Введение к работе
Актуальность проблема. Эсторази - это фврм.эты класса гидролаз»
квтвлизирувдиэ гидролиз слокноэфиршх связей, реакции этерификации И пэраэтерификации. Наибольший интерес представляют эстеразы. расщеп-ляидо ефиргкарбонових.кислот, среда которих различают споцифічес-кке (зкшнэстеразк я ацетшнсолинэстеразц), гядролизуюцие холиновыэ: зїнрц. и неспбцифэтескиэ (карбоксилэстеразн, ацетшэсгарзгл. врилэс-терэзы), для которых природные субстрата не найдеш. Наиболее изучо-mi Ефяролитнческие фермвнти животного происхождения, в меньшей степени - рас питательного. Большинство работ посвящено исследования специфических эстэраз. .
«їормонтвке препараты эфирадитичоского действия все более широко кшользуются для деградации їіощчфоднш субстратов я вредных отхо-доз, в технологических процессах щщовоя и химической прошшленкос-тя, для лечебных и диагаосгических целей. Однако, промышленное полу-Ч0ІШ9 кивотиых эстэраз ограштвггтся сирьовой б^зой ( эритроциты человека, сыворотка крови лошади, печень теленка, электрические органа морских півотшх и т.п.) и високої* себестоимостью.
На начальных этапах исследования остераз, продуцируешх микро-оргширмами, ах образование рассматривалось, главным образом, как дополнительный гаксоноаический признак. Расширение исследоааниа мікробних естераз обусловлено тторспвкткваш практичесг.ого использования еффолатичесісшс. фзрмеитов и необходимость» поиска солее экономичных источников их получения. Эстеразы Чпкрооргашзмов малоизучены, поэтому исследованиеv процессов их биосинтеза, шко-хшических. свойств и дазиологической роли в клеточном -метаболізме прздотавляе--ся актуальним и перспективна.! направлением ъ микросиздогаи, связанным с репэхтем-теоретических.и практических задач. -
Цель ц задачи исследования. Цоль йостояаэй рзботы - поиск внсо-
кооктаипи продуцентов- вфарояитпчэсиП'форкейгов' среда мпцелиалыых грибов, исследование закояшеряостоіі биосинтеза остераз а их физшга-изетческах свойств. .'..'."'"'.-'-'"-"
Исходя из цела иссяодсвзаая были поставлена следувцив задачи:
изучение образования нзспысйач^скизс в сгощфиеских эстераз грибасг различит; родов и отбор ЕПсо'кЬахтизад продуцентов;
исслодоЕвнге влияния источников изтзпия и усдовзЯ культивиро-
ВЗГОЯ ИЗ ИаКОШВШЮ ВВЄ5М0Т0ЧПІД асТбрЗЗ A.car-bcriai-Iua И A.vttrions:
- изучение заідажлзртосгой "биосинтеза гривша внеклеточных ас-
- A -
тераз и механизмов его рэгуляши;
- исследование свойств неспецифячоской и специфической зстзраз
A. oarbonariua;
- исследование свойств неспекифачэской эстеразы a. variana.
Научная новизна. Вігерше показано, что способность продуцировать зфиролитические ферменты широко распространена среда квделизль-ннх грибов различных родов. Образование эстераз является характерной особенностью грибов рода Aaporeiiiuo. Специфические астеразн грибного происхождения обнаружены впервые.
У КИЦеЛИаЛЬНИХ ГрибОВ A.carbonorius И A.varlans УСТШОБЛЭНО
разобщение во времени максимальних скоростей роста и синтеза эстераз. Показано, что эфиролитические ферменты продуцируются грибами в постокспонеьощально.": фазе развития. Уомэнт достижения иаксималшой скорости образования несгащфічоской эстеразы А.оаг-ьоавгіші значи-тэльно опережает таковой для специфачоскои,. '
Установлен индуцированный характер образования неснецифичаскай ' естеразк а. тагіш. Показано. репрессирущеэ действие глюкоза на синтез фермента, проявляемоэ йа уроЕаэ транскрипции. Внесение экзогенного ц-3',5»- А!. дерепроссирует синтез зсторази.
На основе субитратно-шзгкбктсрдаго анализа установлено, что A.oarbonariuo продуцирует ацетилэстеразу (КФ 3.I.I.6.), наиболее эффективно гидрола-ущур вфари уксусной кислоты и ае чувствительную к органофосфатам и карба'датам, а.также ацотилхолинэстеразу ( КФ 3.1.1.7) с ішзкой чувствительностью к холянэстеразним ингибиторам. Шспецнфичеагая гсгераза A.varians іслассзіфащрованз как карбокашс-тераза (КФ З.ІЛЛ.), каталкзкруюаая гидролиз ароматически:, э^мров короткоцепочечшх іаржх кислот и писокачувствателышя к действию ор.'Яша, ГД-42, фосфакола, хлорофоса. . ,, .
В отличие от описати в -литература оффслатических фэрмзнтов,' эстеразы A.a-vi-fconarius проявляет максимальную каталитическую активность в зоно рН 10,0 - 11,0, -что свидетельствует об их уникальности.'
Установлено наличка мпогественгек молекулярных форм вэспецифи--ческшс эстераз А.оліьсяегіия в A.verioos, сшктр которых зазискт от способа культивирования продуцентов.
Практическое значаще работы. Епарьне отобрали продуцента не-
СПеЩфпеСКИХ Н СНеЦИфгаеСКИХ ВСТереЗ,- AspersUlUE oarbouarius 51, A.nlgor. A.nisei IT*. A.T)leer 175, Гілаагіш» Bealteotum, Mortierella вр. 415Ъ.
Отселектированы и охарактеризованы высокоактивные штамма - а.
oarbonarlus Б11М-30 И A.voricci3 БИМ-ІО.
. Оптимизированы условия и разработан остав штательнш. сред для
ГЛубИННОГО И ТВврдофааНОГО КуЛЬТИВИрОВЗНИЯ A. curbonarius II A.various. Получены эстеразннэ препарата ГЛОХ л ГІОХ л.сагьопягіча, содержащие ацетилэстеразу и оцвтилхолинэстераЕу. препараты ПІОХ и ГІОХ a.variolas содержание карбоксилэстераз.у. .
Показана возмолзюсть использования неслэдифических эстераз
А.сагЬопаї-іиз К A.varlmis ДЛЯ ДЭГраДЗЦЖ! арОМаТИЧбСКИХ ЭфирОВ КОЮТ-
коцепочечшх ззірішх кислот. Карбсксилэотеразн мокет применяться для индикации мщхжоличэстг фосфороргашіческих соединений, ацетклхолин-зстераза - для определения содеркакия ацетилхолша в биологических кидкостях.
Публикация материалов. Но теме диссертационной работа опублікована I статья, 3 приняты к печати.
Структура и объем -работіі. Диссертационная работа состоит из
пвокопия, эбссра лнтсратурц, зксіирімопгальпой части, Еклачаздои 5 глав, основных результатов и синодов, списка литературы. Работа изложена w 134 страницах мазиношіспого текста, иллюстрирована 23 ри-сунхеми и 21 таблицей. Список литературы седертаг 172 неиманования, в тем число 100 - на иностранном язже.
ЭХС!ШРК,(Еа?АЛЬКАЯ ЧАСТЬ Объекта,я нэтода исследования
Скршотнт» продуцентов зфиролипгї9ских ферментов осуществляли
СрвДй МИЦ6ЛИа.ИЬЯЫХ ГрабОВ рОДОЗ Aorenoniun. AJ.temnria. Aspergillus,
Мавтегіа, Chaetottium, finhdmephtora, Fusari'rn, ОЗІооїайіияі. Itortie-
Гбіін, urrotheai'JUi, Оозрога, Р&еоИояТ'вез. Penialllium, Phoma, Khl-
zopus, " Ccopularicpaia; Зчс>.уЪо<иуз. rrAchooledium. Trtchoderma,
полученных из рззличтшх музеев и видялеашх та природних ИСТОЧНИКОВ. ігДЗНТІфИКЯЩІЮ ГГКбОВ ПРОВОДИЛИ ПО ОПреДЭЛИтеЛШ Oilman (1945).
Пвдошшчко (1977).
Яри первичном отборе продуцентов специфических эстераз культури , выращивали па агаре '".злака .(Метода експерта, шиологпп, 1973) с 0,5 кукурузного экстракта н 0,5 % холЕнсодержадаго петочшеа углерода. .Шш-пейпяй отбор культур проводили при твердофазном культпвпроввнаа с течение 120 ч при ZB0 кла 32 па сроде. содвряасэй: (% по весу): пяаіщчпае отруби (ПО) - 46,5; дястиллировшнуп ії20 - 46,5; caci2 -г, г, последувдей водной'&кстр8кшюй. В экстрактах определяли зфіро-
логическую аиппюсть..
Основными объектами исследований. являтись итселектированкне 8
ШіСТКТуТе МИКроСШЛОГИЕ AHS ШТаММа А. ЕИМ-30 И A. varl-r wis БИМ-ІО.
Культивировсние продуцентов проводили твердофазным п глубинным способами. При глубинном адльтивироваіглк в качестве основной исполь-оовали срэду Чапека, (рн 15,5) с 3% ПО или. их 68-дам водним екстрактом. Культивирование осуществляли на 'кечалке (180 облаш) в колбах Эрленшйера объемом 250 мл с ЬО мл срода пря 28 или.32 в течение 96 ч. Биомассу отделяли фильтрованием,, промывали ..дистЕЛЯгроЕанной водой, высушивала, до ' постоянного, веса - «ра , 105- и'учитывал:: весовым методом. В культуральлойкидаоста..определяла астеразпу» активность.
Удельную скорость роста грибов (р) к удельную скорость синтеза ферментов (*) вычисляли'по,формулам: »i us ut-'aT'ii с* ,<т tn~1s~1. где х - биомасса ( шУш .)»
Эфиролатвчэску» активность госпсшіфїчзсгок астераз. определяли спектр-офотсметрігчвсйаі 'йбтодоа . (05-46):-по скорусти 'гидролиза субстрата при дшю голш, собтЕотстйувдоя максимуму поглощения продукта его расцепления. Для. отого вычисляли сроднил прирост-опткчзской плотности за І ьш' гіри спбнкшном (ЛД*С) іГ ЗрійНТаїКШОМ USi) гидролазе субстрата.. В качестве- субстратов .кспользовзди' арсматглоские афирц карбокошх кислот. различнсЛ кодокулярпой. структури, растшрок-шо р ацетоне, лктивеосїі- рзсспйШЕОли."' по формуло: ЗА = (4- ЛДц) .4--1, гда К - 'коої/йщяеит, учптиваадй оптическую плотность раствора, содорїаадого- .'продукт підрлйаа субстрата в'крццэглрацш! І иШ мл; 0 - рабочая 1рвдзн1$ацяя:4орьетщ»го раствора.
Активность свдпфча.ских ocsepw .спредзлйлі аналогична, zcikwu.-
зуя в качество субстратов холшюе^о аффа, карбонових кислот. За еди
ницу осгеразной- активности прлшаадп колгчеотво форлента, катализи
рующее гидролиз.I iadJ субстрата,са I гаи при'температуро 25 ї; рН
8,0. V":
Чувствительность scTopasjs дзасташ-фзсфероргазпческкх и карбонатних ингибиторов (Ю-1- Ю-** Ы) оценивала по величино1 і50- концентрации ингибитора, Еызив&здой БОЗ-ное, скакание активности Сэрчента.
Влияние температуры па католатичасіою свойства фе^чгантов исследовали в даапазош 20- 60. Термостабильиооть эстораз оценивала по остаточной активности после шдерзнвааия пх раствора п течение 10, 20, 30 п 60 кш при ссотвотствукцен 'температура.
. Елаянпо концентрации всдородщх конов па фзркзптативнуо. актив-
ность проверяли в диапазона рН 7,0 - 12,0, создаваемого с помощью
0,04 М универсального буфера (Лурьо.1967). О рНГ.-стабильности эстераэ
судили по остаточной активности после видеркикашш ферментного раст
вора в течение I ч при соответствующем рН. :
Количество белка в пробах определяя! по методу хотоу et ai.(I95I). Ступенчатый электрофорез л 7,5 S пожакршныидном геле проводин в вертикальных пластиках по методу Орнстейнэ и Дэвиса (0стер,юн,І93І).
Окраинваниэ гел&й после, электрофореза с целью выявления зон кеспецпфгеосгая эстераз проводиш при 37 в течение І ч в реакционной шест, г.одорзааэп: «-нафтиловьй эфир - 2 ккМ; прочный синий рр-солъ - 50 мг; 0,05 Ц фосфатний буфор, рН 7,0- 100 мл. Активные аояп окрьтвалтсь в черпни цвот.
Скразквэяпе голой с целъв' виявлення зон специфических эстераз '
проводили' при 37 в точэнцг. I ч в О,Г U фосфатном буфере ( рН 7,0 ),
содержащем 0,5 мл 0,1 М лй.ганнокпслого На, I мл 0,03 М сернокислой
мэди, I мл 0,005 U калия келеассшеродистого, 2 мкМ тшу.олнносого
эффа в общем соъаме 10 мл. Активные зони проявлялись как полоса
молочного цвета. ' - ...'
РЕЗУЛЬТАТИ КССУИЮБАНКЯ И Ж ОБСУВДЕШЕ . Отбор продуцентов айпхисттическд фэшэптов и их характеристика
Прсвэдзшмй'сіфішінр'пойззал(рисі), что из 50 исследованных
згшмоз (лцзуЬізльїпа грэсов 375 вэ образуют саспзцгфпескве остера-
зн, 73 продуцирую? следствие количества,, у. 0 активность составляет
о ,05— 0,9 ед/мя ж только'.6% являвтся активный проду'цептама. Наи-
; более кь-герасшм представляется род ларегєіііия.
Установлено, что ющзлиальныа граби 'розличшас' родов обладают
способностью ассимилировать холтсодэрхдав источника углерода, но
только 14 ата?о!ов продуипруэд сгоцифггескяо эстэрззц при твердофаз
ном кульгдвировашш на среде с НО. -
Ваявлена . "исокоактивал продуценты нзсдацифичесішх я сдацифі-
„ЧЭСКИХ астераз - Л.сйгЬсяшгАиз ?.1, A.aiss*'. А.Шеэг У1Л, A.ntger ITS, i.vai-iana 232. Tuswiua eeaitactvsa, Kortlsralla зр. 415b.
Прп проведении скршига продуцентов учитывалась чувствительность свдгезируаьшх граяла эст&раз к фосфорорганпчесшш соединениям. Установлено, что яеспецифаческая эстерзза A.voriano 232 ингиби-руется ГЛ-42 (2ХІ0-4 М) к арминсы (БхЮ"*6 Ы).
..e-п
Рисі. Диаграмма распределения исолодовгшшх мицелиглышк грябав но способности продуцировать яэсгацйфическяе эстеразы: I-ЗА отоутсїхуеі; 2- ЭА шяее 0,05 ед/мд; З-'.'ЭА от 0,05 до 0,9 од/мл; 4- ЭА 1.0 вд/ил и'вше.'
