выявленные в работе коли-' чеотвеюшв закономерности роота почвенных бактерии могут быть ио-' шш,вовакц в биотехнология для разработки оптимальных режимов выращивания бактериальных культур - продуцентов практически важных метаболитов, а также для аоздаяня высокоэффективных бактериальных удобрений, материалы диссертации используются на факультете почвоведения МГУ нм.М.В.Ломоносова при чтении лекций по курсам "Экология почвенных микроорганизмов" "Основы биологической кинетики".
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на заседании ШО (1980г.), на III Всесоюзном совещании по управляемому культивированию микроорганизмов (Киев,1981г.), а также на заоеда-нав кафедры биологии почв ИГУ (І98ІГ,),
Публикации. Ш> теме диссертации получено 2 авторских свидетельства в опубликовано К работы.
р4%9ч работы.' Диссертация состоит из введения, обзора литературы,' описания использованных методов, 2 глав, заключения в выводов, содержит 141 страницу машинописного текста, 36 рисунков, 10 таблиц в список литературы из 224 названий (из нвх 151.- зарубежные).
Автор выражает искреннее признательнооть м.м.с. Н.С.ШНикову «а помощь прщ проведения работы, а также от.н.с. Г.А.Бовараеьой.И.Н. Скворцовой, м.н.о.Т.Г*Добровольакой я Л.В.Лыеак за любезно предоставленные культуры бактерий.
ОБЪЕКТА И МЕТОДЫ ИОйВДОВШН В работе использованы следуадк» культуры бактерии:: u»eliiu« ubtllla 428 (получена на BUM ІШГАН СССР)* Як1мЪ1ш »lliotl A3 (подучена IS ИЩ АЯ CCCP)j Arthrob*et«r eloblforele Cj-4, nhedo-ceeeu* «nrthropoll* 61X, Klerbmceue ««Ills 6Ш, PstudoBona* n»or«*o«n« 312 (волучева вз коллекции кафедр» баологш почв ЫГ7>* Культури бактерия поддерживали на ыяоо-пеогоавсш агаре (1:10) и агаряэевавном бобовом отваре, в олуше клубеньковых баютермй,;о ажв-'месячными пересевами на свежую питательную среду. Для кинетических «оследовавий применяли синтетическую среду здедующего состава ( ь «/<>: глюкоза - 200-1000} (HH4)2S04 - 400-100} KOjP04 - I00t KgB-P04 - IOOOj U«*>4*?%Q - X00iC8Cr2*2BnO-20; 01804*5^0—0.04} Kt - 0,1; їеСІд'бЙдО "- 0,4; lfc304>4%5 - 0,4}Ha^to04'2%0 -0,2; znso^HgO —0,4; борная кислота -0,5; ЗІДТЛ-яа - 3,0; pH—7,6. -В качестве источника азота вместо (кН4)г 04 испольаоаали аопарагвв (500 иг/л) для H.Mllloti я пеотоя (600 ыг/л) дляв^вдіїі* .В . питательную среду для выращивания B.euUiii* шв.иНіви допол-ввтельво вносили в качестве стимулятора роста дроаевої »котрМт:
(0.01 мг/д).
В непрерывной культуре бактерия выращивали в цельвостекллнвоа ферментационном, сосуде объемом 250-Б00 мл а рубашкой для термоста-тярунпея жядкооти в сливом по уровни, перемешявавяв среди осущеотв-лялх магнитной мешалкой №-, пнтатеяьиу» ареду дозировали о помощью перистальтического насоса Томрвп" в 3-31 (Польша), диапазон скоростей подачи питательной среды - 3-100 мл/чао.
Описанную установку использовали также для выращивания микрорга-вявмов в периодическом режиме (при отключения подачи пнтательяоі среды). Периодическое культивирование проводила, хроме того, в хруглодониых колбах т 750 мл с ватными пробками ва качалке (180-об./мнн)»
В качестве внокулята использовали однооуточяув веряодячесяур культуру, полученную ва основной синтетической среде, Культввиро-вавве проводили вря 28*0,1С (для B.egiiie .арщ 2С4о,1!В), реакция среди прв всех скоростях разбавления оставалась врябляиительво- ва одном к той же уровне (рВ 6,8-7,5)- без инструментального коятроля.
Контроль аа биомассой осуществлял* путем измерения оптячеожсй /иотвоотв клеточной суспензия ва спектрофотометре СФ-гбд-OGJ ври : длине волны 410 вм. По достижения культурой стацвоварвого состояния при данной скорости разбавления определяли количество вукоА' биомассы весовым методом с использованием мембранних фяль*ро» -Смл-пор" (размер пор 0,24 boat).
Для определения размеров клеток их фотографировала под макроско- пом МБИ-І2 с фазовым контрастом (объектив 90х); размеры клеток измеряла о фотоотпечатков (общее увеличение ДООООх).
Жизнеспособность клеток.определяли методом млкрокультур (poatge-t«,I976).
Интенсивность дыхания бактерий в отбираема* аз ферментера пробах измеряли полярографические о кнслородяым электродом Кларка (Щодьц, Островский,1ЭТ8). Кроме того, был разработан специальный метод измерения внтенсввиоотв потребления кислорода непосредственно в фер- . ментерв, для чего нспользовалн стерилизуемый автоклавироваяием датчик растворенного кислорода (Паников,Бондаренко,1981).
В фильтрате хемостатной культуры определяли концентрации ашонвя о фенолом и гипохлоритом и глюкозу - энэпматнческим методом (Шербу-хин в др*Д975) о глюкозооксидазо Я (Львовский завод баклрепаратов) и перокондааой СЪ*»я«а ".Венгрия).
Результаты исследований обработаны статистически с использованием эга "мир-г".
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУДЦДШЕ '