Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Эколого-физиологические особенности коринеформ б
1.1. Распространение в природе 6
1.2. Шизико-химические условия существования коринеформ 9
1.3. Азотное и витаминное питание II
1.4. Использование источников углерода 12
1.5. Олиготрофия 13
Глава 2. Катаболизм ароматических соединений коринеформами 16
2.1. Ароматические соединения в качестве единственного источника углерода для коринеформ 16
2.2. Трансформация ароматических соединений коринеформами 18
2.3. Подготовка ароматических соединений к разрыву кольца 20
2.3.1. Дигидроксилирование кольца , 21
2.3.2, Модификация заместителей водорода в кольце 22
2.4. Расщепление ароматического кольца и последующие реакции 24
2.4.1. Путь 3-кетоадипината . 24
2.4.2. Мета-путь подготовительного метаболизма пирокате-хинов 26
2.4.3. Расщепление; колец гентизинових кислот 27
2.4.4. Особенности метаболизма ароматических соединений коринеформами 28
Глава 3. Регуляция синтеза ключевых ферментов катаболизмаароматических субстратов , 30
3.1. Регуляция синтеза ферментов орто- и мета-пути у псевдомонад 30
3.2. Регуляция синтеза ферментов орто-пути у коринеформ 36
3.3. Ключевые проблемы регуляции . 37
Экспериментальная часть
Глава I. Материалы и методы исследования 41
1.1. Микроорганизмы и методы их культивирования 41
1.2. Изучение регуляции биосинтеза ферментов 43
1.3.Определение активности ферментов 44
1.4. Аналитические методы 47
Результаты и их обсуадние!'-;
Глава 2 . Ароматические соединения как источники углерода для родококков 49
2.1. Ауксанографический анализ коллекционных штаммов 49
2.2. Таксономическое положение активных штаммов родококков 5с
2.3. Особенности роста родококков в жидких средах с ароматическими субстратами 55
2.4. Потребности родококков в макроэлементах питания 60
Глава 3 . Ключевые ферменты катаболизма ароматических субстратов у родококков 65
3.1. Ключевые оксигеназы пути 3-кетоадипината 66
3.2. Метапирокатехаза 72
3.3. Гентизинат-1,2-диоксигеназа 76
3.4. Диоксигеназы гомогентизината и гомопротокатехоата 78
Глава 4 . Регуляция синтеза диоксигеназ ароматических субстратов у родококков 83
4.1. Индукция синтеза пирокатехазы 84
4.2. Индукция синтеза протокатехоат-3,4-диоксигеназы 88
4.3. Индукция синтеза' метапирокатехазы 89
4.4. Регуляция синтеза гентизинат- и гомогентизинат-диокси-геназ 97
Глава 5. Функционирование диоксигеназ ароматических субстратов у родококков в экспериментальных условиях, близких к естественным , 102
5.1. Синтез диоксигеназ орто- и мета-пути при лимитировании родококков по макроэлементам 102
5.2. Функционирование диоксигеназ орто-пути при длительном голодании родококков 106
5.3. Синтез и активность диоксигеназ ароматических субстратов в присутствии дополнительных субстратов неароматической природы ИЗ
Заключение 118
Вывод! 123
Литература 125
- Шизико-химические условия существования коринеформ
- Ароматические соединения в качестве единственного источника углерода для коринеформ
- Микроорганизмы и методы их культивирования
- Ауксанографический анализ коллекционных штаммов
Введение к работе
Актуальность работы. Накопление в окружающей среде труднораз--лагаемых и токсичных химических соединений приводит к серьезным нарушениям круговорота веществ в биосфере. Это является следствием неконтролируемого поступления отходов промышленности и интенсивной химизации сельского хозяйства.
К наиболее устойчивым и опасным для биосферы соединениям относятся ароматические углеводороды. Они являются основными фрагментами молекул лигнина, таннина, терпенов и алкалоидов, входят в состав нефти. В больших количествах фенолы, крезоли, ксилено-лы и ароматические кислоты образуются при высокотемпературной карбонизации угля, используются в химической промышленности для синтеза резины, пластмасс, фунгицидов, инсектицидов, гербицидов^ антиоксидантов и медикаментов. Ароматические соединения являются побочными продуктами нефтяной промышленности и многих производств. В связи с этим, в настоящее время особую актуальность приобретает изучение возможностей микроорганизмов в трансформации и полной минерализации указанных соединений.
Изучение механизмов адаптации бактерий к ароматическим соединениям на уровне регуляции ферментов имеет большое теоретическое значение, т.к. от этого зависит успех решения всей проблемы взаимодействия живых клеток с чужеродными субстратами. Знание этих механизмов представляет и большой практический интерес для интенсификации микробиологической очистки окружающей среды, для получения ценных ароматических соединений путем микробиологического синтеза, для эффективного использования отходов производства и, в частности, получения кормового белка при выращивании бактерий на техническом лигнине.
Интересным, но мало исследованным объектом для изучения процесса взаимодействия бактерий с ароматическими субстратами являются родококки - коринеформы рода Rhodococcus » отличающиеся, по немногим литературным данным, особой активностью в отношении указанных соединений, повсеместным распространением в природе, крайне разнообразными физиологическими возможностями и необычайной пластичностью обмена. В микробиологической промышленности широко используются штаммы коринеформ - сверхпродуцентов аминокислот и нуклеотидов, однако, возможности применения этих бактерий еще далеко не исчерпаны.
Родококки привлекают особое внимание и выгодно отличаются от остальных микроорганизмов вследствие таких своеобразных экологических черт, как принадлежность к автохтонной микрофлоре, длительное сохранение жизнеспособности в неблагоприятных условиях, способность к фиксации азота, психрофилия, термотолерантность, способность функционировать в олиготрофных условиях, типичных для природных экосистем. Поэтому взаимодействие коринеподобных бактерий рода Rhodococcus с ароматическими соединениями и выбрано в качестве объекта данной диссертационной работы. . Цель и задачи исследования. К настоящему времени в литературе имеется значительная информация по биохимии и энзимологии путей деградации ароматических соединений микроорганизмами. В последние годы начаты исследования регуляции метаболизма этих соединений. Однако, вся эта работа главным образом была выполнена на псевдомонадах. Окисление ароматических соединений другими микроорганизмами, в том числе, родококками, систематически не изучалось и отражено лишь в единичных работах.
Для современной микробиологии характерно возрождение интереса к экологии бактерий, что связано с запросами биотехнологии, кото-
рая ставит перед наукой такие задачи, как прогнозирование судьбы в экосистеме введенного в нее искусственно созданного штамма или соединения, анализ конкурентных отношений в смешанных популяциях, разработка принципов и методов целенаправленного воздействия на активность микрофлоры природных биоценозов. Для ответа на эти вопросы необходима точная и адекватная характеристика экологической ниши микроорганизма, под которой понимают совокупность физико-химических и биологических факторов, обеспечивающих наиболее благоприятные условия для развития микроорганизма с определенным типом обмена веществ, который, в свою очередь, определяет его место в цепи питания и способность к конкуренции за доступные субстраты.
В литературе описаны микроорганизмы, разлагающие ароматические соединения в чистой культуре в лабораторных условиях, причем, для этого нередко требуется сложный комплекс факторов и изменение их во времени. В природе же способность микроорганизма к разложению стойких ксенобиотиков может не проявиться из-за отсутствия необходимых условий. Литературные данные о том, как происходит деградация ароматических соединений в условиях природных биоценозов и какие бактерии ее осуществляют, практически отсутствуют.
В связи с этим, в настоящей работе впервые предпринята попытка систематически исследовать катаболизм ароматических субстратов ро-дококками и оценить их возможности при деградации указанных соединений в естественных местообитаниях. В частности, задачи данной работы были следующие:
1. Отбор активных штаммов родококков, способных использовать
в качестве единственного источника углерода широкий спектр арома-тических соединений.
2. Изучение состава ключевых ферментов катаболизма различных
ароматических субстратов у нескольких штаммов родококков разных
видов.
Изучение особенностей регуляции синтеза ферментов, расщепляющих ароматическое кольцо.
Исследование функционирования ключевых диоксигеназ ароматических соединений у нескольких штаммов родококков в условиях, близких к естественным, а именно - при лимитировании по основным питательным компонентам среды, при длительном культивировании в олиго-трофных условиях с плохой аэрацией, при внесении в среду дополнительных источников углерода наряду с ароматическим субстратом.
Научная новизна. Впервые систематически исследован катаболизм ароматических соединений коринеформами рода Rhodoooccus в оптимальных условиях и в условиях, близких к естественным.
Изучение состава ферментативного аппарата у 7 штаммов родококков, принадлежащим к разным видам, показало, что эти микроорганизмы обладают ключевыми диоксигеназами всех известных путей деградации ароматических соединений. Наибольшая часть субстратов мета-болизировалась по пути 3-кетоадипината. Некоторые штаммы при росте на п- и м-крезолах имели метапирокатехазу, ранее считавшуюся нехарактерной для родококков. Впервые для этих микроорганизмов показана возможность метаболизма м-оксибензоата по пути расщепления кольца гентизиновой кислоты, а оксифенилуксусных кислот - по пути расщепления колец гомогентизиновой, протокатеховой и гомопротока-теховой кислот.
Установлено своеобразие регуляции синтеза ключевых диоксигеназ ароматических субстратов. В частности, впервые описана индукция синтеза метапирокатехазы нитрофенолами. Впервые показано, что синтез протокатехоат-3,4-диоксигеназы у разных штаммов родококков индуцируется по-разному, следовательно, в данной группе микроорганизмов, в отличие от всех других, система контроля ферментов орто-пути не может служить таксономическим критерием.
Впервые показана принципиальная возможность функционирования ключевых диоксигеназ пути 3-кетоадипината у пяти штаммов родокок-ков в олиготрофных условиях.
Практическая ценность. Отобраны и исследованы штаммы коринеформ рода Rhodococcus , способные активно разлагать ароматические субстраты в условиях, типичных для природных экосистем. Эти микроорганизмы выгодно отличаются от других бактерий и, в частности, псевдомонад, способностью)к азотфиксации, к запасанию и эффективному использованию эндогенных фосфорных соединений, что позволяет им длительно оставаться жизнеспособными в олиготрофных условиях. Перечисленные свойства наряду с высокой толерантностью к фенолам дают родококкам неоспоримые преимущества перед другими микроорганизмами при использовании для очистки промышленных сточных вод с повышенной концентрацией токсичных ароматических соединений.
Многообразие энзиматическюсвозможностей родококков может быть использовано для препаративного получения ценных ароматических кислот, а также для получения кормового белка при утилизации технических отходов, содержащих ароматические соединения.
Полученные данные по регуляции синтеза ключевых ферментов подготовительного метаболизма ароматических субстратов могут быть использованы для понимания процессов взаимодействия микроорганизмов с чужеродными соединениями.
Шизико-химические условия существования коринеформ
Коринеподобные бактерии могут существовать в широком диапазоне физико-химических условий. Так, по отношению к кислороду-, родокок-ки и артробактеры ".являются строгими аэробами, некоторые патогенные коринебактерий - строгими анаэробами ( 169 ), а многие микробактерии, корине- и куртобактерии - факультативными анаэробами ( 143, 206 ).
В отношении температуры большинство сапрофитных коринеформ являются мезофилами, однако, имеется много сообщений о психрофилиит у представителей этих микроорганизмов. Так, согласно работам советских исследователей, в северных и тундровых почвах СССР обычны облигатные психрофильные коринеформы, не растущие при 28-30С ( R.erythropolis,A.globiformis,A.pascens,A.aurescens )» в умеренных и южных широтах распространены факультативные психрофилы ( R. luteus ), способные к росту при 0С, в связи с чем их численность высока при высеве из почв в зимний период ( 21,22 ). Имеются сообщения о выделении облигатно психрофильного A. glaciales из ледниковых слоев ( 102 ), растущего при 0С и не выдерживающего температуры выше 18.
В экспериментальных условиях коринеподобные бактерии способны развиваться в широком диапазоне рН - от 4,5 до 9 ( 18 ), что объясняет их распространение в различных типах почв. Одной из уникальных особенностей родококков и артробактеров является их высокая устойчивость к высыханию. Так, в условиях эксперимента в высушенной почве коринеформы в течение нескольких месяцев сохраняли жизнеспособность, когда из других бактерий выживали лишь спороорбразующие ( 144,135 ). Согласно данным Бойле-на, около 50% клеток A. crystallopoietes были жизнеспособны после б месяцев инкубации в сухом песке ( 51 ). Проведенные в этих условиях исследования метаболической активности показали, что около 0,0005% углерода клеточной массы превращается в СОо.в течение часа, что соответствует времени полужизни в песке около 12 лет (52).
Хотя многое остается пока неясным, резистентность коринеформ к длительному голоданию, по-видимому, связана со способностью строго регулировать скорость катаболизма эндогенный резервных макромолекул ( 133 ). Так, было показано, что при культивировании в фосфатном буфере до 70% клеток A. globiformis, В. linens, M.rhodo-chrous и ряда других коринеформ сохраняют жизнеспособность в течение 56 суток голодания, не изменяя формы и размера. Однако, все эти организмы резко снижали активность дыхания до 1% по сравнению с исходным, окисляя 0,01 - 0,03% клеточного углерода до С0 в час ( 54 ). Аминокислотный пул снижался до половины в процессе голодания, содержание ДНК не изменялось, FHK - снижалось с различной динамикой у разных видов ( 52,178 ). Потеря веса клеток скла - II давалась из снижения содержания полисахаридов, белка, РНК и жирных кислот, но эти параметры не коррелировали с потерей жизнеспособности ( 173). Микроорганизмы других таксонов, не образующие! эндоспор, с такой уникальной способностью к длительному голоданию не известны. Так, согласно литературным данным, в условиях голодания псевдомонады сохраняют жизнеспособность в течение 84 часов, энтеробактерии - 36 часов, аэробактеры - 45 часов ( 53 ).
Потребности коринеформ в источниках азота весьма гетерогенные Многие представители этой группы усваивают неорганический азот в отсутствие витаминов - артробактеры и нокардии ( 17,194 ). Некоторые коринеформы растут не средах с неорганическим азотом только в присутствии витаминов и аминокислот - это, в основном, организмы, выделенные из молочных продуктов и организмов животных ( 72, 158 ), некоторые родококки, а также до 9СЖ почвенных и до 30# выделенных с растений коринеформ.
Коринеподобные бактерии, нуждающиеся в органическом азоте, используют такие соединения, как аминокислоты, белки ( 120,144,145 ), атропин, холин, мочевину, аллантоин и гетероциклические вещества ( 17, 109, 121 ). Многие артробактеры и родококки развиваются при низких концентрациях источников азота, т.е., являются олигонитрофилами ( 16 ). Способность фиксировать молекулярный азот также характерна для многих этих микроорганизмов ( 14,16, 99, 182 ). По данным Квасни-кова с соавторами, родококки и артробактеры, выделенные из почв Украины, фиксировали молекулярный азот при росте на н-алканах с продуктивностью 2 - 6 мг азота на грамм потребленного углеводорода. На средах с сахарами и ацетатом эффективность процесса была ниже ( 16 ).
Уникальной способностью к автотрофному росту в атмосфере Оп, Hg .и COg с солятш обладает Nocardia орасаІВ, одновременно фиксирующая молекулярный азот ( 99 ). Витаминные потребности коринеподобных бактерий неоднородны. Многие артробактеры, куртобактерии, целлюломонады нуждаются в отдельных витаминах - тиамине, рибофлавине, Bj2 и пантотеновой кислоте, или в их комплексах ( 118,158 ).
Сложнее потребности в факторах роста у коринеформ, выделяемых из клинических образцов, молочных продуктов, и у патогенных видов. Для некоторых этих микроорганизмов необходим холин, твин, пурины, пиримидины, липоат или гемин ( 103,168 ).
Было показано, что некоторые артробактеры и, в частности, Arthro-bacter terregens , требуют для нормального развития фактор неизвестной природы, названный terregens -фактором. Позже было установлено, что он мог быть заменен копрогеном и феррихромом -соединениями группы сидераминов. Биологическая роль последних изучена недостаточно, есть лишь отдельные указания на то, что они выполняют роль носителей железа в микробном метаболизме и участвуют в его транспорте в клетку ( 151 ). Родококки, по литературным данным, весьма неприхотливы в отношении факторов роста. Только отдельные штаммы нуждаются в тиамине ( 140 ). Следует отметить, что при хранении не в лиофилизированном состоянии питательные потребности могут меняться ( 107 ).
Ароматические соединения в качестве единственного источника углерода для коринеформ
Коринеподобные бактерии, по данным многих исследователей, способны использовать соединения ароматической природы в качестве единственного источника углерода и энергии. Однако, указанная способность у представителей разных видов и родов :имеет существенные различия. Наиболее активными в отношении этих соединений являются : родококки, артробактеры и микобактерии ( 6-9,31,100,166 .).
Лучшими ростовыми субстратами для этих микроорганизмов являются наиболее простые окисленные ароматические соединения, такие как фенолы или ароматические кислоты ( 146,181,184 ).Представители артробактеров и нокардий выявлены среди углеводо-родусваивающих микроорганизмов целинных почв и залегающих глинистых сланцев ( 123 ), речной воды ( 129 ). Стевенсон показал, что около &ЭА почвенных артробактеров развиваются на двух и большем количестве из взятых в опыт ароматических субстратов. Штаммы, менее требовательные в отношении факторов роста, более активно растут на ароматических соединениях ( 187 ).
При изучении распада фенола в активном иле было установлено, что развивающаяся в нем микробная флора представлена преимущественно видами артробактеров ( 144 ), хотя производные фенола с нит-ро- и аминогруппами не используются в качестве источника углерода ( 146 ).
Восстановленные ароматические углеводороды, как правило, большинством коринеформ не утилизируются. Описаны лишь единичные штаммы родококков, артробактеров и коринебактерий, растущие на средах с бензолом и толуолом ( 41, 126 ).
Отдельныее коринеформы способны использовать фенилалканы в качестве единственного источника углерода. Так, описана нокардия, разлагающая полностью фенилдодекан ( 177 ). В последние годы появилась серия статей немецких авторов по изучению метаболизма различных ароматических соединений у нсюаг-dia sp.DSM4325I, позже идентифицированного как Rhodococcus ruber . Этот родококк способен использовать очень широкий спектр ароматических соединений в качестве единственного источника углерода (мо-но- и диалкилфталаты, ванилин, 4-окси- и 4-метоксибензоаты, фенол, салицилат, 4-оксифенилацетат ). Кроме того, в условиях соокисления этот штамм деградирует фенолы с чужеродными заместителями ( хлор-, метилтио-, метилмеркаптофенолы ), образующиеся в почвах при гидролизе органофосфорных и метилкарбаматных инсектицидов (83-85, 164 ).
Описаны коринеформы, способные полностью утилизировать карбок - 18 -сианилидные фунгициды ( 42 ), бифенил ( 199 ), 4,6-динитрокрезол ( 120 ), 3-нитрофенол ( 50 ). Известны нокардии, осуществляющие полную деградацию метилцик-логексанов ( 200 ), пиридина ( 208 ), нитробензола ( 207 ), 2,4-дихлорфеноксиацетата ( 40 ), п-нитробензоата ( 61 ), 2-фтор-4-нитробензоата ( 59 ), 4-хлорбензоата ( 128 ).
Таким образом, коринеформы могут играть весьма существенную роль в полной минерализации природных и чужеродных ароматических соединений, труднодоступных для других микроорганизмов.
При рассмотрении реакций подготовительного метаболизма ароматических соединений микроорганизмами необходимо различать два типа процессов: реакции частичного превращения субстратов как начальный этап процесса их полной деградации и реакции накопления продуктов частичного превращения, далее не метаболизируемых.
Ряд авторов считает, что реакции последнего типа (реакции трансформации) являются отличительной чертой коринеподобных бактерий и, в частности, родококков, тогда как псевдомонады чаще используют ароматические субстраты в качестве источника углерода ( 100,167 ).
Известно, что наличие в ароматическом кольце таких чужеродных заместителей, как нитро-, амино-, хлор- и сульфоновокисные группы, сильно повышает резистентность бензольных соединений к микробной деградации или вообще исключает возможность атаки ( 38, 191 ). В связи с этим, в последние годы резко возрос интерес исследователей к взаимодействию микроорганизмов с несколькими субстратами ( кометаболизму ). В условиях кометаболизма бактерии и актиномицеты оказались способны трансформировать множество чужеродных соединений, неатакуемых в отсутствие косубстрата. Незна - 19 -чительные перестройки молекул ксенобиотиков ( деметилирование, дезаминирование, гидроксилирование ) часто полностью снимает их токсичность или приводит к образованию фенолов, пирокатехинов, которые легко могут метаболизироваться другими бактериями. Исчерпывающий обзор литературы по этому вопросу содержится в монографии Скрябина и Головлевой ( 31 ).
Чаще других микроорганизмов в обширной литературе по трансформации ароматических соединений упоминаются артробактеры, бреви-и коринебактерии, а также родококки и нокардии ( 7-Ю, 30-33,100 ). Так, описаны нокардии, окисляющие толуол до метилмуконата (119), п-ксилол - до толуилата ( 166 ), 2,3-диокси-п-ксилол или 3,6-диме тилпирокатехин - до диметилмуконата ( 166 ). Известны Mycobacterium rhodochrous, Nocardia corallina, N.minima $ способные модифицировать толуол, о- и м-ксилолы до толуилата и бензоата при росте на н-гексадекане ( 166,167,119 X.ffocardia salmonicolor превращала нонилбензол и н-додецилбензол в фенилпропионат и фенил ацетат ( 79 ), а две неидентифицированные нокардии окисляли фенил-додекан, фенилпентан и фенилгептан в фенилбутират, фенилвалерат и фенилгексаноат ( 43 ).
Описаны артробактеры и нокардии, гидроксилирующие 4-хлорфенил-ацетат, хлорбензоат и хлорфеноли ( 49 ), трансформирующие верат-ровую, п-метоксибензойную кислоты и их хлорпроизводные до карбок-си-цис,цис-муконата и соответствующих хлорокси- и хлорметокси-кислот ( 70 ). Большая работа проведена в 1ШМ АН СССР с 220 коллекционными штаммами нокардии и родококков, неадаптированных к ксенобиотикам. Показано, что ни один из них не растет на бензоле, толуоле, ксилоле, триметилбензоле, циклогексане и метилпиридинах, но 72 % исследованных штаммов трансформируют эти соединения в ароматичес - 20 -кие кислоты, фенолы и муконаты в соокислительных условиях ( 30-33,100 ). В лабораториях указанного института широко используются способности к трансформации ксенобиотиков у штаммов Nocardia corallina IA и Nocardia sp. B-293 ИБШ, которые в условиях ко-метаболизма окисляют ксилолы, хлор-, нитро- и окситолуолы, метил-нафталины и метилпиридины, ацетилируют аминотолуолы и 2-хлор-4-аминотолуол, трансформируют феноксиалкановые кислоты ( 6,31,32, 10,100 ).
Микроорганизмы и методы их культивирования
Объектами исследования служили 64 штамма родококков из коллекции лаборатории физиологии роста микроорганизмов ЙБФМ АН СССР. Штаммы были выделены главным образом из почв различных географических зон СССР, в некоторых случаях, пропитанных нефтепродуктами, либо из пресноводных водоемов и идентифицированы по определителю Берги ( 48 ) и работе Гудфеллоу и Олдерсон ( 101 ). В частности, штамм Rhodococcus corallinus 172 выделен из окультуренной черноземной почвы Воронежской области, штаммы R.corallinus4, R.ruber 324 и Rhodococcus sp. 327 - из почвы Кулешовского нефтяного месторождения Куйбышевской области, а штаммы R erythro-polis 2 и R« luteus 37X - из пресноводного пруда ( старица р. Оки ). Штаммы R.corallinusV-49 и Rhodococcus sp. 87-5 были выделены из почв, не имевших контакта с углеводородами ( штат Алабама, США ) и любезно предоставлены нам доктором Рэймондом.
Способность родококков использовать ароматические соединения в качестве единственного источника углерода определяли ауксано-графически на агаризованныхх и в жидких средах. Способность фик сировать молекулярный азот определяли по способности расти на безазотистых средах в течение нескольких последовательных пассажей.
Для культивирования микроорганизмов использовали либо полноценную минеральную среду Е-8 ( 12 ), либо, в качестве минимальной среды, водопроводную воду следующего состава: углерод - 0,38 мг/мл, в том числе карбонатный - 0,14 мг/мл ; фосфор - 20 мкг/мл ; сера - 24 мкг/мл, кальций - 99 мкг/мл, магний - 25г мкг/мл, /калий - 42 -3,9 мкг/мл ; натрий - 9,6 ; хлор - 18,4 мкг/мл ; железо, медь, кобальт марганец, цинк и никель - меньше 0,04 мкг/мл, азот - не обнаружен.
Культивирование микроорганизмов в жидкой среде проводили на качалке ( 200 оборотов/мин ) при 28С в колбах объемом 750 мл. Для создания хорошей аэрации среду разливали в колбы по 100 мл.
В качестве источников углерода использовали ароматические субстраты в следующих концентрациях (мМ): пирокатехин - 0,5 ; метил-пирокатехины - 0,2 ; п- и м-крезолы - I ; анисовая, феруловая, салициловая и п-метоксикоричная кислоты -1,5; фенилуксусная кислота ( ШК) и ее 2-, 3-й 4-оксипроизводные - 2 мМ ; фталевая и терефталевая к-ты - 3 ; бензойная, п- и м-оксибензойная к-ты - 15 ; фенол - от I до 20 мМг. Неароматические субстраты - ацетат, фума-рат, сукцинат, глюкозу, этанол и глицерин - вносили в среду в концентрации 5 г/л, что составляло соответственно - 83, 43, 42, 28, 109, 54 мМ.
Рост культур в жидкой среде контролировали спектрофотометричес-ки при длине волны 510 нм.При изучении влияния лимитирования по отдельным питательным компонентам среды на рост и активность диоксигеназ Rhodococcus corallinus 172 культивировали в синтетической среде, снижая в разных опытах концентрацию источника фосфора от І,7мг/мл в полноценной среде до 20 мкг/мл ( в водопроводной воде ), источника азота -от 1,5 мг/мл до 0 или источника углерода ( фенол, ацетат ) от 5 до 0,1 мМ. В этих опытах фенол одновременно использовали для индукции ключевых диоксигеназ орто-пути. Для индукции метапирокате-хазы в опытах по лимитированию использовали 2-нитрофенол в тех же концентрациях, что и фенол.
Длительное культивирование родококков в олиготрофных условиях с пониженной аэрацией проводили в водопроводной воде, разлитой по 300 мл в колбы объемом на 750 мл. Через 7, 14, 21 или 28-30 су - 43 -ток голодания у этих культур индуцировали синтез ключевых диокси-геназ орто-пути, добавляя в среду I мМ фенола, и измеряли динамику активности указанных ферментов с интервалом 24 часа в течение 14-18 суток.
Индукцию синтеза ферментов, расщепляющих ароматическое кольцо, изучали, выращивая штаммы родококков в полноценной или минимальной среде с ароматическим субстратом в качестве единственного источника углерода. Если ароматические субстраты ( хлор-, нитро-, метоксифенолы ) не поддерживали рост микроорганизма, в качестве ростового субстрата использовали ацетат ( 33 мМ) , внося немета-болизируемый индуктор ( I мМ ) в фазе экспоненциального роста.
Активности ферментов, расщепляющих ароматическое кольцо, в первом случае определяли в конце логарифмической фазы роста, а в последнем - через 5 часов после внесения ароматического соединения.
Для проведения индукции оксигеназ в неростовых условиях культуру, выросшую на мясо-пептонном агаре или в синтетической среде с ацетатом, трижды отмывали центрифугированием в 0,01 М фосфатном буфере, суспендировали в том же буфере, разлитом по 100 мл в колбы и инкубировали на качалке в присутствии индуктора в течение I-4 часов. При изучении индукции ферментов в анаэробных условиях отмытые клетки суспендировали в буфере, налитом до резиновой пробки, герметично закрывающей колбу. Для удаления растворенного кислорода буфер перед засевом нагревали до кипения и охлаждали до 28. После внесения инокулята и ароматического субстрата ( пирокатехина ) среду постоянно перемешивали на магнитной мешалке.
Влияние ингибиторов белкового синтеза на индукцию оксигеназ изучали, инкубируя клетки родококков ( плотность суспензии 0,2 ое/ мл ) одновременно с ароматическим субстратом и хлорамфениколом-( 100 мкг/мл ), актиномицином Д ( 80 мкг/мл ) или рифампицином (40 мкг/мл ). Концентрации ингибиторов подбирали экспериментально.
Репрессию синтеза пирокатехин-диоксигеназ и протокатехоат-3,4-диоксигеназы изучали, выращивая штаммы.на ароматических субстратах в присутствии глюкозы или конечных продуктов окисления ароматических соединений - ацетата, сукцината, фумарата.
Ауксанографический анализ коллекционных штаммов
Для отбора микроорганизмов, способных метаболизировать различные ароматические соединения, был проведен ауксанографический анализ 64 штаммов родококков из коллекции лаборатории физиологии роста ЙЕШ АН СССР. Рост коринеформ на агаризованных средах с ароматическими субстратами в качестве единственного источника углерода оценивали по 5-бальной системе от 0 - нет роста - до 5 - максимальный рост. В таблице I показано общее число штаммов, способных метаболизировать тот или иной ароматический субстрат.
Как следует из представленных данных, наибольшее число штаммов родококков в качестве ростового субстрата использовали бензойную кислоту. Примерно половина исследованных штаммов усваивали фенол и п-оксибензойную кислоту. Около 40 % родококков были способны метаболизировать п-крезол, а примерно пятая часть всех исследованных нами штаммов использовали в качестве источника углерода п-ме-токсибензойную, п-метоксикоричную и феруловую кислоты ( мономеры лигнина ). Лишь около 10 % всех штаммов были способны метаболизировать ароматические кислоты с двумя карбокси- или метоксигруппа-ми ( терефталат, диметокеикоричная и диметоксибензойная кислоты).
Восстановленные ароматические соединения, такие как бензол, толуол и п-ксилол ( в виде паров ), не использовались в качестве источника углерода ни одним штаммом родококков. Исключение составлял лишь такой восстановленный субстрат, как нафталин. На среде с последним росли 3 штамма из 64. Эти данные показали, что родококки способны использовать весьма широкий набор ароматических соединений в качестве единственного источника углерода, однако, доступность указанных субстратов определяется строением их молекул. Лучшими ростовыми субстратами ароматической природы для родококков являются наиболее простые окисленные соединения с одной-двумя окси-, карбокси- или метоксигруппами.
Для детального изучения питательных потребностей и ферментов катаболизма ароматических соединений нами были отбраны 6 почвенных штаммов родококков: R- corallinus 172,4 и v-49, R- ruber 324, Rhodococcus sp. 327 и 87-5, и для сравнения с ними - выделенные из водоемов штаммы R.erythropolis 2 й R. luteus 37I. В таблице 2 представлены результаты ауксанографического анализа этих штаммов, в котором мы исследовали более широкий набор ароматических субстратов, чем в таблице I. Из данных таблицы 2 следует, что почвенные штаммы родококков в целом способны к метаболизму многих и разнообразных ароматических соединений, тогда как штаммы, выделенные из водоемов, гораздо менее активны в отношении указанных субстратов. Так, R»erythropolis 2 рос только на средах с фенолом, п-оксибензоатом, фенилацетатом и 3-оксифенилацетатом, а R.luteus 371 вообще не был способен метаболизировать какое-либо ароматическое соединение из числа указанных в табл.2.
Из результатов таблицы 2 следует также, что способность к метаболизму ароматических субстратов сильно варьирует у разных штаммов родококков даже в пределах одного вида. Так, штаммы 4, 172 иу -49 вида R.corallinus отличались между собой по способности использовать в качестве ростовых субстратов нафталин, м-оксибензоат, феруловую, метоксикоричную, терефталевую, фенилуксусную и оксифенил-уксусные кислоты.
Такое штаммовое разнообразие возможностей родококков в деградации ароматических соединений, вероятно, обусловлено действием раз - 51 Таблица I. Способность родококков к метаболизму различных Результаты анализа видовой принадлежности исследованных нами 64 штаммов родококков представлены на схеме I. Как показано на этой схеме, представители таксономически четко очерченного вида Rhodococcus rubropertinctus ( синоним - R maris )f часто выделяемые из морской воды ( см. главу I литобзора ), усваивали только бензоат ( 9 штаммов из 16 ) или вообще не метаболизировали ароматических субстратов ( 7 штаммов из 16 ). Эти данные согласуются с вышеизложенными результатами ауксанографического анализа для пресноводных штаммов R. luteus 371 и R. erythropolis 2. Возможно, низкая активность в отношении ароматических соединений является характерной чертой представителей водной микрофлоры.
Остальные штаммы из 64 исследованных в подавляющем большинстве являлись представителями почвенной микрофлоры. Более половины из них росли на средах с бензоатом, п-оксибензоатом и фенолом, некоторые - на средах с п- и м-крезрлами. В этой группе; преобладали представители видов R coraliinus, R. ruber f остальные штаммы относились к таксономически очень близким видам R. minimus, R.opa-cus, R. salmonicolor, R.erythropolis и наконец, около 20 штаммов почвенных родококков, включающих прежде всего представителей вида R. coraliinus а также R« opacus и несколько неидентифи