> Для дальнейших исследогеннй отоораш два мшелиалъннх гриба: д.
oarbonariu*. 21 - НЭИбОЛЭв аКТИВШй ПрОДУЦеНТ ШСПЄЦІіфИЧЄСКОЙ И СІТО-
цафаческой встераз; л.чагіаав гзг - високоактивний продуцент нзспо-да$пвС1Юй эотерази, проявлятедэй пошвеннув чувсгЕятэльаоо'.ь; к ФОС. Путем иаяраапенаого отбора спснтйцяіі мутантов на селективних
Средах ИЗ КОЛЛЗКЩГОНЕШС Культур A.caHionarlus, ВК2І Г-2І И A.varlnn3 323 (УіфШШ) ПОЛуЧвЕЫ ПОШ6 ЩТаИМа a.oarbuneriua ЕШ-30 И A.varl-
опз БКМ-ІО, ословш* отлячателышм свойством которых является более високий ( в 1,4 а 2,0 раза ) уровень сттоза ефиролнтичаских ферментов.
Бзоскитез впеклеточша эстераз грибатді '
Aspergillus оагЬопагІоз Я Азраг/?111ид varlana
Апалияііруя способность д.еигЪогадчиз проецировать внеклетотнуа неспваифячвскуп эстеразу гра асмастляцпп углородсодорзаїзіх соединений, из 2G-TH исштетшх источников углерода «озао видалять ІІ0, акс-
ТраКТ ПО И ТВЙН 80. С0НТЄЗ СПеЦИфЯЧвСКОЙ ВСТерази А.сагЪопаПиз на-
блвдается только на средах с ПО, экстрактом ПО пАТХИ.
, Магаїмальзое пакослеяя»'- носпадаїяческой эотерази A.variana в
кудьтуральной кадвости'впбяцдаэтся па срэдах с ПО,, екстрактом ПО и
таш ,40. '
Енекяэточннв эстерази псследуеіаа трябов синтезируются на сре-'дах со все.'Ж исшташгама. источшяакз азота.. Оитюяагьнші источни-кгш азотного' пмтвиш для -накопления нзсдацкфяіеских вкэоэстераз
A.'jarbojvarliys П A.rarteno ЯВЛЯЮТСЯ "СОЛИ. ЙЙМОЦКЯ, ОСОбвШЮ ІЩ^СІ. В
то ер время раивна в среде тнвракького; ксточдика взота органическим вызывает сяияенво сзжоэа.в 3-5 раз. лнзлопташз рэзультсты получены .для оте^їфетвсяой'зстеразц A.o^bcneiPtua.'/;'
Синтез зфарсшпотостеті фргдшрв в зиачнтдльноЗ стзпзтг оавискг
от способа культавярояаяня ародуцбкта. В уаяовадх твердофазного ш-
рядаения у л.еагьсиаглиэ шшитяа ояегяЗй'йскоа:. зсторази в 40
тт, иоеяевдфгюскоЛ аотарааа' з ,52..раза,'* а у i.variins в .25 раз
::цао го срагавгота с щлга^»;Тшта:;образсй,- ^вл;.пекоиленйя эстераз
;; псслэдуё?,ыю1' втекав», л твзрдофзаноё; кудьтдафовгвш*1 овадаолъно' эфз -
.ктавпео ;глу(багаоп>.; -';^*;':^'.;'' '-J'С'"^Н4''-'^ '"' -:'-/'" ".-'''' ''.. .4-- :'!' :-.' ;.Уо?8і«шеао, что спя юльпоз-; зріадішз >исходного .рН для сшгсзза
гС5брСЗ А-.оогФопагіиа І L> voriarts СС0Т23Л23У А,Ь -7,0 И 6,5, COOT-
:, bfeTOTEstoo. Сеная васойя'^дзгвдруЕчря. способность a. barbonariua гдазуеется при куяьтаируапи.пря 32, А.гагіввв V ера 28. .
По литературным Данным неяоногешше, поверхностно-активные ве-: щества могут стимулировать синтез , внеклеточных ферментов благодаря наличию в их шлекулах. эфирных Ф:дкционалънах групп иди влиянию на проницаемость клеточной мембраны..Установлено, что образование эсте-
раз A.oarbonarius И A.variens ТаККЭ Возрастает При ЕВЄДЄНИИ . ПАВ В
среду для. твердофазного и глубинного культивирования. Так, твин 40 увеличивает выход несгаиифическоЙ. эстеразы A.variaTia при глубинной культивировании на. 75S, при твердофазном - - на 250 %. Б отношения А.оагЬопагіші наиболее эффективно использование, тритона Х-100. V
Ка оптюлизированноа.среде рост а. о«^ьспагіиз .'начинается на 8-ом ч культивирования, jj^'составляет 0,34 /ч~,и достигается.'к- 16-ти ч <рис.2,А; З.А). - Следовые количества внеклеточных .ьфіязолитических ферментов можно обнаружить на 12-ом часу роста гриба, однако макси- * глальное количество nech9uys|«46CK0fl эЬтвразы в.мл. культуральной жид--; кости отмечаетсячерез ;S6 .ч> специфической г через 112. ч фермента-дни. Макстіальная. амрость сштазаЕесявцкфэтеской эстеразы наблюдается на 24-ом чІ'Спеїофічосжоа;- ші 44-ои,:: ''"'.'','}]'* .\У.,
В отличав от. А.гЧгЬоіагіиз У;і.уа^івм;Оиомасса начинает интен
сивно нахаптаться нескоро по^ эсхе-
раза появляетад'в.культур^ксй яодкооти;только на 28-ом,ч фер*энта-
ции ( ри«.2,В;);-^ц^': Q;2Z-*J*, оиіе'чаеуся;'к 24;'Ч''культивирован7'^я И:
опережает иаазф достішешшілакссталь'ноа скорости сіштозо эстерази
более.чем насутки;4pnc^3>№'".;0V;-N ^^,1^/^:;;-.'-д^' .^..V/v
' Таким образом, ші«зШі4'.разс^аш.1во ервшни.йаксималькой ско
рости роста' нродуцеатоо іі^шжсдаадьіш'скоростей синтеза ефирсоити- :
чоских фершатрві'<о0^6^Щ!іо^'ір^:іі^^№Зояна аостэкспоненциг'
альнум фазу. развития^іфШ^.^Ціі^У;-^^^"'.^'^---'.'-''
В КаЧ9СТВЄ'1№Д9^
разования грибных рфідолитцчзеїйі'фэрйонтов .внбр'ан мицелиалышй гриб
A.variane - Продуцент ВЄСЙ6ВДі^8СКрЙ 8СГЄраЗН. "' :/^ >'(';: -- Ч
При изучении.характера.<йр830ваная.8Стераза.';в;.оштах с отмытым-' мицелием, установлено, ;;ітЬ_;яз: вс^х.всштзнннх соединений' с эфирной связью только б-в^-лящШгоблащ&х выракенным индуцгругащм действием. Оптимальная коЫеатр'ацая .индуктора Доставляет ZsI0"^U. индуцирующий эффект А-нафтилацвтатвпЬдтвераайтря;'в'растущей культуре. ;
Синтез вегаевдфичвсчбй естеразй A;verian» подаершн' репрессия
глюкозой, причем степень репрессии зависит от.концентрации рептес-
сора. Глюкоза н^ оказывает влиянияна каталитическуюактивность фер
мента.' ' '-' ".//. .'.г-''":';:.-. -''.:..''.'.' '"''.'.' .''"'.-'
О целью выяснения уровня ороявленкяі'репрессии сравнивали дейст-
ю-2іо-2 рН Еисмасга
W 1' ' Vі I
О 32 64 96 чае
ЗА
,-2
Рас.2. Дкаышка роста A.oas-bor^rious (А) и а.ты-юез (Б) в синтеза внеклв-точпых ествраз: I - рН; 2 - биомасса, кг/ші; 3 - нэспецвфзчаская эстераза ( ЗА, ед/ші ); 4 - спащфпескгя эстараза ( АХЭА, зд/кл ).
0,3
0,2
0.1 j
, " » < Г**
0-16 32 43 64 час
0,3'
0.2
0,1
I- 4
0 16 32 48 64 час
РИС.3. КИНбТИКЗ рОСТЗ А.евгЬоії&гіиз (А) И Л^аг-Ібла (Б) и синтеза ВН9КЛЄТСЧ-
ннх &стораз: I - удельная скорость роста (к), час-1; 2 - удельная, скорость синтеза кэспвцгфиескоЛ эсторазы ("і), ед .мг~ час-1; 3 -удельная скоромь сштеаз специфической зстерззи (*2), ед.кг" час" .
- ЇЗ -
ше глюкози і ингибиторов белкового синтеза (актияомицина Д и 8-оксихгаюлина) на образование эстеразы откытнм мицелиом в условиях индукции. Установлено ( рис.4 ), что репрессирующий эффект гпюкозы сходен с действием актиномищша Д. Это позволяет полагать, '?vo ка-тзболктная репрессия реализуется на уровне транскршгции. Внесение экзогенного ц-З'.б'-АМВ дорапрэссирует синтез нзспецифической эсте-
рПЗИ A.«R.rlf>na (piW.5).
СВСЙСТВа ЭСТвраЗ Asparflllloa согЬоплгІив
Спкртосаадэшда препарзта.ІПОХ и ГІОХ А.оагьопагіи.ч получены, соответственно, послз твердофазного » гдубіяшого культивирования продуцента и содержат неспецифическую к специфическую зстеразн. Для успешного применения препаратов неабмдиш исследовать их свойства,
. вашэйкими из которых являются субстратная к ингибиторная споцифяч-ность.
