Введение к работе
Актуальность проблеми, ш такие польз у щие бактерии - группа метилотрофных микроорганизмов, способных ассимилировать только метан (в ряде случаев метанол), ШтаСолизм метана, как и других одноуглеродных соединений, включает ряд уникальных биохимических процессов, которые определяют 0йотехнологический потенциал мети-лотрофов. Их предполагают использовать в качестве продуцентов белка и других вєоієств (полисахаридов, аминокислот, витаминов) на основе дешевого органического сырья - метана или метанола. Цетилотрофы являются источником ряда уникальных ферментов, в связи с чем возможно применение их каталитической активности для переработки трудноатакуемых субстратов.
Протекающие в клетках метаниспользукщих бактерий реакции окислення метана до углекислоты и вовлечения углерода Сна уровне формальдегида) в конструктивный метаболизм изучены в настоящее время достаточно полно, В то же время, данные об энергетическом метаболизме этих бактерий практически отсутствуют,
Механизмы генерации энергии у метаниспользующих бактерий своеобразны и существенно отличаются от таковых, реализуемых при гетеротрофном типе питания. Трансформация энергии метана является тем звеном их метаболизма, которое определяет направленность остальных его этапов. Поэтому изучение энергетического метаболизма метаниспользукщих бактерий актуально как в теоретическом, так и в прикладном аспектах.
Цель и задачи „ исследования. Цель диссертационной работы -изучить пути трансформации энергии метана у метаниспольэующих бактерий, выяснить роль метанмонооксигеназы в энергетическом метаболизме и определить этапы окисления метана, сопряженные с генерацией энергии.
Список сокращений: ГАОР - гпдроксиламинокеидоредуктаза, ЩО -метанолдегидрогеназа, МШ - метанмонооксигеназа, мыШ - мембранная ЩО, НАЖФ) - никотинамидадениндинуклеотид(фосфат), ТО -
терминальная оксидаза, Т$4 - тетрафенклфосфонии, ФдДГ - фэр-мальдегкддегндрогеназа, ФтДТ - формиатдегидрогеназа, ФП - фла-вопротеид, ЭДТА - этилендиашнтетраацетат, ГССР - карбонилциа-нид-л-трифтормекжеифенидгидраэан, С1ССР - карбонилцианид-w-хлорфенилгадраэон, С НІ - восстановительные эквиваленты, PQQ -пирролохинолинхинон, лрН и д^ - разница рН и электрического заряда, соответственно, относительно цитоалазматическои мембраны.
ЦЕНТРАЛЬЙАЯ '
і ЛУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА ;*~к. сельскохоз академии п.!. К. А.Т^ивдзеэа, _
В работе решались следующие задачи:
определить восстановители, которые используются клетками в качестве доноров электронов для монооксигенирования метана;
научить сопряжение этапов окисления метана с генерированием энергии в Форме трансмембранного градиента протонов;
определить роль метаямонооксигеназы в качестве теминалыю-го акцептора основной части электронов метана;
построить стехиометрические модели метаболизма и на их основе количественно оценить возможность функционирования постулируемых механизмов генерации энергии у метаниспользукщих бактерий.
Научная новизна. На защиту выносятся следующие новые положения.
При моноокеигенировании субстрата в клетках метаяиспользующих бактерий электроны могут поступать не только от НАДН (источник - реакции дегидрирования формальдегида, и формиата), но и от доноров*е более полжительным редокс-потенциалом - простетических групп метанолдегидрогеназы и гилроксиламиноксидоредуктазы.
Генерация энергии в процессе окисления метана осуществляется за счет переноса электронов на кислород при функционировании не только цитохромоксидазы, но и мембранной иетанмонооксигеназы. Энергя в форме трансмембранного протонного градиента генерируется при переносе электронов через мембранные переносчики к мШЭ от НАШ либо от простетической группы метанолдегидрогенаэы. В последнем случае градиент рн создается за счет того, что протоны, освобождающиеся при окислении метанола, остается в периплазме клеток, где локализована метанолдегидрогеназа, а электроны транспортируются к цитоплазматической стороне мембраны, где акцептируются кислородом с потреблением протонов цитоплазмы при моноокеигенировании метана.
При фунционировании в клетках растворимой метанмонооксигеназы, которая прямо сопряжена с окислением НАДН, трансмембранный градиент протонов создается при переносе электронов от периплаз-матической метанолдегидрогеназы к цитохромоксидаэе.
Окисление метана клетками метанисподьэующих бактерий зависит от разницы потенциалов на цитоплазматической мембране, что предполагает возможность активного транспорта метана при его поступлении в клетку.
При росте метаниепользующих бактерий на метаноле часть этого
- з -субстрата окисляется метанмонооксигеназой, причем у некоторых видов монооксигенировакие метанолз является основним стоком электронов на кислород. Если монооксигенирование метанола не протекает (например, в присутствии ингибитора метанмонооксигена-вы - ацетилена), то рост воз^жен лишь тех видов, у которщ функционируют альтернативные энергогенерирущяе электронтранс-портные системы.
Совместная ассимиляция метаниспользущими бактериями метанола и субстратного аналога метана (этана или СО) реализуется благодаря сопряжению реакций дегидрирования метанола с монооксиге-нированием второго субстрата. Данное явление представляет собой вариант кометаболизма, результатом которого является более интенсивный и эффективный рост клеток, что позволило определить его как синтабодиэм.
Анализ результатов экспериментальных и теоретических исследований позволил сформулировать концепцию, которая отражает основную особенность энергетического метаболизма метаниспользующих бактерий: метанмонооксигеназа участвует в акцептировании большей части электронов ассимилируемого субстрата, причем в случае функционирования мЫШ этот процесс сопряжен о генерацией энергии в форме трансмембранного протонного градиента. Данная концепция позволяет объяснить ряд свойств метаниепользующих бактерий, которыми отличается эта группа микроорганизмов не только от гетеротрофных. Но и метилотрофных форм, не использующих метан. Так, отсутствие способности всех изучавшихся нами метанисполъзующих бактерий использовать в качестве источников углерода и энергии многоуглеродные субстраты, а также ингибирование ацетиленом (блокирует ННО) роста некоторых штаммов на метаноле обусловлено тем, что в этих условиях не функционирует метанмонооксигеназа.
Практическая ценность, Результаты работы позволят подойти к изучению принципов регуляции энергетического метаболизма метан-использующих Оактерий и его генетического контроля. Последний вопрос представляет большой интерес, поскольку метанмонооксигеназа является весьма перспективным ферментом для технологических целей (способна осуществлять реакции окисления к эпоксидирования трудноатакуемщ субстратов). Их реализация требует разработки способов клонирования метанмонооксигеназы и получения ее препарата.в больших масштабах.
Установленные еакономерности могут найти применение при
- 4 -создании и отладке технологии культивирования метаниепользующнх бактерий на природном газе. Применение принципа сиктаболизма позволяет избежать ингибироваяия роста при высоком содержании этана в природном газе, вызываемом соокислением метана и этана. Контроль процесса культивирования ацидотолерантных штаммов должен осуществляться с. учетом того факта, что окисление метана обеспечивает поддержание разницы рН между цитоплазмой и кислой средой. Поэтому в отсутствии метана или кислорода рН культураль-ной жидкости повышается за счет поступления протонов в клетки.
Представленные модели для расчета эффективности конструктивного и энергетического метаболизма построены в обцры виде, в связи с чем они применимы для прогнозирования механизмов генерации энергии у любых аэробных хемоорганотрофных организмов.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международном симпозиуме "Образование и использование газов микроорганизмами" (ФРГ, Геттинген, 1975);,VI Международном коллоквиуме ло почвенной зоологии "Почвенные организме как компоненты экосистем" (Швеция, Стокгольм, 1977); Республиканских конференциях молодых исследователей (Киев, 1977, 1981, 1986); III, IV к V Украинском биохимическом съезде (Донецк, 1977, Киев, 1982, Йвано-їранковск, 1987); VII Международном симпозиуме по непрерывному культивированию микроорганизмов (ЧСФР, Прага, 1978); III Европейском конгрессе по биотехнологии (ФРГ, Мюнхен, 1984); Всесоюзном симпозиуме 'Тегуляция биохимических процессов у микроорганизмов" (Пушно, 1978); Всесоюзном симпозиуме "Микробиологические сообщества и их функционирование в почве" (Чернигов, 1979); V, VI и VII съезде Украинского биохимического общества (Днепропетровск, 1980, Донецк, 1984, Черновцы, 1989); VI и VII съезде Всесоюзного микробиологического общества (Рига, 1980, Алма-Ата, 1985); V и VI Международном симпозиуме по росту микроорганизмов на С1-соединениях (Нидерланды, Гронинген, 1986, ФРГ, Геттинген, 1989); II и III Симпозиуме социалистических стран по биотехнологии (ГДР, Лейпциг, 1980, ЧСФР, Братислава, 1983);. III и VI Всесоюзной конференции "Теория и практика управляемого культивирования" (Киев, 1981, Иущино, 1986); Всесоюэном совещания "Использование, проектирование и строительство систем сооружений метанового сбраживания навоза (Таллин, 1982); Международном симпозиуме ФЕМО "Регуляция микробного метаболизма факторами внешней среды" (Пушино, 1983); Всесоюзной конференции "Термо-
- 5 -фильные микроорганизмы в природе и практике народного хозяйства" (Москва, 1883); Всесоюзной кс-'еренши "Новые направления в биотехнологии (Путино, 1984); XVII Конференции молодых ученых биологического факультета МГУ (Москва, 1986); Всесоюзной конференции "Биохимия и. физиология метилотрофов" (Цущино, 1986); Международном симпозиуме в честь 100-летия открытия литоавтотрофин С, а Виноградским (ФРГ, Геттинген, 1987); ite аду народном симпозиуме Интербиотех'89 (ЧСФР, Братислава, 1989); Международном кол-_ локвиуме по биохимии метмлотрофных бацилл (Нидерланды, Гронив-ген, 1989); На общем собрании отделения биохимии, физиологии и теоретической медицины АН УССР (Киев, 1990).
Публикация результатов исследований. Основные результати исследований отражены в 70 научных работах и двух авторских свидетельствах на изобретения.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 375 страницах (учетный текст - 225 страниц), включая 26 схем., 41 таблицу, 37 рисунков и библиографичекий указатель из 354 источников литературы (из них 297 на иностранных языках).