Скорость ферментативного гидролиза субстратов препаратом ПІОХ a. carborariua значительно сшгается ло мере удлинения цепи их кислотной составляющей J тьбя.1 ). Это наглядно продемонстрировано а ряду цара-нитрофвннловых и кчдофегалозых эфаров карбонових кислот для нвспэцпфгческой, и холиношг зфіров для специфической зстеразк препарата. Каталитическая активность косгшцифйчэскэй зстеразн па отпсшеамп к эфирам, амэгщщ развэтелэкия в кислотной или спиртовой части молекулы ( п-шггрофенилтридатлацотгт и п-китро-м-карооксифо--нилацатат ), унижается в 17і раз по сравнению со скоростью гидролиза шрлззе'голенного п-яктрофешлсуэ'$ата. Эфкри с положительно заряжен-кой группой гидролизуотса в 4 разе Снстрзе аналогов, не содержащих
. таковой. Лучшим» из проверенных субстратов для несдацифической эсте
разы препарата ЩСХ .a. carbonari»» являются 2-метид-4-азо( 2'- м-
метил-теазолгшгерхлорат )- ацетоксибанзол, 2 --мвтил-4-83о( 2*-тиазо-
ліл)-аіютсксибензол к SSSA, для спэ'цафачесвой зстеразн - АТХИ. Суб
стратная слоцифппость эстбраз лреяараго ГІОХ А.оагьопагіаз аналог
гпчне. . .
Янгибитсрньй Екчлиз зотзраз, содержащихся в препаратах ГОШ и ИОХ, показал, что наспйцийгееская эстзраза a. carboneriua не чувствительна к действию органтфэсфатоЕ и карбаматов,' а специфическая естораза. е отлитое а? антвотншс и растительных ферментов, гнаролнзу-vuw. холвдювие яфиры, харахстеріїзуотся слабой чувствительностью к ГД-42 (і50= і а' о"3), аршщу (i,.y*5xt о"г). прозорішу dso=5r 1 о"').
Показано, что достаточно високім концентрация ацзтнлтиохолшш
Рис.4. Влияние глюкозы и иапібиіоров белкового синтеза на синтез ^гпрілвіической вствразц A.variana: I- ^-изфталацотат; 2-Р ;Г*6тіиіацетат і глюкоза; 3- ^-нафгилэцегат + актшюмшщи Д; 4- (і-нафгі'ЛБцетат + 8-оксішшолин; Б- ^-нафтилацетат +
ГЛЮКОВД » гКТУГОМИЦУШ Д. ' . '
ЭА,ед/мл
У
15 чай
Рас.5. Двропрессил сітгеза пвсігацкфічвскоа эстарази A.variana ц-3',5'- tl№: І - fl-пвфтилацотат; 2 - /ї-кафгалацетат + глчкоза; 3 - .ч-пиїгюіацатат + глюкоза + ц -3',б'- А!.№.
- Таблица I.
ДЄЙПТВИ.6 ЭСТвраО A.carbouaxiv.J И A.varlans На &({иры
карбонових кислої
Кйшгеюшвга субстрата
яцатэт
с3«7
о . Си,
сн„
'vyc-a-ctigCHg-H (сн3 і" ацэтилтиохолишс.дид 540
С ».Т_' V/VV
ч Сі».
*CCY)H
,0
OT/
V-.< \ : .сн^
,0
1'_к>-н"*-^>--<',
сн.
- /,
'CR,
!<_*>/н=н-«^>--с\
сн„
п-етлро-м-карбокскфа- 16 нилацэтат
иадофзншацвізт . 60Q
тадофекалбутират , . О,
2-мвтил-4-азо( 2*-теа- -746 зсаЕіл;-ааасокоіісєнзол :
2-М9Тил--4-аао(2'-к-мд- 2350 . так-якйолилшрзиюрет) -ацетоясаЛэмзаа
vbCH,-н 'т. Бг* ' ирогаоюипиохопдн-
;.в' * А ' ' - бромид
ш
ингиСируют каталитическую активность сіюидфаческой ьотврази д.саг&о-пагіиз. Максимальна? активность отмечается при концентрации субстрата 25 X І0"3 М.
Получешше результата дают, основание полагать, что резистентная к ингибиторам несиецифическая астераза a. oavbonarius, наиболее легко гштролтаупцая ьфирн уксусной'кислоты, относится к вцетилэстврз--зам. Обнаруженная наки специфическая ост&рзза л.сагЬоітгіиз, вероятно, является эадтлхолшэстеразой, отличающейся низкой чувстЕиголь--рость-о г холинэстеразшм ингибиторам.
Установлено, что эфиролигичесюда фермента препарата ШОХ к аце-плхолинэстэраза ГЮХ л.сагьопагіия максимально активны при температуре 30-40, температурный оптимум ацетилэстеразу ГЮХ на Ю ш-
рН-оптимум делегат зстврзз ігрепарата ШОХ и ацетилэстэразн 'ГОХ составляет 10,0-11,0. Максимальное проявление- каталитической іктибноотй ацетадхолвнэстеразы ГЮХ наблюдается при рй 8,5.
Для ацетилэстерэз обоих препаратов характерна устойчивость к .ешерагурв 46, сохранение более 75 активности посла бО-'лшутного ірогреваїшя при Ь и 10 - при; 60. Ааетилхолиьэсторазь: обоих пре-гэратов также не теряют активность при 45. Однако, в отличие от |Цетилхолинэствраз11 ШОХ, ипаятввирувг .эйся при температуро 60 через ;0 mm, фермент ГЮХ характеризуется более высокой термоетабплъ-юстьп и сохраняет после часоього прогревания около 30 активности.
Каталитическая активность ацеталэстерззи и ацеталхолигэстеразн грвпэрата ПІСХ сохраняется практически без' потерь в зош рИ 6,0-8,0 ,і 6,0-9,0, соответственно. Существекшм -отличием эфиролигических Іузрментов препарата ГЮХ язляотсл. повигэшая кислотоустойчивость: -тётилзстераза практически из теряет активности при рН 5,0- в,О, чцетнлхолкнэ.".тергза -при рН 4,0- 6,0. В динамике роста гр:іба про-лстодит снижение рї[ от 5,5 до 2,4, а затем повышение до 7,0, таким образом, сетгтоз зстераз осуществляется в кислой зоне рн", чем, еоз-моию, и объясняется их.кислотоустойчивость..
Таким образом, у.-теновлены некоторые различия в свойстеш фер
ментных препаратов, дол.'/ченных при рБзличних способах- культивирова-
кия гриба. .'.'"'''
Различия в составе комплексов эфиролитачэских ферментов ь зависимости от способа культивирования.продуцента установлень* с использованием электрофореза в . йолиакриламидном геле.. Препарат ГЮХ л.оагьопагіггя представлен 7-ю! мюжественшми молекулярными формами неспецифичеокпх. эстергз,'обозначенными Е.- - Ej, в порядке уменьшения
злектрофорзтичаской подвижности. Активность их ишетоо снижается по мере увеличения ДЛШШ УГЛвВСДО{ЮДН0Ё цопи кислотной составлявд&й используемого е качестве субстрата а-нафтилового эфира. Препарат ГЛОХ характеризуется 6-ю множественными молекулярными фирмами кеспэ-цифическнх эстераз (Е-- Es), также иаяоолзе аффективно пщролизувди-ш «-нафтилацетат. Преимущественная гвдролта вфира уксусной кисло'ш всеми множественными молекулярными формата неспецпфическоЯ &стеразы A.oarbonariMB позволяет классифицировать форманты как ацэтилэстера-па (КФ 3.1.1,6.).
Сравнительный анализ еямограмн кеспецкфичэских эстераз двух
препзратов д оахьонммив (табл.2> выявил несомненное сходстве в ха
рактере расположения бствразшх полос: фракции Ej, Eg, Eg, Е4, Eg
препарата ЩОХ соответствуют фракциям 1. .. Е4* Е6' Щ- ЦРвпэр81'ь
ГЮХ. Вместе с тон, в препарате твердофазной культури оСнарукана
остараза с ^=0,08, а эстеразы с nt=C,ip и Ff«0,2ii продуцируются л
только глубинной культурой. \
Я- ТАБЛИЦА 2.
' Значения Rf .'множественных, молекулярных форм
НЭСЛеЦЕфГЧеСКИХ ЭСТвраЗ Препаратов ГІОХ И ПІ0Х A. carbonarlus
Значение
0,05
Наикеновашів фргчции препарата flit;
Данные электрофореза свидетельствуют о том, что спектр проду-цируедах A.oexbonartus множественных молекулярных форм внеклеточных иеспецифических эстераз зависит от способа ісультивироьіания гриба. . Установлено, что препарат ШОХ'содержит одну специфическую эс-теразу Вт (r.^0,86), активно гвдролизущую вцетйлтиохолин, в меньшей степени - пропионилтоохолин н не расщепляющую бутирилтиохолш. Ка основанод субстратной специфичности.фермент классифицирован как
ацетилхолияэстераза (КФ 3.1.1.7.). Аадталкхяшэсгврзза со гдодшми евойстваш я значением Rj=0,84 обнаружена в препарате ГІ0Х.
Свойства 5СТераз Aspergillus varlsna ' Исследование СУОСТрБТНОЙ СПецифИЧИОСТЯ ЦрЭПараТа ЇІІОХ -A', verier, я
показало (ТаблЛ.), что-.эфтфолитическая'активность дасдацифаческой оч-'тераза снижается по мере удлинения углеводородной цепи кислотной составляются субстрата.' Фермент в кеныей степени способен гмлрели-.зевать субстраты о разветвлениями е спиртовой и-кислотной-частя молекулы. Большое влияние из каталитическуи активность эстеразы оказывает наличие в молекуле субстрата катгавноя. группы: 2-метял-4-азо (2'~ н- штил-тяазолшіерхлорат)-ац9токсг.Свнзол раскепляется в 3 раза быстрее, чом 2-н9Тпл-4-азо(2'-тиазол1Я)-ацетоксибензол. ОГЛИ-МйЛЬШйИ субстратами ДЛЯ нбсПбиЛФГїеСІСоЯ ЗСТОраЗЫ" ПІ0Х A.varlana
являются ИФА и 2-метил-4-азо(2'*н-кетіштшз6лилпархлорат) -ацотокси-
бензол. Аяалогич"а субстрэтшш специфичность'астеразн препарата
тюх. .._
Интибигоршй. анализ локазал /табл.4.}, что чувствительность
фермента к производным фосфоповой кислоты (армии) ваше, чем к произ
водным фосфорной (фосфакол)..Произвсдннэ тиофосфордай кислоты (мета
фос, карбофос) такжз практически не ' обладаот инпїОируюиим фермент
действием. Тиолошй эфир фосфоновой кислоты (ГД-42) в меньшей степе
ни подавляет эстарззнув активность,; чэ^.кислородный (армии). Из ис
следованных оргзнофосфатов наиСолышй. ингябирущий эффект наблюдает
ся при обработке эсгеразн IH.QX ABpei?giiivs.vart.erv$ армином в концен
трации 5x10"^». V. ' '.---
Установлено аналогачнае действие фосфороргапгееских ингибиторов на клталитіпескую, активность., эстераз A-voarbraibrius независимо от способа культивирования/ гриба.; Как показали иссле.аования, прозерин не является; ингибитором эсгераз ІШЗХ й ГІ0Х A.tariehs. ; .
Основываясь да - эксаершенгальных -данных: по. субстратной и инги-
бИТОрНОЙ': СИбЦИфЯЧНОСТЯ;'; Ч3<ЗИрОЙІТИЧ9СКИЄ " ферменти-.-. Afvarisaia МОГУТ.
5кть отнесещ.к кгірбоксвдзствразаа" (КФЗЛ-ЛЛ.)..-^'' ,. .'.
; Температурный ептимум действия.к'арЙоксилэстеразыШОХ составляет 35, оптимальная :тешбратура'-для'проявленая-каталитической актив-юсти карбоксилэстеразн FfCX несколько.выше -:.,4(10. "'Карбоксилэстераоа бокс препаратов .практически', не сникаэт '.Каталатичвсую ' активность осле 60-минутЕого'прогрэвак.-'я при.'50;.;Однако, при" Ь5'фермент ПЮХ
+ &-- _
сохраняет 75Я. активности, а ПСК только ББЖ. При 60 оба фермента
кнактивируитсл чэрез 40-50 мяв. ' ,
Ыехоимальная ахаианооть карбоксилэстеразн ШОХ A.varians наблв-
даится при рй ; Э.О, карбовсилзсгеразы ИСК - при рН 9;5. «ерманты
прэиарзтов, й-одчаннцх как при .твердофазном, так и .'при глубинном
, способах культивирования продуцента, сгабильш в пределах рН 8,0-
*,0, но грк рН 6.0 и 10,0 теряв? уга 'около 40 актишостя.
v Основываясь на'шшегалаквнйом, иошо заключить, что сэойотва аффолишюскик фэ'ркаагов A.vorians. зависят от способа культнвироза-
';' '^^звтельвэсм» Е?<жац21Ч(?ско2 еотерэзы ШСЙ д. variaas
',':.'.' ':'; ^ к $6сйрорганачэсвш1 соедашми .. ' .
-йорвдля'всо-.
"'.'й1а^в. ''-"о ' "; ''
ca„
4%
fiiSgo'^oHfoaj-acig. си/ satcat)z-a(
»,
-ш„о' "S-іЛі:
'(TO-
.. ;^Vt9We':-
. Т05ШаМЬНОЄ! ''-.
иаимйюааша *0С
армия- / '^горсфоо
a :,
: 'ДОХЛОфОб' :ГД-43-';:'
'VB\
HapfсфУ <
№жазатель чувствительности 160,М
б к 10"
б it 10'
rft-4
5 г 10'
,-3.
Xt 10' 2 XIO"4
r;6'i.io"?:
ь'2І -
кия продуцента, как это отмечалось рвдэо для эстераз л.«.-агьса*гіиг.
Установлено различие эстеразншс комплексов A.vortans, продуци
руемых при разлігшнх. способах культивирования гряоа. Ila зтюгрэмме
препарата ГІОХ осларукено 5 шокесгвэншдс молекулярних форл нсспеїві-
Фичесюві аств'рвз, обозначешшх Bj. - % в порядке уменьшения элактро-
форетической тодатяостк.. Молекулярные Форш отличаются, по активнос
ти в отноиегета а-нафтиловых ефярови наиболее эффективна гидрсллауют
а-нафпшштат. Препарат ПТОХ к.-чвхчвля представлен 4-мя множэстаеи-
. иа»и молэкуляркшя формами неспэцифпч.зскнх эстэрзз. Активность фер
ментов такте укеньиаэтся при переходе от эфира уксуспой а офирам
пропионовой я масляной кяслот.
Эстеразкно фракции Ej, Eg, Eg, Eg ферментного препарата, ПСїу-ЧеіПЮГО При ГЛубЛШЮМ ВЫраЩИВШШ! A.voriena, ВДЄНТИЧШ фракциям Ej,
?2, Bg, E4 препарата тзердофазаой культура (га0л.4). Препараты бляз-кл по характеру распределения эстеразшх полос п отличаются только одной эстераэоп с nf=0,60, продуцируемой глубинной культурой.
; ; . . . ТАБЛИЦА 4.
Значения nf множественных молекулярных форм нестащфргасюих эстераз препаратов ГІ0Х и ШОХ a. varians
*' Сракциенированш ферментних; балков в полиакриламядном геле показало, что, несмотря ня сходную субстратную специфичность нзспаця-фаческих эстераз, эстеразшй комплекс д.уагішв совертеняо отличен
ОТ ЭСТЭраЗНОГО НОМШЙКСв A.carboriArlua. ' .